HPLC測定山楂葉中牡荊素-4″-O-葡萄糖苷、牡荊素鼠李糖苷、牡荊素、蘆丁、金絲桃苷的含量

趙彩云， 王 強

(1.江蘇省徐州藥品檢驗所，江蘇徐州 221006;2.中國藥科大學，江蘇南京 210009)

山楂葉為薔薇科山楂屬植物山里紅(Crataegus pinnatifidaBge.var.majorN.E.Br.)或山楂(C.pinnatifidaBge.)的干燥葉［1］，收載于《中國藥典》2010年版一部。到目前為止，已經從山楂的葉中分離鑒定了50余種化學成分［2］，包括黃酮類、三萜類、原花青素類和有機酸類等?，F(xiàn)代藥理實驗表明，山楂葉具有降血脂、改善冠脈流量保護心肌、抑制血小板聚集和清除自由基、抗氧化等作用［3-6］，黃酮類化合物是山楂葉生理活性的主要成分包括牡荊素、牡荊素-4″-O-葡萄糖苷、牡荊素鼠李糖苷、蘆丁、槲皮素、金絲桃苷等。本實驗用HPLC法對山楂葉中黃酮類成分牡荊素鼠李糖苷、牡荊素-4″-O-葡萄糖苷、牡荊素、蘆丁、金絲桃苷進行了含量測定方法學的研究。結果表明該測定方法準確、靈敏、重現(xiàn)性好。

1 儀器與試藥

1.1 儀器

Waters高效液相色譜儀(Waters 2695泵、Waters 2996PDAD檢測器和Empower色譜工作站)，JL-360超聲波清洗器(上海杰理科技有限公司)，AE240電子天平(梅特勒-托利多儀器有限公司)。

1.2 試藥

對照品:牡荊素鼠李糖苷(111668-200401)、金絲桃苷(111521-200303)、蘆丁(100080-200306)、牡荊素(111687-200501)均購自中國藥品生物制品檢定所，牡荊素-4″-O-葡萄糖苷(中國藥科大學中藥分析教研室提供，純度為99%);山楂葉(來源見表1)，經王強教授鑒定為薔薇科植物山里紅Crataegus pinnatifidaBge.var.majorN.E.Br.的葉。

乙腈、四氫呋喃均為色譜純，水為重蒸水，其余試劑均為分析純。

2 方法與結果

表1 山楂葉藥材來源Tab.1 Habitats of Hawthorn leaves

2.1 色譜條件

色譜柱:Sepax HP C18柱(4.6 mm ×250 mm，5 μm);流動相:A 為乙腈-四氫呋喃(20∶1)，B 為0.5%甲酸溶液，采用梯度洗脫;0～10 min，A為14% ～17%;10～26 min，A 為17% ～18%;26～28 min，A為18% ～14%;檢測波長:360 nm，流速:1.0 mL/min;柱溫:32℃;進樣量:10 μL。混合對照品和供試品色譜圖見圖1。

2.2 對照品溶液的制備

精密稱取牡荊素-4″-O-葡萄糖苷、牡荊素鼠李糖苷、牡荊素、蘆丁、金絲桃苷對照品適量，加甲醇溶解配制成濃度分別為 0.662 0、0.997 0、0.042 3、0.097 3、0.095 4 mg/mL的混合溶液，作為對照品貯備液。精密吸取對照品貯備液3 mL置10 mL的量瓶中，加甲醇稀釋至刻度，作為混合對照品溶液。

2.3 供試品溶液的制備

取樣品粗粉約1.5 g，精密稱定，置具塞錐形瓶中，精密加入50%甲醇溶液25 mL，密塞，稱定重量，超聲處理(功率250 W，頻率50 kHz)30 min，放冷至室溫，再稱定重量，用50%甲醇補足減失的重量，搖勻，濾過，取續(xù)濾液，即得。

2.4 線性關系考察

圖1 混合對照品(A)和供試品溶液(B)色譜圖Fig.1 HPLC chromatograms of mixed referencesubstances(A)and sample solution(B)

精密吸取對照品貯備液0.5、1、2、3、4、5、6 mL置10 mL量瓶中，加甲醇稀釋至刻度。按上述色譜條件測定峰面積，以進樣濃度為橫坐標(X)，峰面積為縱坐標(Y)，進行線性回歸，得回歸方程分別為Y牡荊素-4″-O-葡萄糖苷=1.28 × 104X+7.91 × 104，r=0.999 6，Y牡荊素鼠李糖苷=1.24 ×106X+1.20 ×105，r=0.999 2，Y牡荊素=1.49 × 104X－ 3.03 × 103，r=0.999 8，Y蘆丁=1.68 × 105X－ 7.43 × 102，r=0.999 8，Y金絲桃苷=2.09 × 104X－ 7.05 × 103，r=0.999 9。結果表明:牡荊素-4″-O-葡萄糖苷在33.10～397.2 μg/mL范圍內，牡荊素鼠李糖苷在49.80～598.2 μg/mL 范圍內，牡荊素在 0.21 ～2.54 μg/mL范圍內;蘆丁在4.86～58.4 μg/mL范圍內;金絲桃苷在4.77～57.2 μg/mL范圍內呈良好的線性關系。

2.5 精密度試驗

精密吸取混合對照品溶液10 μL平行測定6次，測得牡荊素-4″-O-葡萄糖苷、牡荊素鼠李糖苷、牡荊素、蘆丁、金絲桃苷峰面積RSD分別為0.99%、0.73%、0.99% 、1.23% 、0.85% 。

2.6 穩(wěn)定性試驗

精密吸取同一供試品溶液分別于0、2、4、6、8、12 h進樣，測定峰面積，測得牡荊素-4″-O-葡萄糖苷、牡荊素鼠李糖苷、牡荊素、蘆丁、金絲桃苷峰面積RSD分別為 0.78%、0.88%、0.83%、0.65%、0.72%。表明供試品溶液在12 h內穩(wěn)定。

2.7 重復性試驗

精密稱取同一批樣品5份，分別按供試品溶液制備方法制備，測定樣品中各成分的含量，牡荊素-4″-O-葡萄糖苷、牡荊素鼠李糖苷、牡荊素、蘆丁、金絲桃苷含量RSD分別為0.86%、0.98%、0.76%、0.84%、1.23%。表明方法重現(xiàn)性較好。

2.8 加樣回收率測定

精密稱取已知各成分含量的供試品S1 0.75 g，精密加入一定量的牡荊素-4″-O-葡萄糖苷、牡荊素鼠李糖苷、牡荊素、蘆丁、金絲桃苷對照品，平行試驗5次，按2.3項下方法制備，測定相應峰面積，計算含量和回收率，結果:牡荊素-4″-O-葡萄糖苷、牡荊素鼠李糖苷、牡荊素、蘆丁、金絲桃苷平均加樣回收率分別為 99.59%、99.57%、98.70%、99.35%、99.28%;RSD分別為 0.50%、0.96%、1.10%、1.16%、0.88%。見表2～6。

表2 牡荊素-4″-O-葡萄糖苷回收率試驗結果Tab.2 Result of recovery test for vitexin 4″-O-glucoside

表3 牡荊素鼠李糖苷回收率試驗結果Tab.3 Result of recovery test for vitexin rhamnoside

表4 牡荊素回收率試驗結果Tab.4 Result of recovery test for vitexin

2.9 樣品測定

分別取不同采集地的山楂葉，按供試品溶液制備方法，平行制備3份，分別精密吸取混合對照品溶液及供試品溶液各10 μL，測定，按外標法計算含量，結果見表7。

表5 蘆丁回收率試驗結果Tab.5 Result of recovery test for rutin

表6 金絲桃苷回收率試驗結果Tab.6 Result of recovery test for hyperoside

3 討論

3.1 通過對5個對照品LC-PDAD紫外吸收波長的掃描可知，5 種成分分別在 350、335、360、335、360 nm處有最大吸收，考慮到5個組分要在一個色譜系統(tǒng)中同時檢出又要使樣品中各個成分有較大的響應值，且其他成分對其干擾較少，參閱有關文獻［1，7-9］，選擇360nm作為檢測波長，在該波長處5個組分均有較強吸收，干擾少，且分離效果良好。

3.2 曾試用甲醇-水、乙腈-水、乙腈-甲酸(乙酸)進行不同等度洗脫和梯度實驗，結果表明，在乙腈-甲酸的系統(tǒng)中加入四氫呋喃，既可以使相關峰達到有效分離，又可改善目標化合物的峰拖尾現(xiàn)象。因此選擇乙腈-四氫呋喃-甲酸作為流動相。

表7 樣品含量測定結果(n=3)Tab.7 Analytical results of samples

3.3 《中國藥典》2010年版一部收載了山楂葉，其質控指標成分為總黃酮及金絲桃苷。從結果可以看出金絲桃苷雖為主要活性成分之一，但含量非常低(藥典規(guī)定應不少于0.050%)。研究表明:牡荊素鼠李糖苷具有擴張血管、保護損傷的心肌組織等作用［10］，與山楂葉的功效作用相一致，因此，僅選擇金絲桃苷作為質控指標值得商榷，而牡荊素4″-O-葡萄糖苷、牡荊素鼠李糖苷為山楂葉中重要的藥理活性成分，含量較高，且為專屬性成分，更適宜作為山楂葉的質控指標。

［1］中國藥典［S］.一部.2010:30.

［2］陳四平，臧亞茹.山楂葉的研究進展［J］.承德醫(yī)學院學報，2003，20(2):164-165.

［3］張文潔，楊 英，張 輝.山楂葉提取物對高血脂大鼠的影響［J］. 遼寧中醫(yī)雜志，2008，35(2):307-308.

［4］葉希韻，張 隆，張 靜，等.山楂葉總黃酮對乳鼠心肌細胞