HPLC法測定裸花紫珠片中毛蕊花糖苷及連翹酯苷的含量

陳德金， 祝晨蔯， 林朝展， 趙鐘祥， 張翠仙

(廣州中醫(yī)藥大學(xué)中藥學(xué)院，廣中尖峰天然產(chǎn)物共建實驗室，廣東廣州 510006)

裸花紫珠片為裸花紫珠Callicarpa nudifloraHook.et Arn;經(jīng)水提濃縮成膏后加輔料制成的薄膜衣片，具有消炎解毒、收斂止血之功效，用于治療呼吸道及消化道出血、細菌感染所引起的炎癥等［1］。現(xiàn)行中國藥品標準中，裸花紫珠片的質(zhì)量是通過FeCl3試液鑒別酚羥基及NaNO2和Al(NO)3溶液鑒別黃酮的化學(xué)顯色反應(yīng)來控制的，這種方法極易出現(xiàn)假陽性反應(yīng)，缺乏專屬性。近年來，有文獻［2］報道用分光光度法測定了裸花紫珠片中總黃酮的含量，但該法存在靈敏度低、干擾因素多、專屬性較差等問題，不利于對該產(chǎn)品進行全面和有效的質(zhì)量控制。紫珠屬化學(xué)成分研究表明［3-7］，苯乙醇苷類成分是該屬植物的主要成分類群之一，本課題組自裸花紫珠甲醇提取物的正丁醇萃取部位中分離得到6個苯乙醇苷類化合物，其中以毛蕊花糖苷及連翹酯苷含量最高?，F(xiàn)代藥理研究表明［8-10］，毛蕊花糖苷和連翹酯苷具有抗血栓、降血脂、抗氧化和調(diào)節(jié)非特異性免疫反應(yīng)等多方面的作用。為有效地控制裸花紫珠片的內(nèi)在質(zhì)量，本實驗采用HPLC法對裸花紫珠片中的毛蕊花糖苷及連翹酯苷的含量進行測定，以期為該成藥的質(zhì)量標準再提高提供理論依據(jù)。

1 儀器和試藥

1.1 儀器 大連伊利特P230型液相色譜儀、EC2000色譜工作站;sartorius電子分析天平(北京賽多利斯儀器系統(tǒng)有限公司)。

1.2 試藥 毛蕊花糖苷及連翹酯苷對照品為自制，經(jīng)歸一化法檢測，純度在98%以上;裸花紫珠片為市售品(海南九芝堂藥業(yè)有限公司，批號:801530、801580、900850);D101型大孔吸附樹脂(天津南開大學(xué)化工廠);液相所用甲醇為色譜純，水為超純水，其余所用試劑均為分析純。

2 方法與結(jié)果

2.1 色譜條件 色譜柱:Kromasil C18(4.6 mm×250 mm，5 μm);流動相:甲醇-0.1% 醋酸水溶液(40:60);流速:1.0 mL/min;檢測波長:334 nm;進樣量:10 μL;理論塔板數(shù)按毛蕊花糖苷計算應(yīng)不低于10 000，按連翹酯苷計算應(yīng)不低于8 000;毛蕊花糖苷及連翹酯苷的保留時間分別為11.45 min和9.14 min，與其他組分分離良好。對照品和供試品的色譜圖見圖1。

2.2 供試品溶液的制備 取本品5片，除去糖衣，研細，取約0.25 g，精密稱定，置圓底燒瓶中，加蒸餾水40 mL，加熱煎煮1 h，濾過，用適量蒸餾水洗滌燒瓶，洗液一并過濾，濾液置分液漏斗中，用適量蒸餾水洗滌濾器，洗液并入分液漏斗，依次用3倍量、2倍量、2倍量的水飽和正丁醇連續(xù)萃取3次，每次靜置至分層明顯，合并正丁醇液，蒸干，殘渣用2～3 mL蒸餾水溶解，加于大孔樹脂柱(5 g，20 mm×150 mm，濕法裝柱)，先用100 mL蒸餾水洗脫，棄去水液，再用300 mL 50%甲醇-水洗脫，收集洗液，蒸干，殘渣加適量甲醇溶解并定容至10 mL，搖勻，用微孔濾膜(0.45 μm)濾過，取續(xù)濾液作為供試品溶液。

圖1 毛蕊花糖苷及連翹酯苷對照品(A)與供試品溶液(B)的高效液相色譜圖Fig.1 Chromatograms of control solution(A)and sample solution(B)

2.3 線性關(guān)系考察 精密稱取對照品毛蕊花糖苷0.004 8 g、連翹酯苷0.005 4 g，置同一10 mL量瓶中，加甲醇至刻度，搖勻，得混合對照品溶液。分別精密吸取混合對照品溶液 1、2、4、8、10、15、20 μL，依選定的色譜條件進樣測定，以峰面積(Y)對進樣量(X)進行線性回歸，回歸方程分別為:毛蕊花糖苷Y=1 233.6X－401.06，r=0.999 4，線性范圍0.48～9.6 μg;連翹酯苷Y=702.22X－ 208.82，r=0.999 7，線性范圍0.54 ～10.80 μg。

2.4 最低檢測限 在上述色譜條件下，按信噪比大于10/3時，對最低檢出限進行測定，結(jié)果表明毛蕊花糖苷與連翹酯苷的最低檢測限分別為0.96 ng、1.08 ng。

2.5 精密度試驗 精密吸取同一供試品溶液10 μL，依法連續(xù)進樣5次，測定峰面積積分值，結(jié)果毛蕊花糖苷平均峰面積為6 569.58，RSD為1.29%;連翹酯苷的平均峰面積為3 851.23，RSD為0.66%，表明儀器精密度良好。

2.6 重復(fù)性試驗 取同一批號的供試品，照2.2項下平行制備5份，依法測定，結(jié)果毛蕊花糖苷的平均含量為11.9 mg/片，RSD為2.44%;連翹酯苷的平均含量為10.3 mg/片，RSD為1.38%，表明分析方法的重現(xiàn)性良好。

2.7 穩(wěn)定性試驗 分別于0、1、2、4、8、12 h精密吸取同一供試品溶液10 μL，進樣測定，結(jié)果毛蕊花糖苷12 h內(nèi)的平均峰面積為6 560.30，RSD為1.21%;連翹酯苷的平均峰面積為3 826.56，RSD為1.69%，表明供試品溶液在室溫下12 h內(nèi)穩(wěn)定性良好。

2.8 加樣回收試驗 精密稱取已知含量的供試品6份，分別精密加入一定量的毛蕊花糖苷及連翹酯苷對照品，照2.2項下制備回收率試驗液，依法測定，并計算回收率，結(jié)果見表1、表2。

表1 毛蕊花糖苷回收率試驗結(jié)果(n=6)Table 1 The recovery test of verbascoside

表2 連翹酯苷回收率試驗結(jié)果(n=6)Table 2 The recovery test of forsythiaside

2.9 樣品測定 取3批樣品，照2.2項下制備供試品溶液，依法進樣測定，結(jié)果見表3。

表3 樣品測定結(jié)果(n=3)Table 3 The results of content assay for forsythiaside and verbascoside in Luohua Zizhu Tablets

3 討論

有關(guān)裸花紫珠片的質(zhì)量分析，僅有對其中總黃酮的含量測定，有關(guān)苯乙醇苷類成分的研究尚未有研究報道。根據(jù)文獻［11-12］報道，筆者嘗試以熊果酸及齊墩果酸為指標控制產(chǎn)品質(zhì)量，但供試品溶液中無法檢測出這兩個成分，提示萜類化合物在本品中的含量極低。這可能是由于本品的水提制備工藝無法提出熊果酸等低極性成分造成的。然而，從本實驗室對裸花紫珠、廣東紫珠、枇杷葉紫珠、全緣葉紫珠等多種紫珠屬植物的研究中發(fā)現(xiàn)，毛蕊花糖苷及連翹酯苷等苯乙醇苷類化合物作為止血、抗炎、抗氧化的有效成分廣泛存在于紫珠屬植物中。因此，同時對毛蕊花糖苷及連翹酯苷這兩個指標進行測定，建立以苯乙醇苷類為裸花紫珠片的質(zhì)量控制體系，更能真實客觀地反映其內(nèi)在質(zhì)量。

通過對毛蕊花糖苷及連翹酯苷的紫外全波長掃描，可知兩個對照品的紫外最大吸收均在334 nm。因此，本實驗采用334 nm作為毛蕊花糖苷及連翹酯苷的檢測波長，以保證兩個化合物在HPLC中有較高的響應(yīng)值及靈敏度。

本品水煎液成分復(fù)雜，分別用乙酸乙酯與正丁醇萃取后有交叉，不利于毛蕊花糖苷及連翹酯苷含量的準確測定，因而選用正丁醇直接萃取。試驗亦對水飽和正丁醇萃取次數(shù)及用量進行了探討，結(jié)果發(fā)現(xiàn)3倍量、2倍量、2倍量水飽和正丁醇連續(xù)萃取3次便能對毛蕊花糖苷及連翹酯苷萃取完全。

為降低測定時雜質(zhì)峰的干擾，試驗選用大孔樹脂對毛蕊花糖苷及連翹酯苷進行富集純化［13］。上柱采用的是20 mm×150 mm規(guī)格的小柱，大孔樹脂用量少(約5 g)，可以多次再生重復(fù)使用，有效節(jié)約了資源。同時也對大孔樹脂上樣量進行了考察，結(jié)果發(fā)現(xiàn)0.25 g樣品粉末較為合適，0.5 g時已開始出現(xiàn)超載現(xiàn)象。大孔樹脂上樣后，先用蒸餾水洗脫，洗脫液每10 mL一瓶，采用硫酸苯酚法［14-16］測定了其中多糖的含量，結(jié)果多糖主要集中在前50 mL洗液中，100 mL蒸餾水已基本將多糖洗脫完全。另外，還采用梯度洗脫的方法對洗脫液進行了探討，結(jié)果30%甲醇水溶液未能洗下毛蕊花糖苷及連翹酯苷，而300 mL50%甲醇水溶液便可將其洗脫完全。

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