基于藥代動(dòng)力學(xué)法評(píng)價(jià)補(bǔ)骨脂提取工藝的研究

霍仕霞，凱賽爾·阿不都克熱木，高 莉，彭曉明，王宇卿，閆 明

(1.新疆維吾爾醫(yī)藥研究所，新疆烏魯木齊 830049;2.石河子大學(xué)藥學(xué)院，新疆 石河子 832000)

中藥藥代動(dòng)力學(xué)一直是新藥研究的熱點(diǎn)，以往對(duì)中藥有效成分研究，單純地從含量及藥效去評(píng)價(jià)一個(gè)工藝的好壞，而忽略了藥物在體內(nèi)吸收、分布的特點(diǎn)。本研究以治療白癜風(fēng)的中藥補(bǔ)骨脂為研究對(duì)象，經(jīng)過不同工藝處理，得到補(bǔ)骨脂常規(guī)粉末、超微粉末、半仿生提取物、水提取物，進(jìn)行了主要活性成分補(bǔ)骨脂素、異補(bǔ)骨脂素在大鼠體內(nèi)的藥代動(dòng)力學(xué)研究，建立了補(bǔ)骨脂素、異補(bǔ)骨脂素血藥濃度的HPLC分析方法，分別闡明了補(bǔ)骨脂不同工藝產(chǎn)物在大鼠體內(nèi)的代謝過程，比較藥代動(dòng)力學(xué)參數(shù)，以期揭示補(bǔ)骨脂藥效成分在大鼠體內(nèi)的變化規(guī)律，從藥代動(dòng)力學(xué)特征比較不同工藝的主成分吸收程度，優(yōu)選最佳的工藝，為臨床前研究提供參考，尋求一種科學(xué)簡(jiǎn)便的新的工藝評(píng)價(jià)方法。

1 實(shí)驗(yàn)材料

DHQ-A型多用混合器(江蘇泰縣醫(yī)療器械廠)，TGL-16B型離心機(jī)(上海安亭科學(xué)儀器廠)，BP211D十萬分之一電子天平(Sartorius)，超純水儀，Shimadzu LC-10AD VP泵，Shimadzu SPD-M10A VP二極管陣列檢測(cè)器，Shimadzu CTO-10A VP柱溫箱，Shimadzu CLASS VP 6.2S色譜工作站。補(bǔ)骨脂藥材(華康藥業(yè)提供，產(chǎn)地四川)，補(bǔ)骨脂素、異補(bǔ)骨脂素對(duì)照品購自中國藥品生物制品檢定所，批號(hào)分別為(1107397-200310;0738-200108)，甲醇(色譜純，美國Fisher公司)。健康Wistar大鼠，♂，體質(zhì)量(200±30)g，新疆醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供，動(dòng)物合格證號(hào):SCXY(新)2003-0001。

2 方法與結(jié)果

2.1補(bǔ)骨脂不同工藝產(chǎn)物制備

2.1.1常規(guī)粉末稱取干燥至恒重的140目補(bǔ)骨脂常規(guī)粉5.000 g，置25 ml量瓶中，邊攪拌邊加水，強(qiáng)力振搖，得0.2 g·ml－1(生藥)的補(bǔ)骨脂常規(guī)粉混懸液，含補(bǔ)骨脂素0.0191 g，異補(bǔ)骨脂素0.0164 g。

2.1.2超微粉末稱取干燥至恒重的300目補(bǔ)骨脂超微粉5.000 g，制備方法同上，得補(bǔ)骨脂超微粉混懸液，含補(bǔ)骨脂素0.0175 g，異補(bǔ)骨脂素0.0148 g。

2.1.3半仿生提取物稱取干燥至恒重的補(bǔ)骨脂半仿生提取物［1］干浸膏粉1.700 g，制備方法同上，得補(bǔ)骨脂半仿生提取物混懸液，含補(bǔ)骨脂素0.0236 mg，異補(bǔ)骨脂素0.0160 mg。2.1.4水提物稱取干燥至恒重的補(bǔ)骨脂半仿生提取物干浸膏粉1.615 g，制備方法同上，得補(bǔ)骨脂水提物混懸液，含補(bǔ)骨脂素0.0215 mg，異補(bǔ)骨脂素0.0148 mg。

2.2血漿樣品的制備

2.2.1動(dòng)物分組及準(zhǔn)備取健康wistar大鼠24只(♀♂各半)，隨機(jī)分組，每組6只，編號(hào)記錄體質(zhì)量。分別為補(bǔ)骨脂常規(guī)粉末組、超微粉組、半仿生提取物組、水提物組。

2.2.2灌胃給藥及血漿收集給藥前禁食12 h，自由飲水。大鼠稱重，按3g·kg－1(生藥)給對(duì)應(yīng)組大鼠灌胃相應(yīng)的藥液。分別在給藥前及給藥后 0.25、0.5、1、2、3、4、5、6、9、12、14、24 h于大鼠尾靜脈采血，低速離心，分離血漿。取各組各時(shí)間點(diǎn)血漿100 μl為待測(cè)樣品，置－20℃冰箱中冷凍備用［2］。

2.2.3血漿樣品處理取待測(cè)血漿樣品分別加入對(duì)照品溶液 200 μl，內(nèi)標(biāo)溶液 100 μl，渦漩混勻 10 min，高速離心(1 500 r·min－1)10 min，沉淀血漿中蛋白，取上清液即得血漿樣品供試液［3］。

2.3色譜條件及標(biāo)準(zhǔn)溶液的制備色譜條件見參考文獻(xiàn)［1］。

2.3.1標(biāo)準(zhǔn)品溶液制備精密稱取補(bǔ)骨脂素、異補(bǔ)骨脂素對(duì)照品4.26 mg、4.30 mg，分別置于10 ml棕量瓶中加甲醇溶解稀釋至刻度冷藏備用。

Tab 1 The pharmacokinetic parameters of psoralcn and isopsoralcn of different technics

2.3.2內(nèi)標(biāo)溶液的制備精密稱取7-甲氧基香豆素對(duì)照品1.46 mg置于100 ml棕量瓶中，加甲醇溶解定容。

2.4標(biāo)準(zhǔn)曲線的制備取3項(xiàng)下補(bǔ)骨脂素、異補(bǔ)骨脂素對(duì)照品溶液，逐級(jí)稀釋得補(bǔ)骨脂素、異補(bǔ)骨脂素混合標(biāo)準(zhǔn)系列溶液。取空白血漿8份，每份100 μl，分別加入上述對(duì)照品溶液200 μl，內(nèi)標(biāo)溶液 100 μl，按血樣處理方法處理血漿樣品，取上清液進(jìn)樣20 μl。按照選定的色譜條件分析，記錄色譜圖，分別計(jì)算補(bǔ)骨脂素、異補(bǔ)骨脂素與內(nèi)標(biāo)物質(zhì)的峰面積比值Y。建立回歸方程，得:補(bǔ)骨脂素:^Y1=1.898C－0.0598，r=0.9996;線性范圍:0.0341 ～1.7040 mg·L－1;異補(bǔ)骨脂素:^Y2=1.509C－0.0546，r=0.9995;線性范圍:0.0344 ～1.7200 mg·L－1。

2.5方法回收率與精密度［4］取空白血漿100 μl，分別加入200 μl混合標(biāo)準(zhǔn)溶液制備高、中、低3個(gè)不同濃度質(zhì)控樣品(所加入的標(biāo)液濃度分別為，補(bǔ)骨脂素:4.26、0.852、0.1704 mg·L－1，異補(bǔ)骨脂素:4.30、0.86、0.172 mg·L－1)。每個(gè)濃度各6份，分別取各樣品上清液20 μl進(jìn)樣測(cè)定。計(jì)算得補(bǔ)骨脂素平均方法回收率分別為104.94%、97.88%、99.30%，異補(bǔ)骨脂素分別為107.68%、94.38%、99.13%;測(cè)得3種濃度標(biāo)準(zhǔn)血漿補(bǔ)骨脂素的日內(nèi)RSD分別為1.51%、1.03%、0.50%(n=6)，日間 RSD分別為2.75%、2.26%、1.20%(n=6);異補(bǔ)骨脂素的日內(nèi) RSD分別為1.24%、1.17%、0.63%(n=6)，日間 RSD分別為3.97%、2.50%、1.55%(n=6)，表明該方法的準(zhǔn)確度與精密度良好。

2.6血樣的分析測(cè)定及藥動(dòng)學(xué)參數(shù)計(jì)算取各給藥組各時(shí)間點(diǎn)含藥血漿樣品100 μl，按樣品制備方法進(jìn)行處理，取上清液進(jìn)樣20 μl，記錄色譜圖。分別計(jì)算補(bǔ)骨脂素、異補(bǔ)骨脂素與內(nèi)標(biāo)物質(zhì)的峰面積比值Y，代入標(biāo)準(zhǔn)曲線求得補(bǔ)骨脂素和異補(bǔ)骨脂素的濃度。將各組不同時(shí)間點(diǎn)取血測(cè)得的血藥濃度－時(shí)間數(shù)據(jù)用DAS 2.0藥代動(dòng)力學(xué)分析軟件處理，得主要藥代動(dòng)力學(xué)參數(shù)。數(shù)據(jù)見Tab 1。血藥濃度－時(shí)間曲線見Fig 2，3，擬合的藥－時(shí)曲線符合po給藥二室模型。

3 討論

本實(shí)驗(yàn)建立了RP-HPLC法測(cè)定補(bǔ)骨脂中的補(bǔ)骨脂素、異補(bǔ)骨脂素在大鼠體內(nèi)血藥濃度測(cè)定方法，并進(jìn)行了藥代動(dòng)力學(xué)初步研究，以7-甲氧基香豆素作為內(nèi)標(biāo)準(zhǔn)物，減少系統(tǒng)誤差;試驗(yàn)中，選擇內(nèi)標(biāo)物質(zhì)時(shí)，比較了羥甲香豆素、歐前胡素、聯(lián)苯胺、7-甲氧基香豆素等物質(zhì)，其中羥甲香豆素、聯(lián)苯胺與含藥血漿中固有成分有干擾;歐前胡素出峰時(shí)間太長(zhǎng)造成分析周期過長(zhǎng)，綜合考慮采用與補(bǔ)骨脂素和異補(bǔ)骨脂素性質(zhì)類似的7-甲氧基香豆素作為內(nèi)標(biāo)物質(zhì)。

Fig 1 The HPLC chromatograms of reference substance，plasma with reference substance，blank plasm and pastille serum of drug

Fig 2 The drug-time curve of psoralen of different extracts

Fig 3 The drug-time curve of isopsoralen of different extracts8

不同工藝產(chǎn)物中的補(bǔ)骨脂素和異補(bǔ)骨脂素的藥代動(dòng)力學(xué)參數(shù)比較［5－6］，從MRT來看，常規(guī)粉末組＞超微粉組＞水提取物組＞半仿生組，而Tmax為常規(guī)粉末組＞水提取物組＞超微粉組＞半仿生提取物組，但異補(bǔ)骨脂素Tmax超微粉組＞水提取物組，表明常規(guī)粉末較超微粉末在在大鼠體內(nèi)滯留的時(shí)間長(zhǎng)，達(dá)峰時(shí)間也較長(zhǎng)，與其粉碎粒徑有很大的關(guān)系，其次，補(bǔ)骨脂經(jīng)提取后，能夠促進(jìn)補(bǔ)骨脂素、異補(bǔ)骨脂素的吸收，縮短達(dá)峰時(shí)間，更有利于有效成分的吸收和利用;從水提物和半仿生提取物測(cè)定結(jié)果來看，表明半仿生提取法更符合人體胃腸道吸收原理，模擬藥物口服后，經(jīng)過的酸性、中性、堿性環(huán)境，使其有效成分在提取的過程中，轉(zhuǎn)化成易吸收的形式存在。從AUC和Cmax結(jié)果比較，超微粉組＞常規(guī)粉末組＞半仿生提取物＞水提取物，表明超微粉組的生物利用度最好，Cmax也最大，在相同生藥量給藥的條件下，均優(yōu)于半仿生提取物組和水提取物組，含量測(cè)定表明超微粉中補(bǔ)骨脂素和異補(bǔ)骨脂素總量均小于其他組，可以得出，超微粉碎技術(shù)在實(shí)現(xiàn)藥材細(xì)胞級(jí)破壁微粉碎的同時(shí)，使其細(xì)胞內(nèi)的有效成分暴露出來，藥物的釋放速度及釋放量增加，大幅度提高了藥效成分的利用率;同時(shí)，藥材經(jīng)超微粉碎后，很多有助于被測(cè)成分吸收的成分也被釋放出來。綜上所述，從藥物在體內(nèi)的吸收利用程度考慮，利用藥代動(dòng)力學(xué)特征評(píng)價(jià)提取工藝的好壞，更能有利于優(yōu)選最佳提取工藝，本實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，藥材經(jīng)提取后，并沒有提高主成分的吸收率，可能是煎煮過程中，破壞了能夠促進(jìn)主成分吸收的成分;超微粉碎后的藥材粉末更有利于大鼠吸收，關(guān)于補(bǔ)骨脂不同工藝產(chǎn)物在大鼠體內(nèi)代謝情況將進(jìn)一步研究探討。

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