UPLC測定超聲提取冬凌草中冬凌草甲素的含量

趙 鵬， 余旭亞， 黃遵錫 ， 唐湘華， 李俊俊

(1.生物能源持續(xù)開發(fā)利用教育部工程研究中心，云南昆明 650092;2.云南師范大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，云南昆明 650092;3.昆明理工大學(xué)生命科學(xué)與技術(shù)學(xué)院，云南昆明 650224)

冬凌草學(xué)名碎米亞，是唇形科香茶菜屬植物Rabdosia rubescens(Hemsl.)Hara又稱Isodon rubescens(Hemsl.)C.Y.Wu et Hsuan。冬凌草甲素是冬凌草中主要活性成分，在體內(nèi)和體外均具有較強的抗腫瘤和抗菌活性［1-3］，其分析方法有比色法［4］、薄層掃描法［5］、HPLC［6］和 HPCE［7］等。其中比色法和薄層掃描法存在定量不準(zhǔn)確的缺點;HPCE法雖然快速、試劑用量少且柱不易受污染而優(yōu)于HPLC，但是進樣精度較HPLC低，存在重現(xiàn)性較差、線性范圍窄和靈敏度較低等缺陷。目前HPLC法是較為常用的冬凌草甲素的測定方法。本實驗采用UPLC測定冬凌草中冬凌草甲素含量，比常規(guī)HPLC省時9 min以上，是一種簡便、快捷、高效、準(zhǔn)確的檢測方法。

1 材料與方法

1.1 儀器和試劑

ACQUITY UPLC(美國 Waters公司)，ACQUITY UPLC PDA檢測器(美國Waters公司)，Empower 2色譜數(shù)據(jù)工作站(美國 Waters公司);超聲波提取器(Automatic Science，60W);冬凌草甲素對照品購自西安旭煌生物技術(shù)有限公司(批號090621);冬凌草全草藥材購自市場;乙腈(美國Fisher公司，色譜純);甲醇(AR);水為超純水。

1.2 色譜條件

Acquity UPLC BEH C18超高效色譜柱(50 mm×2.1 mm，1.7 μm);柱溫40℃;樣品室溫度8℃;檢測波長242 nm，進樣量為 1 μL。

表1 洗脫梯度

1.3 對照品貯備液的制備

準(zhǔn)確稱取冬凌草甲素對照品5.5 mg，甲醇溶解并定容到25 mL，制得0.22 mg/mL的冬凌草甲素對照品溶液。

1.4 樣品溶液的制備

取冬凌草全草藥材，粉碎過40目篩，精密稱取1 g，置具塞錐形瓶中，精密加入甲醇25 mL稱重，超聲處理40 min，放至室溫，稱重，用甲醇補至原重，過濾，取濾液2 mL，甲醇定容至10 mL，經(jīng)微孔濾膜(0.22 μm)濾過作為供試樣品溶液。

2 結(jié)果與討論

2.1 系統(tǒng)適用性試驗

樣品溶液及對照品溶液依次進樣，獲得色譜圖(見圖1)?？梢詮膱D中看出，冬凌草甲素與相鄰峰的分離度達到完全基線分離。

圖1 冬凌草甲素對照品(A)和冬凌草全草(B)UPLC圖

2.2 線性關(guān)系考察

精確吸取對照品溶液 0.1、0.2、0.4、0.6、1.0、2.0 μL 按文中1.2項下色譜條件分別進樣，以對照品溶液進樣量(μg)為橫坐標(biāo)(X)，峰面積積分值為縱坐標(biāo)(Y)，計算回歸方程為Y=3×106X+25246，r=0.999 7，冬凌草甲素進樣量在0.022～0.44 μg呈良好的線性關(guān)系。

2.3 樣品溶液穩(wěn)定性試驗

取冬凌草粗粉(樣品1)，按文中1.4項下制備樣品溶液，在0、2、4、6、8、12 h 按1.2 項下色譜條件分別進樣，記錄峰面積平均值為346 273，RSD 1.04%。結(jié)果表明供試品溶液在12 h內(nèi)穩(wěn)定性良好。

2.4 進樣精密度試驗

取冬凌草粗粉(樣品1，湖北金貴)，按1.4項下制備樣品溶液，按1.2項下色譜條件進樣5次，測得冬凌草甲素平均含量為6.662%，RSD 0.35%，表明進樣精密度較好。

2.5 重復(fù)性試驗

取冬凌草粗粉(樣品1)5份，按1.4項下方法制備，按1.2項下色譜條件分別進樣測定，測得平均含量為6.744%，RSD 1.93%，表明方法的精密度較好。

2.6 回收率試驗

分別精密吸取0.192 mg/mL的冬凌草甲素對照品溶液5份，每份2 mL，分別加入約1 g已知含量的冬凌草粗粉(樣品1)中。按1.4項下方法處理，按1.2項下色譜條件分別進樣，冬凌草甲素的平均回收率為97.3%，RSD 1.05%，結(jié)果見表2。

2.7 樣品測定

采用文中1.4項下方法，對多個不同來源的冬凌草樣品進行處理，用文中1.2項下色譜方法進行測定，記錄峰面積，計算冬凌草甲素的含量。見表3。

表2 冬凌草甲素回收率試驗結(jié)果(n=5)

表3 冬凌草全草藥材中冬凌草甲素含量測定結(jié)果(n=5)

3 結(jié)論

本實驗采用UPLC對冬凌草藥材中冬凌草甲素的含量進行測定，與常用的 HPLC測定方法［6，8-9］相比，在保持較高的準(zhǔn)確度和精密度的同時，提高了分析效率。甲素的保留時間從10 min以上縮短為1.361 min，出峰時間縮短了9 min以上，分析時間縮短至3 min以內(nèi)，在分析時間大幅縮短的同時，減少了溶劑的損耗和廢液的處理費用，節(jié)省了分析成本，為提高冬凌草的質(zhì)量控制及其新產(chǎn)品的開發(fā)利用提供了一種更為快速準(zhǔn)確測定方法。

［1］Kadota S，Basnet P，Ishii E，et al.Antibacterial activity of trichorabdal A from Rabdosia trichocarpa against Helicobacter pylori［J］.Zentralblatt Für Bakteriologie，1997，286(1):63-67.

［2］Chen S，Gao J，Halicka HD，et al.The cytostatic and cytotoxic effects of oridonin(Rubescenin)，a diterpenoid from Rabdosia rubescens，on tumor cells of different lineage［J］.Int J Oncol，2005，26(3):579-588.

［3］Liu J J，Huang R W，Lin D J，et al.Oridonin-induced apoptosis in leukemia K562 cells and its mechanism ［J］.Neoplasma，2005，52(3):225-230.

［4］趙清治，晁金華，王漢清.注射劑“癌得寧”中冬凌草甲素含量的紫外分光光度定量測定［J］.河南醫(yī)學(xué)院學(xué)報 醫(yī)學(xué)版，1981，16(2):351-354.

［5］袁 珂，胡潤淮.薄層掃描法測定冬凌草中冬凌草甲素的含量［J］. 中藥材，1997，20(5):242-243.

［6］袁 珂，呂潔麗，賈 安.超聲提取HPLC法測定冬凌草中冬凌草甲素［J］. 中草藥，2005，36(12):1823-1824.

［7］賈 欣，高 巖，杜 斌，等.HPCE法測定冬凌草片中冬凌草甲素的含量［J］. 鄭州大學(xué)學(xué)報，2006，41(1):156-157.

［8］冀春茹，馮衛(wèi)生，胡潤淮，等.HPLC法測定冬凌草萜含片中冬凌草甲素的含量［J］.中國現(xiàn)代應(yīng)用藥學(xué)雜志，1999，16(5):35-36.

［9］李可強，王 坤，張振秋.HPLC切換波長法同時測定冬凌草片中迷迭香酸和冬凌草甲素含量［J］.中成藥，2008，30(4):526-528.