冬凌草茶中多糖、總黃酮及冬凌草甲素浸出特性研究

戴 一，宋祖榮，李 靜

（安徽新華學(xué)院藥學(xué)院，安徽，合肥 230088）

冬凌草為植物碎米椏（Rabdosia rubescens(Hemls.) Hara）的干燥地上部分，主產(chǎn)于河南、湖北、安徽等多個(gè)地區(qū)，濟(jì)源當(dāng)?shù)孛耖g用其煮茶飲用治療咽喉腫痛，現(xiàn)市場上冬凌草作為茶銷售深受人民歡迎。冬凌草味甘苦，性微寒，具有清熱解毒，活血止痛之功效[1]，主要含有冬凌草甲素、冬凌草乙素等對映貝殼杉烷型二萜及黃酮、多糖等成分[2-3]?，F(xiàn)代藥理表明黃酮成分多具有抗衰老、保護(hù)心血管等作用[4]，多糖多具有免疫調(diào)節(jié)[5]，冬凌草甲素具有抗癌[6-7]、抗炎[8]等多種藥理活性。然而冬凌草作為茶研究并不深入，目前尚未見其茶中成分定量研究及泡茶條件的探索。為了揭示冬凌草茶保健作用的物質(zhì)基礎(chǔ)，本實(shí)驗(yàn)選擇對冬凌草茶中的多糖、總黃酮及冬凌草甲素進(jìn)行了定量分析，并探討了冬凌草茶的較佳浸泡溫度，為科學(xué)開發(fā)和合理使用冬凌草茶提供可靠的實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

1 材料

1.1 藥物與試劑

冬凌草（購置于亳州藥材市場，產(chǎn)地湖北，經(jīng)安徽新華學(xué)院慶兆老師鑒定為冬凌草 Rabdosia rubescens(Hemls.) Hara）。冬凌草甲素（上海融禾醫(yī)藥科技有限公司，批號：140109），蘆丁對照品（天津一方科技有限公司），甲醇為色譜純，其他試劑均為分析純。

1.2 儀器

安捷倫 1260高效液相色譜儀（美國安捷倫科技公司）；梅特勒-托利多AB135-S電子分析天平（梅特勒-托利多國際股份有限公司）；FA2004型電子天平（上海民橋精密科學(xué)儀器有限公司），8510E-DTH超聲提取器（美國必能信公司），DZF-6020型真空干燥箱（上海三發(fā)科學(xué)儀器有限公司）。

2 實(shí)驗(yàn)方法

2.1 冬凌草茶的制備

精密稱取冬凌草5.00 g，6份，加20倍量水，于圓底燒瓶中分別用100、90、80、70、60、50 ℃浸泡1 h，浸泡結(jié)束定容至100 mL，浸提液4000 r/min離心10 min，得冬凌草茶備用；另取冬凌草5.00 g，20倍量水室溫超聲1 h，同上離心后制備茶液作為對照。

2.2 冬凌草茶中多糖的含量測定

2.2.1 5%苯酚液的制備

稱取苯酚100 g，加鋁條0.1 g，碳酸氫鈉0.2 g，蒸餾，收集182 ℃餾份，稱定5 g，置于100 mL棕色溶量瓶中，加少量水溶解后，定容，充分混勻，冷藏，備用。

2.2.2 冬凌草茶多糖供試液的制備

精密量取各冬凌草茶7 mL，加3 mL氯仿-正丁醇(4:1)的Sevag試液，超聲15 min，4000 r/min離心l0 min，去除下層氯仿及中層變性蛋白，取上部水層反復(fù)操作3次，至無明顯中層。收集去蛋白后的上部水層5 mL，加無水乙醇至醇濃度為80%，靜置過夜，4000 r/min 離心l0 min，沉淀加水溶解定容于25 mL溶量瓶中，即得冬凌草茶多糖供試液。

2.2.3 葡萄糖對照品溶液的配制及標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制

精密稱取葡萄糖對照品 27.5 mg，加水溶解并定容至100 mL容量瓶中，得濃度為0.275 mg/mL 的對照品溶液。精密吸取葡萄糖對照品溶液0、0.1、0.2、0.3、0.4、0.5、0.6、0.7 mL，分別置10 mL干燥容量瓶中，加水至1 mL，另取水1 mL作為空白對照。分別加入5 %苯酚溶液2.0 mL，搖勻，然后緩慢加濃硫酸7.0 mL，搖勻，置沸水浴中加熱20 min，于490 nm測定吸光度[9]。

2.4.4 冬凌草茶多糖供試液測定

精密吸取1 mL冬凌草茶多糖供試液置10 mL容量瓶，另取水做對照，分別加入 5 %苯酚溶液2.0 mL，搖勻，然后緩慢加濃硫酸7.0 mL，搖勻，置沸水浴中加熱20 min，在490 nm處，測定吸光度，計(jì)算冬凌草茶中多糖浸出率，即每100 g冬凌草在相應(yīng)條件下浸出的多糖量(g)。

2.3 冬凌草茶中總黃酮的含量測定

2.3.1 蘆丁對照品溶液制備與標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制

精密稱取干燥至恒重的蘆丁對照品10.0 mg 置于25 mL 量瓶中，加入甲醇，超聲使完全溶解，用甲醇定容至刻度，搖勻，即得0.400 mg/mL 的對照品溶液，置冰箱中備用。精密吸取0.4 mg/mL的對照品溶液0、1. 0、2. 0、3.0、4. 0、5. 0、6. 0 mL 分別置于25 mL 的量瓶中，各加水至6 mL，加5%亞硝酸鈉溶液1. 0 mL，搖勻，放置6 min；加10% 硝酸鋁溶液1.0 mL，搖勻，放置6 min；加4%氫氧化鈉溶液10.0 mL，搖勻，再加蒸餾水定容至刻度，搖勻，放置10 min，以甲醇溶液為空白對照在500 nm波長處測定吸光度[10]。

2.3.2 冬凌草茶總黃酮測定

精密量取冬凌草茶1 mL，加5% 亞硝酸鈉溶液1 mL，使混勻，放置6 min，加10% 硝酸鋁溶液1 mL，搖勻，放置6 min，加4%氫氧化鈉試液10 mL，蒸餾水定容至25 mL，搖勻，放置10 min，在500 nm 波長處測定吸收度，計(jì)算每100 g冬凌草在相應(yīng)條件下浸出的總黃酮量(g)。

2.4 冬凌草茶中冬凌草甲素含量測定

2.4.1 色譜條件

Agilent HC-Cl8柱(250 mm×4.6 mm, 5 μm)，檢測波長238 nm， 流速1.0 mL/min， 柱溫25 ℃，流動(dòng)相甲醇-水( 49:51)[11]，進(jìn)樣量：20 μL。

2.4.2 對照品溶液制備

精密稱取冬凌草甲素5 mg ，置于10 mL 量瓶中，用甲醇溶解并定容至刻度備用。

2.4.3 冬凌草茶供試液制備

量取冬凌草茶10 mL，以0.45 μm微孔濾膜過濾，即得供試液。

2.4.4 線性關(guān)系考察

精密吸取冬凌草甲素對照品溶液0.1、0.2、0.3、0.4、0.5 mL以甲醇定容至10 mL，搖勻，吸取對照品溶液20 μL進(jìn)樣分析，以濃度（C）對峰面積（A）繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。

2.4.5 精密度實(shí)驗(yàn)

取同一質(zhì)量濃度的冬凌草甲素對照品溶液，重復(fù)進(jìn)樣6次，測定峰面積，計(jì)算峰面積的RSD。

2.4.6 重復(fù)性實(shí)驗(yàn)

精密稱取冬凌草粉末5.00 g，共6份，按2.4.3節(jié)方法制備供試品溶液后按 2.4.1節(jié)條件下進(jìn)行測定，計(jì)算冬凌草中冬凌草甲素浸出率的RSD。

2.4.7 穩(wěn)定性實(shí)驗(yàn)

同一供試品溶液，分別于0、1、2、4、6、8 h后進(jìn)樣分析，計(jì)算冬凌草甲素峰面積的RSD。

2.4.8 回收率實(shí)驗(yàn)

精密稱取 6份已測定冬凌草甲素含量的藥材1.00 g，按冬凌草甲素含量的100%比分別加入冬凌草甲素對照品，選取 50 ℃條件下制成冬凌草茶供試液后進(jìn)行分析，計(jì)算冬凌草甲素的平均回收率。

2.4.9 樣品含量測定

精密吸取冬凌草茶供試液20 μL，按2.4.1節(jié)色譜條件下分析，測定峰面積，計(jì)算冬凌草茶中冬凌草甲素浸出率，即每100 g冬凌草在相應(yīng)條件下浸出的冬凌草甲素的量(g)。

3 結(jié)果

3.1 冬凌草茶中多糖、總黃酮定標(biāo)準(zhǔn)曲線

3.1.1 葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)曲線

對7個(gè)不同濃度的葡萄糖對照品溶液進(jìn)行苯酚-硫酸顯色后，在490 nm測定吸光度，以質(zhì)量濃度(C)對吸光度值(A) 作回歸統(tǒng)計(jì)分析?；貧w方程為：Y = 0.0294X+0.1667（R2= 0.9980），表明葡萄糖在2.75～19.25 μg/mL范圍內(nèi)線性關(guān)系良好。標(biāo)準(zhǔn)曲線見圖1。

圖1 葡萄糖對照品標(biāo)準(zhǔn)曲線Fig.1 Standard curve of glucose

3.1.2 蘆丁標(biāo)準(zhǔn)曲線

對5個(gè)不同濃度的蘆丁對照品溶液采用鋁鹽法顯色后，于500 nm測定吸光度，以質(zhì)量濃度(C)對吸光度值(A) 作回歸統(tǒng)計(jì)分析?；貧w方程為：Y = 13.989X-0.0484（R2= 0.9991），表明蘆丁在 0.016～0.096 mg/mL范圍內(nèi)線性關(guān)系良好。標(biāo)準(zhǔn)曲線見圖2。

圖2 蘆丁對照品標(biāo)準(zhǔn)曲線Fig.2 Standard curve of rutin

3.2 冬凌草茶中多糖、總黃酮浸出率測定

對由不同溫度下冬凌草水浸提液制備的茶進(jìn)行相應(yīng)供試液制備后，經(jīng)顯色后測定冬凌草茶中多糖及總黃酮的浸出率，結(jié)果見表1。

表1 不同溫度下冬凌草茶中多糖、總黃酮的浸出率Table 1 The extracting rate of polysaccharides and total flavonoids in Rabdosia rubescens tea at different temperatures

由表1可見，冬凌草茶中多糖與總黃酮隨著浸泡溫度的升高均逐漸升高，用100 ℃水浸泡時(shí)的多糖及總黃酮浸出率均比 50 ℃時(shí)的浸出率要高近 3倍。而超聲條件下的多糖和總黃酮浸出率僅相當(dāng)于50 ℃水的浸泡。

3.3 冬凌草茶中冬凌草甲素浸出率測定

3.3.1 冬凌草甲素標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制

不同濃度的冬凌草甲素對照品溶液20 μL進(jìn)樣分析，對照品色譜圖見圖3。以濃度(C)對峰面積(A)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，得冬凌草甲素回歸方程分別為A = 27752C-106.64，R2= 0.9995，在0.013～0.065 mg/mL濃度范圍呈良好的線性關(guān)系。標(biāo)準(zhǔn)曲線見圖4。

圖3 冬凌草甲素對照品HPLC色譜圖Fig.3 HPLC chromatograms of oridonin

圖4 冬凌草甲素對照品標(biāo)準(zhǔn)曲線Fig.4 Standard curve of oridonin

3.3.2 精密度實(shí)驗(yàn)、重現(xiàn)性、穩(wěn)定性實(shí)驗(yàn)

對同一質(zhì)量濃度的冬凌草甲素對照品溶液重復(fù)進(jìn)樣6次，計(jì)算峰面積RSD為0.99 %，精密度良好。對6份冬凌草制備的茶供試液進(jìn)行測定，結(jié)果冬凌草甲素浸出率的RSD 值為1.36 %，表明具有較好重現(xiàn)性。對于0、1、2、4、6、8 h后分析的供試液，冬凌草甲素峰面積的RSD為0.94 %，表明冬凌草茶供試液在8 h 內(nèi)穩(wěn)定。結(jié)果見表2。

表2 精密度、重現(xiàn)性及穩(wěn)定性實(shí)驗(yàn)Table 2 Precision , repeatability and stability experiments

3.3.3 回收率試驗(yàn)

對6份冬凌草甲素的加樣回收實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，冬凌草甲素的平均回收率為98.47 %，RSD為1.40 %。結(jié)果見表3。

表3 冬凌草甲素回收率實(shí)驗(yàn)Table 3 Method recovery of oridonin

3.3.4冬凌草茶中冬凌草甲素浸出率測定

對不同提取溫度下制備的冬凌草茶供試液進(jìn)行色譜分析，供試液色譜圖為圖 5，圖譜顯示與冬凌草甲素具有一致的保留時(shí)間。

圖5 冬凌草茶HPLC色譜圖Fig. 5 HPLC chromatograms of Rabdosia rubescens tea

對不同溫度浸提所獲的冬凌草茶及超聲提取所得冬凌草茶進(jìn)行HPLC分析，結(jié)果見表4?？梢妼φ赵囼?yàn)超聲提取具有較高的冬凌草甲素浸出率，遠(yuǎn)高于50 ℃溫浸的0.0661 %，達(dá)到0.0749 %，體現(xiàn)了超聲提取的優(yōu)越性，提取效率高，成分破壞小。而用熱提的方式，由數(shù)據(jù)顯示，隨著溫度的升高，冬凌草甲素的浸出率大致呈略降趨勢，可能由于太高的溫度導(dǎo)致了冬凌草甲素的破壞。因?yàn)槎璨菁姿厥强拱┫椎闹饕煞郑瑧?yīng)成為飲茶的主要考慮因素，同時(shí)考慮冬凌草茶中的多糖及總黃酮，溫度太低時(shí)這兩類成分浸出很低，而在70 ～80 ℃時(shí)冬凌草茶的多糖及總黃酮浸出率亦較高，且在此溫度范圍冬凌草甲素的浸出率亦相對較高，因此，應(yīng)選擇70 ～80 ℃的溫開水浸泡，而避免使用沸水浸泡。

表4 不同溫度下冬凌草茶中冬凌草甲素的浸出率Table 4 The extracting rate of oridonin in Rabdosia rubescens tea at different temperatures

4 結(jié)束語

冬凌草常作為茶飲用，可用于防癌及治療咽炎等，茶以水為溶媒，因此冬凌草茶中的成分應(yīng)具有較大的極性，多為多糖和黃酮類成分，因此本實(shí)驗(yàn)測定了冬凌草茶中的多糖及黃酮成分，該類成分多具有保健功能，而防癌與治療咽炎等與冬凌草中的另一成分冬凌草甲素相關(guān)。近年來研究冬凌草甲素非?；钴S主要是因其顯著的抗癌活性，也是冬凌草中的代表成分。本實(shí)驗(yàn)同時(shí)測定了冬凌草茶中的冬凌草甲素浸出率，為揭示冬凌草茶的藥理作用的物質(zhì)基礎(chǔ)提供依據(jù)。另外本實(shí)驗(yàn)還研究了不同溫度對冬凌草浸泡出的茶中成分量的影響，結(jié)果顯示：冬凌草茶中多糖及總黃酮隨著浸提溫度的升高，浸出率成升高趨勢，而冬凌草甲素則呈相反的趨勢且變化較小。多糖浸出率由0.81 %升至2.30 %，總黃酮浸出率由1.73 %升至4.21 %；冬凌草甲素的浸出率50 ℃浸出率為0.0661 %，而100 ℃浸出率為0.052 7%。鑒于飲用冬凌草茶的目的多為防癌、抗炎及調(diào)節(jié)免疫力等，要綜合考慮這三種成分在茶中的浸出率，實(shí)驗(yàn)結(jié)果發(fā)現(xiàn)70～80 ℃范圍內(nèi)浸泡，能較好地兼顧這些成分。因此，應(yīng)用冬凌草茶應(yīng)避免選擇沸水浸泡，盡量使用70～80 ℃溫水浸泡。

[1] 國家藥典委員會．中華人民共和國藥典（一部） [M]．北京:中國醫(yī)藥科技出版社,2010:106．

[2] BAI Nai-sheng, HE Kan, ZHOU Zhu,et al. Ent-Kaurane Diterpenoids from Rabdosia rubescens and Their Cytotoxic Effects on Human Cancer Cell Lines[J]. Planta medica,2010,76(2):140-146.

[3] 劉旭．冬凌草和柔莖香茶菜的化學(xué)成分及生物活性研究[D]．武漢:華中科技大學(xué),2012:20-28．

[4] 馬銳,吳勝本．中藥黃酮類化合物藥理作用及作用機(jī)制研究進(jìn)展[J].中國藥物警戒,2013,10(5):286-290．

[5] 安曉娟,馮琳,宋紅平,等.植物多糖的結(jié)構(gòu)分析及藥理活性研究進(jìn)展[J].中國藥學(xué)雜志,2012,47(16):1271-1275.

[6] Chen S, Gao J, Halicka H D, et al. The cytostatic and cytotoxic effects of oridonin (Rubescenin), a diterpenoid from Rabdosia rub esc ens, on tumor cells of different lineage[J]. International journal of oncology, 2005, 26(3):579-588.

[7] Meade-Tollin L C, Wijeratne E M K, Cooper D, et al.Ponicidin and oridonin are responsible for the antiangiogenic activity of rabdosia r ubescens, a constituent of the herbal supplement PC SPES[J]. Journal of natural products, 2004, 67(1): 2-4.

[8] 高增義．“冬凌草”及河南產(chǎn)同屬植物[J]．河南醫(yī)學(xué)院學(xué)報(bào),1976(5) :8-12．

[9] 朱彩平,張聲華. 枸杞子水提物中多糖含量的測定[J].食品與發(fā)酵工業(yè),2005,31(2):111-113．

[10] 王文君, 孫志勇, 向燦輝,等．芹菜籽中總黃酮提取工藝條件的研究[J].井岡山大學(xué)學(xué)報(bào):自然科學(xué)版,2010,31(3):61-64．

[11] 魯彥毫,劉國俊,李梅榮,等．冬凌草葉和莖中冬凌草甲素含量的對比研究[J].藥物分析雜志,2000,20(6):390-392．