兩種黔產(chǎn)淫羊藿總黃酮對癡呆大鼠學(xué)習(xí)記憶的影響

鄧 煒，鄭民強(qiáng)，張 靜，黃 聰

(貴陽中醫(yī)學(xué)院藥理學(xué)教研室，貴州貴陽 550002)

淫羊藿總黃酮(TFE)是淫羊藿主要藥效成分，而淫羊藿苷(ICA)則是淫羊藿總黃酮中的主要藥效物質(zhì)基礎(chǔ)。黔產(chǎn)粗毛淫羊藿(Epimedium acuminatum)、黔嶺淫羊藿(E.leptorrhizum)為《貴州省中藥材、民族藥材質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)》收載，是淫羊藿常用中藥及民族藥。據(jù)研究貴州產(chǎn)多種淫羊藿的TFE、ICA含量均能達(dá)到或超過《中國藥典》標(biāo)準(zhǔn)，但黔嶺淫羊藿ICA含量卻很低，小于0.1%［1］，其藥理作用研究未見報(bào)道。據(jù)報(bào)道 TFE、ICA有益智，增強(qiáng)記憶作用［2－3］。本研究分別提取兩種 TFE，對 D 半乳糖(D-gal)-三氯化鋁(AlCl3)復(fù)合致記憶損傷模型大鼠進(jìn)行實(shí)驗(yàn)研究，以評價(jià)其藥用價(jià)值。

1 儀器與材料

1.1儀器Morris水迷宮系統(tǒng)(中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院藥物所);OLYMPUS BH-2光學(xué)顯微鏡(日本)。721B分光光度計(jì)(上海精密儀器儀表公司);

1.2試藥淫羊藿藥材分別采自貴州貴陽市烏當(dāng)區(qū)，貴州惠水縣，經(jīng)貴陽中醫(yī)學(xué)院何順志教授鑒定為粗毛淫羊藿Epimedium acuminatumFranch、黔嶺淫羊藿E.leptorrhizumStearn。D-gal(張家港華昌藥業(yè)有限公司，批號:20100228);AlCl3(天津市致遠(yuǎn)化學(xué)試劑有限公司，批號:20080418);銀杏葉片(桂林興達(dá)制藥廠，批號:091101);T-chE測試試劑盒(南京建成生物工程研究所，批號:201000114);免疫組化試劑盒 Bcl-2，克隆號:08C02;Bax，克隆號:09A01(武漢博士德生物工程有限公司);二抗，批號:PV6001;DAB顯色系統(tǒng)，批號:9032(北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司)。

1.3動(dòng)物SD♀大鼠，10月齡，體質(zhì)量(400±20)g，由貴陽醫(yī)學(xué)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供〔動(dòng)物許可證號:SCXK(黔)2002-001〕。

2 方法

2.1實(shí)驗(yàn)用藥制備兩種淫羊藿TFE提取，各取干燥淫羊藿莖葉1 kg，照文獻(xiàn)［4］方法提取，總黃酮提取物得率分別為3.43%和2.74%;經(jīng)UV法測定其TFE含量(以ICA計(jì))分別為38.4%和11.4%;分別用生理鹽水稀釋后供實(shí)驗(yàn)用藥。

2.2模型復(fù)制采用D-gal和AlCl3聯(lián)合誘發(fā)大鼠學(xué)習(xí)記憶障礙模型，除空白組給予生理鹽水，各組采用 ipD-gal 150 mg·(kg·d)－1和 ig AlCl310 mg·(kg·d)－1，連續(xù) 84 d。

2.3分組及給藥經(jīng)篩選合格的大鼠隨機(jī)分7組，每組10只，為空白組(A)、模型組(B)、銀杏葉片對照組 50 mg·kg－1(C)、粗毛淫羊藿 TEF 高、低(100、50 mg·kg－1)劑量組(D，E)、黔嶺淫羊藿 TEF高、低(100、50 mg·kg－1)劑量組(F，G)。各治療組于造模同時(shí)即按分組劑量ig給予TFE，每天1次，連續(xù)84 d。常規(guī)觀察動(dòng)物行為狀態(tài)，每周記錄1次體質(zhì)量。d 79開始進(jìn)行水迷宮試驗(yàn);d 85處死大鼠，進(jìn)行有關(guān)指標(biāo)檢測。

2.4行為學(xué)實(shí)驗(yàn)用Morris水迷宮實(shí)驗(yàn)判斷大鼠學(xué)習(xí)記憶和認(rèn)知能力，以定位航行、空間探索為指標(biāo)。記錄大鼠在120 s內(nèi)尋找到并爬上對側(cè)象限正中平臺(tái)所用時(shí)間，為逃避潛伏期;再撤除平臺(tái)，記錄大鼠在120s內(nèi)穿越平臺(tái)所在區(qū)域的次數(shù)，測試其空間探索記憶能力。逃避潛伏期測定，每天2次，測5 d;空間探索能力測試，每天2次，測1天，共6 d。

Tab 1 Effects of the two TFE on memory process in D-gal-AlCl3modeled rats(±s，n=8)

Tab 1 Effects of the two TFE on memory process in D-gal-AlCl3modeled rats(±s，n=8)

A:Control;B:Model:C:Yinxingyepian;D，E:the high，low dose Epimedium acuminatum TFE groups respectively;F，G:the high，low dose E.leptorrhizum TFE groups respectively.＊＊P ＜0.01 vs control(A)group;#P ＜0.05，##P ＜0.01 vs D-gal-AlCl3(B)group;▲▲P＜0.01 D vs F;◆◆P ＜0.01 E vs G

Group Dose/mg·kg－1 Escape latency/s d 2 d 3 d 4 d 5 Number of cross platform/Times A－63.74 ±13.69 48.63 ±8.65 43.46 ±10.78 30.41±7.88 5.69 ±1.16 B － 101.63 ±20.50＊＊ 78.35 ±11.79＊＊ 75.00 ±16.14＊＊ 58.28 ±19.01＊＊ 2.75 ±0.96＊＊C 50 73.12 ±26.12# 52.49 ±18.0## 48.28 ±12.83## 40.15 ±13.84# 4.43 ±1.57##D 100 79.90 ±15.44# 51.68 ±13.28## 38.82 ±19.36##▲▲ 37.57 ±11.87#▲▲ 4.94 ±1.29##E 50 69.25 ±37.26# 56.03 ±15.89## 43.63 ±13.70##◆◆ 38.89 ±15.16#◆◆ 4.31 ±1.56#F 100 86.13 ±29.66 60.51 ±17.35# 54.19 ±15.93# 52.12 ±19.04 3.69 ±1.44 G 50 87.01 ±30.75 68.64 ±12.77 67.58 ±14.42 60.69 ±17.20 3.50 ±1.81

2.5大鼠腦、血組織AChE測定實(shí)驗(yàn)結(jié)束斷頸取血，離心取血清，比色法測定血AChE活性;在冰盤中迅速取大鼠腦皮層組織，冰浴下切碎加預(yù)冷生理鹽水制成10%勻漿，3 000 r·min－1離心10 min，取上清液比色法檢測腦AChE活性。實(shí)驗(yàn)步驟嚴(yán)格按試劑盒說明書進(jìn)行。

2.6大鼠腦海馬免疫組化染色及結(jié)果判定大鼠處死，迅速取腦組織4%多聚甲醛固定。以Bcl-2/Bax為測定指標(biāo)。常規(guī)脫水、透明、封片，按要求進(jìn)行DAB顯色。隨機(jī)選取5個(gè)視野400倍鏡下觀察海馬神經(jīng)細(xì)胞，Bcl-2和Bax陽性為棕黃色顆粒，主要定位在細(xì)胞質(zhì)中。計(jì)數(shù)500個(gè)神經(jīng)細(xì)胞中陽性細(xì)胞數(shù)，取均值進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。

2.7統(tǒng)計(jì)學(xué)處理各組數(shù)據(jù)結(jié)果以±s表示，數(shù)據(jù)用 SPSS16.0分析處理，組間比較采用t檢驗(yàn);多組比較采用單因素方差分析。

3 結(jié)果

3.1兩種淫羊藿TFE對大鼠行為學(xué)影響Tab1結(jié)果見模型組逃避潛伏期明顯增加，跨越平臺(tái)次數(shù)明顯減少，與空白組比較P＜0.01。提示D-gal-AlCl3復(fù)合造模已形成大鼠空間記憶障礙。從測試d 2起，C、D、E組逃避潛伏期即有明顯降低，d 3以后其差別愈明顯，大鼠逃避潛伏期縮短，跨越平臺(tái)次數(shù)增加，粗毛淫羊藿各組與銀杏葉片組比較無明顯差別;與黔嶺淫羊藿比較，d 4以后逃避潛伏期出現(xiàn)明顯差異(P＜0.01)。

3.2兩種淫羊藿TFE對大鼠腦組織與血清的AChE活性的影響Tab 2顯示D-gal-AlCl3模型組大鼠血漿及腦組織中AChE升高非常明顯(P＜0.01)。TFE各組無論血漿及腦組織中AChE都有所降低，粗毛淫羊藿各組與銀杏葉片組降低AChE強(qiáng)度相似，比模型組差異有顯著性(P＜0.01);與黔嶺淫羊藿比較，粗毛淫羊藿無論高、低劑量組對SAChE的降低差異有顯著性(P＜0.01)。

Tab 2 Effects of the two TFE on brain and serum AChE activity in D-gal-AlCl3modeled rats(±s，n=8)

Tab 2 Effects of the two TFE on brain and serum AChE activity in D-gal-AlCl3modeled rats(±s，n=8)

A:Control;B:Model:C:Yinxingyepian;D，E:the high，low dose Epimedium acuminatum TFE groups respectively;F，G:the high，low dose E.leptorrhizum TFE groups respectively.＊＊P ＜0.01 vs control;#P ＜0.05，##P＜0.01 vs D-gal-AlCl3;▲▲P＜0.01 D vs F;◆◆P＜0.01 E vs G

Group Dose/mg·kg－1 Brain AChE activity/U·mg－1Pro Serum AChE activity/U·mg－1Pro A －1.12 ±0.13 32.02 ±1.51 B－1.48 ±0.14＊＊ 38.33 ±1.80＊＊C 50 1.31 ±0.10## 32.43 ±1.80##D 100 1.32 ±0.07## 32.89 ±1.33##▲▲E 50 1.34 ±0.09## 31.51 ±1.32##◆◆F 100 1.39 ±0.08# 36.99 ±1.53 G 50 1.45 ±0.11 36.30 ±1.47

3.3兩種淫羊藿TFE對大鼠海馬BAX與Bal-2蛋白表達(dá)的影響

3.3.1兩種淫羊藿TFE對大鼠海馬BAX蛋白表達(dá)

結(jié)果見Tab 3和Fig 1。結(jié)果顯示BAX蛋白在模型組(B)中表達(dá)(Fig 1中棕色顆粒)明顯高于其他各組(P＜0.01);各給藥組中銀杏葉片組(C)表達(dá)最低，粗毛淫羊藿TEF高(D)組其次，以后各組依次漸增高，兩兩比較(CvsD;DvsE;DvsF;FvsG)差異均有顯著性(P＜0.01)。

3.3.2兩種淫羊藿TFE對大鼠海馬組織Bal-2蛋白表達(dá)的影響Tab 3和Fig 2結(jié)果可見Bcl-2蛋白在C組和D組中高表達(dá)，明顯高于其他各組(P＜0.01);其他各組依次為C組＞D組＞E組＞F組＞G組，且兩兩比較差異均有顯著性(P＜0.01);但A組與G組比較差異無顯著性(P=0.321)。

Fig 1 Effects of two TFE on the protein expression of BAX in the hippocampus in modeled rats

Fig 2 Effects of two TFE on the protein expression of Bal-2 in the hippocampus in modeled rats

Tab 3 Differences between the two TFE on the hippocampus BAX and the protein expression of Bal-2(±s，n=5)

Tab 3 Differences between the two TFE on the hippocampus BAX and the protein expression of Bal-2(±s，n=5)

A:Control;B:Model:C:Yinxingyepian;D，E:the high，low dose Epimedium acuminatum TFE groups respectively;F，G:the high，low dose E.leptorrhizum TFE groups respectively.＊＊P ＜0.01 vs control(A);△△P＜0.01 vs B;##P＜0.01 vs C;☆☆P＜0.01 vs D;▲▲P＜0.01 vs E;$$P＜0.01 vs F

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4 討論

癡呆和腦老化動(dòng)物模型有多種方法可選，D-gal模型、三氯化鋁模型均是得到公認(rèn)并常用的方法，單因素造模只能模擬衰老諸多病理變化中一個(gè)側(cè)面，D-gal可使神經(jīng)元氧化損傷，變性壞死，出現(xiàn)衰老，學(xué)習(xí)記憶功能損害，在一定程度上模擬了AD認(rèn)知功能障礙的發(fā)病特點(diǎn)［5］。鋁可通過多種途徑在中樞沉積，甚至可通過乳汁、胎盤傳給子代［6］，鋁過負(fù)荷即可導(dǎo)致神經(jīng)元退變、海馬內(nèi)Aβ形成，神經(jīng)元纏結(jié)等AD特征性病理改變［7］，可造成學(xué)習(xí)記憶障礙。兩者聯(lián)用造模，勢必加速其衰老病理改變和進(jìn)程。本實(shí)驗(yàn)則選用10月齡大鼠并聯(lián)用D-gal-AlCl3，經(jīng)過3個(gè)月獲得大鼠空間記憶障礙模型。

黔產(chǎn)粗毛淫羊藿TFE各組大鼠在Morris水迷宮實(shí)驗(yàn)中表現(xiàn)記憶認(rèn)知能力明顯增強(qiáng)，AChE活性明顯下調(diào)，致使ACh含量增加，這可能是淫羊藿增強(qiáng)動(dòng)物學(xué)習(xí)記憶的藥效學(xué)基礎(chǔ)。神經(jīng)細(xì)胞凋亡是腦細(xì)胞丟失的一種形式，其機(jī)制與促凋亡基因和抗凋亡基因表達(dá)有關(guān)，Bcl-2/Bax是目前研究較明確的一對在功能上相互對立的凋亡調(diào)控基因，Bcl-2基因過度表達(dá)可特異性抑制細(xì)胞凋亡;而Bax基因表達(dá)則可對抗Bcl-2對細(xì)胞凋亡的抑制作用。Bcl-2/Bax的比率改變與神經(jīng)元凋亡密切相關(guān)［8］。本實(shí)驗(yàn)顯示D-gal-AlCl3大鼠模型組Bcl-2表達(dá)降低，Bax表達(dá)增強(qiáng)，Bcl-2/Bax表達(dá)比值呈負(fù)相關(guān)性，呈促進(jìn)細(xì)胞凋亡之勢，從B組圖片亦可見海馬神經(jīng)細(xì)胞的退行性改變及凋亡現(xiàn)象非常明顯。而2種淫羊藿TFE可上調(diào)D-gal-AlCl3誘導(dǎo)的Bcl-2表達(dá)，下調(diào)Bax表達(dá)，使Bc1-2/Bax比值逆轉(zhuǎn)，抑制細(xì)胞凋亡，揭示黔產(chǎn)淫羊藿TFE對海馬神經(jīng)元的保護(hù)作用。尤其是粗毛淫羊藿TFE改善D-gal-AlCl3大鼠記憶障礙，增加ACh，抗凋亡作用非常明顯，具有易化記憶、提高智力和減緩智力衰退作用，這可能與粗毛淫羊藿TFE中ICA含量較高有關(guān)。

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