茶葉中東莨菪素和東莨菪苷的測定及相關(guān)基因表達(dá)

曹紅利， 王浩乾， 何夢迪， 岳川，羅理勇， 曾亮， 郝心愿

1. 西南大學(xué) 食品科學(xué)學(xué)院，重慶 400715；2. 中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院茶葉研究所/農(nóng)業(yè)農(nóng)村部茶樹生物學(xué)與資源利用重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，杭州 310008

中國茶文化歷史悠久, 茶的消費(fèi)量僅次于純水, 與可可和咖啡并稱為世界三大無酒精飲料[1-2]． 兒茶素、 咖啡堿和茶氨酸等是茶葉富含的特征性次生代謝產(chǎn)物, 是茶葉色、 香、 味等品質(zhì)形成和飲茶保健功效發(fā)揮的物質(zhì)基礎(chǔ)[3]． 茶樹次生代謝豐富, 目前已知的代謝物數(shù)量多達(dá)1 450種[4]; 對茶樹次生代謝物的深入研究有助于茶葉功能性成分的開發(fā)和茶樹資源的多元化利用．

東莨菪素是香豆素類化合物, 植物中主要以糖苷(東莨菪苷)的形式存在, 已知具有的藥理活性包括抗腫瘤、 防治高尿酸血癥、 降血壓、 降血脂、 解痙、 縮瞳和降低眼壓、 鎮(zhèn)痛等[5]． 目前已知東莨菪素在丁公藤、 枸杞、 桑樹、 華山參、 白鶴藤等傳統(tǒng)中藥植物中有較高的含量[6-11]． 其中, 丁公藤是東莨菪素的重要天然來源, 也是丁公藤發(fā)揮鎮(zhèn)痛、 抗炎、 祛痰、 平喘等藥理作用的主要生化成分[12-14]． 在煙草屬的植物葉片中, 東莨菪素和東莨菪苷還可以起到植保素的作用, 直接參與抵抗腐生性病原真菌的侵染[15]． 茶樹是包括香豆素類化合物在內(nèi)的黃酮類物質(zhì)積累豐富的代表物種, 但是截至目前有關(guān)茶樹中東莨菪素及其糖苷的含量和檢測方法的研究還鮮有報(bào)道．

香豆素類化合物廣泛存在于植物中． 模式植物擬南芥中發(fā)現(xiàn)東莨菪素、 東莨菪苷等香豆素類化合物主要在根中合成, 但是不同擬南芥材料中的含量存在顯著差異[16]． 已知東莨菪苷合成途徑是類黃酮代謝途徑的上游分支, 主要由4-香豆?；o酶A經(jīng)香豆酸-3-羥化酶、 咖啡酰輔酶A-O-甲基轉(zhuǎn)移酶和阿魏酰輔酶A-6’-羥化酶等催化形成(圖1), 但其合成的準(zhǔn)確調(diào)控機(jī)制仍不清楚[17-18]． 低溫(10 ℃)條件下擬南芥的類黃酮代謝增強(qiáng), 而在BEE1(BRASSINOSTEROID ENHANCED EXPRESSION1)和GRF(G2-LIKE FLAVONOID REGULATOR)突變體中包括東莨菪苷在內(nèi)的香豆素類化合物合成顯著降低, 下游的花青素合成增強(qiáng)[18]． 因此BEE1和GRF基因可能是擬南芥中參與東莨菪苷生物合成的關(guān)鍵調(diào)控基因, 并受低溫影響． 倒春寒低溫條件下茶樹新梢差異基因表達(dá)譜分析表明, 東莨菪堿合成相關(guān)信號通路被顯著富集, 但茶樹中BEE1和GRF的同源基因的表達(dá)水平并無顯著差異[19]． 因此, 茶樹新梢中東莨菪苷的積累是否受低溫影響, 其積累代謝的主要影響因素和主要調(diào)控基因有待進(jìn)一步研究．

本研究建立了茶葉中東莨菪素和東莨菪苷的HPLC檢測方法, 分析了茶樹不同發(fā)育階段、 不同環(huán)境條件和不同品種/品系茶葉中東莨菪素和東莨菪苷的質(zhì)量分?jǐn)?shù), 檢測了茶樹東莨菪素和東莨菪苷生物合成途徑中相關(guān)基因的表達(dá)模式, 明確了東莨菪素和東莨菪苷積累的主要影響因素和相關(guān)基因的調(diào)控作用, 為茶葉中功能性成分的開發(fā)利用提供理論參考．

PAL: 苯丙氨酸解氨酶; C4H: 桂皮酸-4-羥化酶; C3H: 香豆酸-3-羥化酶; 4CL1: 對香豆酸輔酶A連接酶; CCoAOMT1: 咖啡酰輔酶A-O-甲基轉(zhuǎn)移酶; F6’H1: 阿魏酰輔酶A-6’-羥化酶．圖1 東莨菪苷的生物合成途徑

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料及處理

以種植于中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院茶葉研究所試驗(yàn)茶園的5年生“龍井43”盆栽茶樹為材料, 于春季萌動(dòng)期移入人工氣候室(24 h光周期: 13 h光照/11 h黑暗, 白天24 ℃/夜晚20 ℃, 濕度70%), 待新梢萌發(fā)至魚葉期、 一芽一葉期、 一芽二葉期和一芽三葉期時(shí)取新梢用于東莨菪堿、 東莨菪苷質(zhì)量分?jǐn)?shù)測定和基因表達(dá)分析; 以選種圃種植的3～5年生的20個(gè)茶樹品種/單株為材料, 統(tǒng)一采摘秋季頂端第2～3片成熟葉進(jìn)行東莨菪堿和東莨菪苷質(zhì)量分?jǐn)?shù)測定, 分析其在品種間的差異．

低溫脅迫試驗(yàn)以正常生長條件下的“龍井43”盆栽茶樹為材料, 分別在新梢萌發(fā)至魚葉期、 一芽一葉期、 一芽二葉期和一芽三葉期時(shí)給予低溫處理(24 h光周期: 13 h光照/11 h黑暗, 白天4 ℃/夜晚2 ℃, 濕度70%), 于處理后24 h, 48 h取新梢用于質(zhì)量分?jǐn)?shù)檢測． 茶尺蠖為害試驗(yàn)同樣以“龍井43”盆栽茶樹為材料, 于秋季茶樹停止生長前接種二齡茶尺蠖幼蟲, 每個(gè)處理枝條接種3頭, 于接種72 h后采集為害葉片． 所有樣品采集均設(shè)3個(gè)生物學(xué)重復(fù), 采集樣品立即投入液氮中冷凍, 在-80 ℃低溫條件下保存?zhèn)溆茫?/p>

1.2 東莨菪素與東莨菪苷質(zhì)量分?jǐn)?shù)檢測

1.2.1 色譜條件

利用ACQUITY UPLC系統(tǒng)(Waters, 美國)進(jìn)行檢測． 色譜條件1: X Bridge C18柱(250 mm×4.6 mm, 5 μm), 流動(dòng)相為甲醇(B)-0.1%甲酸水溶液(A)梯度洗脫; 洗脫程序?yàn)?～10 min, 15%～34% B; 10 ～ 20 min, 34% B; 20～35 min, 34%～38% B; 檢測波長345 nm, 流速1 mL/min, 柱溫25 ℃, 進(jìn)樣量10 μL． 色譜條件2: X Bridge C18柱(250 mm×4.6 mm, 5 μm), 流動(dòng)相為甲醇(B)-0.1%甲酸水溶液(A)梯度洗脫; 洗脫程序?yàn)?～5 min, 15%～25% B; 5～10 min, 25%～30% B; 10～15 min, 30%～33% B; 15～20 min, 33%～36% B; 20～25 min, 36%～40% B; 檢測波長345 nm, 流速1 mL/min, 柱溫25 ℃, 進(jìn)樣量10 μL．

1.2.2 標(biāo)準(zhǔn)溶液的配制及標(biāo)準(zhǔn)曲線制作

準(zhǔn)確稱取東莨菪苷(CAS: 531-44-2, PhytoLab)和東莨菪素(CAS: 92-61-5, PhytoLab)標(biāo)準(zhǔn)品2.000 mg分別置于10 mL離心管中, 加入4 mL色譜純甲醇超聲溶解, 配成500 μg/mL的標(biāo)準(zhǔn)品溶液． 取該標(biāo)準(zhǔn)品溶液, 用色譜純甲醇稀釋成為系列梯度濃度的溶液, 上機(jī)檢測, 根據(jù)峰面積大小和標(biāo)準(zhǔn)品濃度, 制作標(biāo)準(zhǔn)曲線．

1.2.3 樣品溶液的制備

將茶葉樣品置于冷凍干燥機(jī)48 h凍干后, 研磨成粉末, 準(zhǔn)確稱取樣品0.200 0 g于10 mL離心管中, 加入純甲醇5 mL, 室溫浸提4 h后, 4 000 r/min離心8 min, 用注射器吸取上清液過0.45 μm有機(jī)濾膜后收集于2 mL進(jìn)樣瓶中．

1.2.4 回收率試驗(yàn)

準(zhǔn)確稱取0.200 0 g樣品粉末于10 mL離心管中, 加入東莨菪苷50.0 μg和東莨菪素20.0 μg標(biāo)準(zhǔn)品, 按樣品溶液制備方法進(jìn)行浸提并收集于進(jìn)樣瓶中．

1.3 核酸提取及表達(dá)分析

1.3.1 總RNA的提取及cDNA的合成

茶樹總RNA按照多糖多酚植物總RNA提取試劑盒(CAT# DP441, 天根生化科技有限公司, 北京)的操作說明進(jìn)行提取, 用NanoDrop ND2000微量核酸蛋白測定儀測定RNA濃度, 用1%瓊脂糖凝膠電泳檢測總RNA質(zhì)量, RNA質(zhì)量檢測合格后, 參照PrimeScript?RT reagent Kit 反轉(zhuǎn)錄試劑盒(CAT# DRR037A, 寶生物工程有限公司, 大連)的說明書步驟, 將RNA反轉(zhuǎn)錄合成cDNA用于基因表達(dá)分析．

1.3.2 基因表達(dá)分析

從“龍井43”茶樹基因組中篩選出東莨菪苷的生物合成途徑中的關(guān)鍵酶編碼基因CsPAL1,CsPAL2,CsC4H,Cs4CL2-1,Cs4CL2-2,Cs4CL3和CsCCoAOMT1等[20], 根據(jù)基因cDNA序列的特異性, 利用Primer-Blast軟件設(shè)計(jì)目的基因的熒光定量PCR(qRT-PCR)引物(表1)． qRT-PCR反應(yīng)體系為: SYBR Mix(Roche, Basel, Switzerland)5.0 μL, cDNA 1.0 μL, 上下游引物(10 μmol/L)各0.5 μL, 超純水3 μL, 總體系10 μL; 充分混勻, 短暫離心后, 在LightCycler 480 Ⅱ?qū)崟r(shí)熒光定量PCR儀(羅氏, 美國)上進(jìn)行PCR 擴(kuò)增, 反應(yīng)程序?yàn)?5 ℃ 5 min, 95 ℃ 10 s, 56 ℃ 15 s, 12 ℃ 12 s, 45個(gè)循環(huán)后增加溶解曲線． 以茶樹基因CsPTB為內(nèi)參基因[21], 每個(gè)反應(yīng)3次生物學(xué)重復(fù), 2次技術(shù)重復(fù), 2-ΔCT或2-ΔΔCT法分析結(jié)果．

表1 茶樹東莨菪素和東莨菪堿合成相關(guān)基因?qū)崟r(shí)熒光定量引物

2 結(jié)果與分析

2.1 標(biāo)準(zhǔn)曲線及回收率

前人通過采用甲醇為提取溶劑, 分別用345 nm[11], 346 nm[22-23], 347 nm[24]等波長來測定一匹綢、 參杞等植物中的東莨菪素和東莨菪苷． 本研究通過全波長掃描顯示, 在茶樹中東莨菪素和東莨菪苷的最大紫外吸收波長為345 nm, 因此把345 nm作為本研究的測定波長． 將配制好的梯度濃度標(biāo)準(zhǔn)品溶液按色譜條件1進(jìn)樣, 分析色譜圖并記錄峰面積, 以峰面積為縱坐標(biāo)、 以對照品濃度為橫坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線, 計(jì)算2種標(biāo)準(zhǔn)品的線性回歸方程． 東莨菪素回歸方程為y=32 520.966 20x-21 613.773 82,r=0.999 8, 在0.5～64 μg/mL濃度范圍內(nèi)呈良好線性關(guān)系; 東莨菪苷回歸方程為y=17 984.273 65x-20 044.097 60,r=0.999 9, 在1～128 μg/mL濃度范圍內(nèi)呈良好線性關(guān)系．

將配制好的梯度濃度標(biāo)準(zhǔn)品溶液按色譜條件2進(jìn)樣, 分析色譜圖并記錄峰面積, 以峰面積為縱坐標(biāo)、 以對照品濃度為橫坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線, 計(jì)算2種對照品的線性回歸方程． 東莨菪素回歸方程為y=33 803.743 801x-17 723.041 828,r=0.999 821, 在0.5～ 64 μg/mL濃度范圍內(nèi)呈良好線性關(guān)系; 東莨菪苷回歸方程為y=18 669.680 731x-16 520.198 296,r=0.999 9, 在1～128 μg/mL濃度范圍內(nèi)呈良好線性關(guān)系．

東莨菪苷平均回收率為91.7%, RSD=3.32%(n=5); 東莨菪素平均回收率為93.5%, RSD=2.64%(n=5)． 該結(jié)果與已報(bào)道的檢測方法的效率基本一致, 表明2種色譜條件均具有較好的測定準(zhǔn)確度, 均能夠用于茶葉中東莨菪苷和東莨菪素的定量檢測(圖2)．

1為東莨菪苷; 2為東莨菪素．圖2 茶葉樣品的液相色譜

不同處理間小寫字母不同表示差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(p<0.05)．圖3 不同發(fā)育階段葉片中東莨菪素和東莨菪苷的質(zhì)量分?jǐn)?shù)

2.2 茶樹新梢中東莨菪素和東莨菪苷質(zhì)量分?jǐn)?shù)測定

通過比較2種色譜條件對茶樹新梢和成熟葉中東莨菪苷和東莨菪素的檢測效果, 發(fā)現(xiàn)利用色譜條件1對茶樹新梢進(jìn)行檢測得到的效果更理想, 而茶樹成熟葉檢測需對梯度洗脫條件進(jìn)行優(yōu)化, 宜采用色譜條件2進(jìn)行檢測． 本研究檢測了“龍井43”茶樹不同萌發(fā)階段新梢中的東莨菪苷和東莨菪素質(zhì)量分?jǐn)?shù)變化, 結(jié)果顯示, 在茶芽萌發(fā)不同階段的新梢中, 東莨菪素的質(zhì)量分?jǐn)?shù)顯著低于東莨菪苷的質(zhì)量分?jǐn)?shù), 且東莨菪素質(zhì)量分?jǐn)?shù)在不同階段新梢中的質(zhì)量分?jǐn)?shù)變化差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義, 從魚葉期到一芽三葉期的過程中, 東莨菪素的質(zhì)量分?jǐn)?shù)變化不明顯, 均維持在相同的水平; 而東莨菪苷的質(zhì)量分?jǐn)?shù)隨著新梢成熟度的增加其質(zhì)量分?jǐn)?shù)顯著升高, 在一芽二葉和一芽三葉期新梢中質(zhì)量分?jǐn)?shù)顯著高于魚葉期和一芽一葉期, 均達(dá)到200 μg/g以上(圖3)．

2.3 不同茶樹材料中東莨菪素和東莨菪苷的質(zhì)量分?jǐn)?shù)檢測

本研究選取包含中小葉種、 大葉種、 可可茶和葉色變異的茶樹品種或單株20個(gè)材料, 對這些材料中所含的東莨菪苷和東莨菪素的質(zhì)量分?jǐn)?shù)進(jìn)行檢測． 結(jié)果顯示, 不同茶樹材料中東莨菪苷和東莨菪素的質(zhì)量分?jǐn)?shù)差異較大, 東莨菪苷質(zhì)量分?jǐn)?shù)分布范圍為25.84～80.76 μg/g, 而東莨菪素質(zhì)量分?jǐn)?shù)分布范圍為18.34～50.88 μg/g(表2)．

表2 不同茶樹材料中東莨菪素和東莨菪苷的質(zhì)量分?jǐn)?shù)

報(bào)道顯示, 丁公藤中東莨菪素和東莨菪苷的質(zhì)量分?jǐn)?shù)范圍分別為80～380 μg/g和150 ～ 1 040 μg/g[24], 寧夏枸杞中東莨菪素和東莨菪苷的質(zhì)量分?jǐn)?shù)分別為27.5～57.3 μg/g和59.5～167.6 μg/g[10], 一匹綢中東莨菪素和東莨菪苷的質(zhì)量分?jǐn)?shù)分別為38～240 μg/g和140～1 460 μg/g[22], 白花蛇舌草中東莨菪素的質(zhì)量分?jǐn)?shù)為6.5～17.8 μg/g[25]． 可以看出茶葉中東莨菪素和東莨菪苷的質(zhì)量分?jǐn)?shù)較白花蛇舌草、 枸杞高或相當(dāng), 而低于一匹綢和丁公藤． 總體上茶葉中的東莨菪苷的質(zhì)量分?jǐn)?shù)高于東莨菪素, 在檢測材料中僅在大葉種的2017M-49單株中東莨菪素的質(zhì)量分?jǐn)?shù)高于東莨菪苷． 本研究還發(fā)現(xiàn)黃化變異單株CT2016-2的東莨菪苷和東莨菪素的質(zhì)量分?jǐn)?shù)均較低; 紫色變異品種紫鵑中二者的總質(zhì)量分?jǐn)?shù)最高, 且主要是以東莨菪苷的形式存在, 其質(zhì)量分?jǐn)?shù)是東莨菪素的3.7倍; 白化品種安吉白茶中具有較高質(zhì)量分?jǐn)?shù)的東莨菪苷和相對較低的冬莨菪素．

2.4 東莨菪素和東莨菪苷在低溫脅迫和茶尺蠖為害下的質(zhì)量分?jǐn)?shù)變化

為了探究生物與非生物脅迫是否對茶葉中東莨菪素和東莨菪苷質(zhì)量分?jǐn)?shù)有影響, 本研究分析了其在低溫和茶尺蠖為害條件下茶樹材料中的質(zhì)量分?jǐn)?shù)． 以茶樹春季萌發(fā)至魚葉、 一芽一葉、 一芽二葉和一芽三葉期的組織為材料, 分別進(jìn)行低溫脅迫處理, 并檢測處理48 h內(nèi)的物質(zhì)質(zhì)量分?jǐn)?shù)變化． 結(jié)果顯示, 在低溫脅迫下, 東莨菪素的質(zhì)量分?jǐn)?shù)在各個(gè)時(shí)期的材料中變化均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義; 在魚葉期低溫脅迫處理48 h時(shí), 東莨菪苷質(zhì)量分?jǐn)?shù)顯著降低, 而在一芽一葉、 一芽二葉和一芽三葉中的質(zhì)量分?jǐn)?shù)變化均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(圖4)． 在擬南芥中的研究表明, 東莨菪苷的生物合成受低溫影響[19], 這與本研究的結(jié)果不一致, 可能是由于物種間的差異以及茶葉中豐富的次生代謝物的影響． 茶尺蠖為害的樣品分析結(jié)果顯示, 茶葉在茶尺蠖為害后其體內(nèi)的東莨菪素和東莨菪苷質(zhì)量分?jǐn)?shù)變化無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(圖5)．

不同處理間小寫字母不同表示差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(p<0.05)．圖4 新梢中東莨菪素和東莨菪苷在低溫脅迫下質(zhì)量分?jǐn)?shù)的變化

不同處理間小寫字母不同表示差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(p<0.05)．圖5 東莨菪素和東莨菪苷在茶尺蠖為害葉片中的質(zhì)量分?jǐn)?shù)變化

2.5 東莨菪苷合成相關(guān)基因在不同發(fā)育階段新梢中的表達(dá)模式分析

茶葉中東莨菪苷和東莨菪素的質(zhì)量分?jǐn)?shù)與新梢發(fā)育程度密切相關(guān)． 本研究基于“龍井43”的基因組數(shù)據(jù), 篩選出茶葉中東莨菪苷生物合成通路中的關(guān)鍵基因CsPALs,CsC4H,Cs4CLs和CsCCoAOMT1等, 檢測這些基因在茶芽不同萌發(fā)階段新梢中的表達(dá)模式變化． 結(jié)果顯示, 這些基因在魚葉期新梢中的表達(dá)量相對較高, 隨著成熟度的增加,CsPAL1,Cs4CL2-2和Cs4CL3的表達(dá)量降低, 到一芽三葉期時(shí)如CsPAL2等基因的表達(dá)量也顯著降低, 而CsC4H,CsCCoAOMT1和Cs4CL2-1的表達(dá)在魚葉期到一芽三葉期中的變化無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(圖6)． 在新梢生長過程中, 整體上基因表達(dá)豐度與黃酮類生物合成高度相關(guān), 但在合成通路中的上游基因CsPALs,CsC4H和Cs4CLs的表達(dá)豐度與兒茶素和黃酮醇糖苷的積累量存在較低的相關(guān)關(guān)系[26]． 這可能是由于次生代謝物質(zhì)合成網(wǎng)絡(luò)復(fù)雜, 且下游產(chǎn)物合成底物可能來自多個(gè)代謝途徑, 導(dǎo)致上游基因表達(dá)水平與下游目標(biāo)代謝物質(zhì)量分?jǐn)?shù)的高低不存在顯著的相關(guān)關(guān)系．

不同處理間小寫字母不同表示差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(p<0.05)．圖6 東莨菪素和東莨菪苷合成相關(guān)基因在不同發(fā)育階段葉片中的表達(dá)

3 結(jié)論

本研究建立了基于高效液相色譜測定茶葉中東莨菪素和東莨菪苷的方法, 并利用該方法分析了茶樹不同發(fā)育時(shí)期新梢(魚葉期到一芽三葉期)、 茶尺蠖為害和低溫等逆境脅迫處理下東莨菪素和東莨菪苷的質(zhì)量分?jǐn)?shù)變化, 結(jié)果顯示茶葉中東莨菪苷的質(zhì)量分?jǐn)?shù)顯著高于東莨菪素, 且東莨菪苷隨著成熟度的增加而顯著累積, 東莨菪素和東莨菪苷的質(zhì)量分?jǐn)?shù)受低溫和茶尺蠖脅迫的影響較小． 對20個(gè)不同茶樹品種/單株中的東莨菪素和東莨菪苷的質(zhì)量分?jǐn)?shù)進(jìn)行檢測結(jié)果顯示, 不同茶樹材料間東莨菪素和東莨菪苷的質(zhì)量分?jǐn)?shù)差異較大, 茶葉中東莨菪素質(zhì)量分?jǐn)?shù)為18.34～50.88 μg/g, 東莨菪苷質(zhì)量分?jǐn)?shù)為25.84～80.76 μg/g, 與部分中藥材中的質(zhì)量分?jǐn)?shù)相近． 進(jìn)一步對東莨菪苷生物合成相關(guān)的基因表達(dá)模式進(jìn)行檢測結(jié)果表明, 合成通路上游基因的表達(dá)模式與東莨菪苷的積累模式間不存在顯著的相關(guān)關(guān)系． 總之, 由于茶葉中富含東莨菪素和東莨菪苷, 且具有重要的潛在保健功效, 能夠?yàn)椴枞~功能性成分開發(fā)和茶樹資源多元化利用提供重要參考．