HPLC法測(cè)定瑞香狼毒中香豆素類三種成分含量

胡 爽， 郭晏華

(遼寧中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)院，遼寧大連 116600)

瑞香狼毒為瑞香科植物瑞香狼毒Stellera chamejasmeL.的干燥根，又名斷腸草、紅狼毒、山蘿卜等。其味辛，性平，有一定毒性。入肺、脾、肝經(jīng)。具有逐水、破積、祛痰、殺蟲、止痛的功能［1］。廣泛分布于我國西北、西南、東北及河北等地，資源十分豐富［2］。其主要化學(xué)成分有黃酮類、香豆素類、二萜類、三萜類、木脂素類和苯丙烯酸醇苷類等［3-5］。其中香豆素類化合物是瑞香科植物的特征性成分，且大多具有較強(qiáng)生物活性，在瑞香狼毒根中的含量高達(dá) 0.355%［6］。目前，關(guān)于瑞香狼毒的文獻(xiàn)報(bào)道多是毒理、藥理和化學(xué)成分的研究［7-10］，有關(guān)于其含量測(cè)定方面的文獻(xiàn)報(bào)道較少。本實(shí)驗(yàn)同時(shí)測(cè)定了瑞香狼毒藥材中3種指標(biāo)性成分的含量，之前尚未見相關(guān)文獻(xiàn)報(bào)道，且該方法快捷、準(zhǔn)確，可作為瑞香狼毒藥材質(zhì)量控制的方法。

1 儀器與試藥

1.1 儀器 Agilent 1100型高效液相色譜儀，配置四元梯度泵、在線脫氣機(jī)、VWD檢測(cè)器;METTLER AB135-S十萬分之一電子天平(瑞士);SHIMADZU AY220型電子分析天平;U-3010型紫外-可見分光光度計(jì);HH-4數(shù)顯恒溫水浴鍋。

1.2 試藥 瑞香素對(duì)照品由成都普思生物科技有限公司提供，傘形花內(nèi)酯對(duì)照品(批號(hào):111739-200501)，東莨菪內(nèi)酯對(duì)照品(批號(hào):110768-200504)均購于中國藥品生物制品檢定所。本研究收集了10個(gè)不同來源的瑞香狼毒藥材，經(jīng)遼寧中醫(yī)藥大學(xué)王冰教授鑒定均為正品藥材。乙腈、甲醇為色譜純，水為重蒸餾水。其它試劑均為分析純。

2 方法與結(jié)果

2.1 色譜條件 色譜柱:AgiLent EcLipse XDB-C18(4.6 mm×150 mm，5 μm);流動(dòng)相:乙腈(A)-1%冰乙酸(B)，梯度洗脫;檢測(cè)波長:327 nm;流速:1.0 mL/min;柱溫:30℃;進(jìn)樣量:10 μL。見表 1。

表1 流動(dòng)相梯度洗脫程序

2.2 對(duì)照品溶液的制備 精密稱取瑞香素，傘形花內(nèi)酯，東莨菪內(nèi)酯對(duì)照品適量，分別置于10 mL棕色量瓶中加甲醇溶解，制得濃度分別為0.221 mg/mL、0.304 mg/mL、0.262 mg/mL的對(duì)照品貯備液，備用。精密吸取瑞香素對(duì)照品貯備液0.5 mL，傘形花內(nèi)酯對(duì)照品貯備液5 mL，東莨菪內(nèi)酯對(duì)照品貯備液0.3 mL置同一棕色10 mL量瓶中，加甲醇至刻度，搖勻，制得對(duì)照品混合液。

2.3 供試品溶液的制備 精密稱取瑞香狼毒藥材(過60目篩)約3.0 g，加入95%乙醇50 mL，加熱回流3次每次1 h，過濾，濃縮。用95%乙醇定容至10 mL的量瓶中，搖勻，經(jīng)0.45 μm微孔濾膜過濾，濾液作為供試品溶液，備用。

2.4 系統(tǒng)適用性試驗(yàn) 精密吸取混合對(duì)照品溶液、供試品溶液各10 μL，注入HPLC色譜儀，記錄色譜圖，在選定的色譜條件下瑞香素，傘形花內(nèi)酯和東莨菪內(nèi)酯的理論塔板數(shù)均不少于10 000，與其他峰的分離度均大于1.5。見圖1。

2.5 方法學(xué)考察

2.5.1 標(biāo)準(zhǔn)曲線的制備 精密吸取2.2項(xiàng)下的混合對(duì)照品溶液 2、4、6、10、15、20 μL 注入高效液相色譜儀，測(cè)定。以進(jìn)樣量為橫坐標(biāo)，峰面積為縱坐標(biāo)進(jìn)行線性回歸，得瑞香素回歸方程為:Y=143X－96.973，r=0.999 7;傘形花內(nèi)酯回歸方程為:Y=2 095X－1 235.3，r=0.999 6;東莨菪內(nèi)酯回歸方程為:Y=109.6X－89.44，r=0.999 6;結(jié)果表明，各對(duì)照品在各自的線性范圍內(nèi)呈良好的線性關(guān)系。

圖1 混合對(duì)照品(A)和樣品(B)HPLC譜圖

2.5.2 精密度試驗(yàn) 精密吸取同一供試品溶液(7號(hào)內(nèi)蒙古)連續(xù)進(jìn)樣6次，記錄色譜峰面積，結(jié)果瑞香素、傘形花內(nèi)酯和東莨菪內(nèi)酯峰面積的RSD值分別為0.4%、0.7%和0.3%。結(jié)果表明，本試驗(yàn)儀器的精密度良好。

2.5.3 穩(wěn)定性試驗(yàn) 精密吸取同一供試品溶液(7號(hào)內(nèi)蒙古)在 0、2、4、8、12、24 h 分別進(jìn)樣分析，記錄色譜峰面積，結(jié)果瑞香素，傘形花內(nèi)酯和東莨菪內(nèi)酯峰面積的RSD值分別為1.7%、1.8%和2.0%。結(jié)果表明，供試品溶液在室溫狀態(tài)下24 h內(nèi)穩(wěn)定。

2.5.4 重復(fù)性試驗(yàn) 取同一批瑞香狼毒藥材(7號(hào)內(nèi)蒙古)樣品6份，按2.3項(xiàng)方法制備供試品溶液，并進(jìn)樣分析，記錄色譜峰面積，結(jié)果瑞香素、傘形花內(nèi)酯和東莨菪內(nèi)酯峰面積的RSD值分別為2.3%、2.2%和2.1%。結(jié)果表明，本方法重復(fù)性較好。

2.5.5 回收率試驗(yàn) 取已知含量的藥材(7號(hào)內(nèi)蒙古)6份，每份約1.5 g(瑞香素含量0.034 4 mg/g，傘形花內(nèi)酯含量0.471 7 mg/g，東莨菪內(nèi)酯含量0.026 1 mg/g)精密稱定，置圓底燒瓶中，每份精密加入瑞香素對(duì)照品2.5 mL(濃度為0.022 1 mg/mL)、傘形花內(nèi)酯2.5 mL(濃度為0.304 mg/mL)和東莨菪內(nèi)酯1.6 mL(濃度為0.026 2 mg/mL)，按2.3項(xiàng)方法制備供試品溶液，測(cè)定，結(jié)果見表2～4。

2.6 瑞香狼毒藥材中瑞香素，傘形花內(nèi)酯和東莨菪內(nèi)酯的含量測(cè)定 取不同來源的瑞香狼毒藥材粉末(過60目篩)各約3.0 g，精密稱定，按2.3項(xiàng)下方法制備供試品溶液，精密吸取各溶液10 μL，按2.1項(xiàng)下色譜條件注入高效液相色譜儀進(jìn)行分析，記錄峰面積并計(jì)算瑞香素、傘形花內(nèi)酯和東莨菪內(nèi)酯的含量，結(jié)果見表5。

表2 瑞香素加樣回收試驗(yàn)結(jié)果(n=6)

表3 傘形花內(nèi)酯加樣回收試驗(yàn)結(jié)果(n=6)

表4 東莨菪內(nèi)酯加樣回收試驗(yàn)結(jié)果(n=6)

表5 樣品測(cè)定結(jié)果(n=3)

3 討論

3.1 從表5可以看出10個(gè)不同來源的瑞香狼毒藥材3種指標(biāo)性成分含量差別很大，其中傘形花內(nèi)酯的含量最高，從0.364 4～0.923 7 mg/g;東莨菪內(nèi)酯的含量次之，從0.012 0～0.034 6 mg/g;瑞香素的含量最低，從0.008 4～0.034 4 mg/g。根據(jù)文獻(xiàn)報(bào)道，瑞香素具有抗血栓、降脂、鎮(zhèn)痛、抗炎、提高免疫，抗菌等多種作用［11］。傘形花內(nèi)酯、東莨菪內(nèi)酯均具有抑菌，抗癌的作用。因此對(duì)瑞香狼毒中該3種成分進(jìn)行含量測(cè)定，對(duì)其質(zhì)量控制具有重要的意義。

3.2 檢測(cè)波長的選擇 根據(jù)紫外吸收光譜特征，瑞香素、傘形花內(nèi)酯皆在327 nm有最大吸收［12-13］，東莨菪內(nèi)酯在340 nm有最大吸收［14］。由于東莨菪內(nèi)酯在327 nm和347 nm的紫外吸收光譜圖差異較小，為兼顧3種成分在同一色譜圖上有最大吸收，最終選擇檢測(cè)波長為327 nm。

3.3 流動(dòng)相系統(tǒng)的選擇 分別以甲醇-水、乙腈-水、乙腈-1%冰乙酸和乙腈-0.05%磷酸溶液等不同濃度和比例的流動(dòng)相系統(tǒng)進(jìn)行梯度洗脫實(shí)驗(yàn)，通過比較不同流動(dòng)相系統(tǒng)的色譜圖，為使譜圖上待測(cè)成分的分離度較好，最終確定以乙腈(A)-1%冰乙酸(B)為流動(dòng)相進(jìn)行梯度洗脫。

3.4 提取條件的選擇 本實(shí)驗(yàn)通過單因素考察，比較了超聲提取法、加熱回流提取法和索氏提取法的提取效果，并同時(shí)比較了不同溶劑甲醇和乙醇的提取效果，并通過正交設(shè)計(jì)實(shí)驗(yàn)考察了提取時(shí)間、提取次數(shù)、醇濃度和溶劑用量對(duì)提取效果的影響。最終選定以95%乙醇、50 mL、加熱回流3次每次1 h提取效果最好。

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