高效液相色譜梯度洗脫法同時(shí)測(cè)定調(diào)氣丸中6個(gè)主要成分含量

張銘,馬麗穎

調(diào)氣丸處方源于《衛(wèi)生部頒藥品標(biāo)準(zhǔn)》中藥成方制劑第二冊(cè)，由厚樸(姜制)、山楂(炒制)、山楂(炭制)、蒼術(shù)(米泔水炒)、木香、香附(醋炒)等14味中藥材加工而成的褐色水丸，具有調(diào)氣止痛、健胃消食的功效，臨床上主要用于胃脘脹悶、胃口疼痛、呃逆、噯腐吞酸、腹?jié)M帶下、便瀉痢疾等病癥的治療。調(diào)氣丸質(zhì)量控制指標(biāo)相對(duì)較少，現(xiàn)行標(biāo)準(zhǔn)僅規(guī)定了性狀及丸劑通則項(xiàng)下的檢測(cè)項(xiàng)目[1-2]，也未檢索到對(duì)該制劑多組分含量測(cè)定的文獻(xiàn)報(bào)道。為進(jìn)一步提高現(xiàn)行標(biāo)準(zhǔn)，有效控制調(diào)氣丸產(chǎn)品質(zhì)量，本文對(duì)方中主要藥味厚樸[3]中的和厚樸酚、厚樸酚以及山楂[3](炒制)和山楂[3](炭制)中的牡荊素葡萄糖苷、牡荊素鼠李糖苷、牡荊素、金絲桃苷采用高效液相梯度洗脫色譜法[4]進(jìn)行了同時(shí)測(cè)定，為提高調(diào)氣丸質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)提供數(shù)據(jù)支持。

1 材料

1.1實(shí)驗(yàn)儀器Agilent 1200系列高效液相色譜儀(美國(guó)安捷倫公司)；AX205型十萬分之一電子天平(瑞士梅特勒—托利多公司)；SB-5200DTD型超聲波發(fā)生器(寧波新芝生物科技股份有限公司)。

1.2試藥調(diào)氣丸(每20粒重1.0 g)來源于山東宏濟(jì)堂制藥集團(tuán)股份有限公司(批號(hào)1602005、1604009、1605013)；和厚樸酚對(duì)照品(批號(hào)110730-201614，含量99.3%)、厚樸酚對(duì)照品(批號(hào)110729-201513，含量98.8%)、牡荊素葡萄糖苷對(duì)照品(批號(hào)111979-201501，含量92.8%)、牡荊素鼠李糖苷對(duì)照品(批號(hào)111668-200602，含量100.0%)、牡荊素對(duì)照品(批號(hào)111687-201603，含量95.7%)和金絲桃苷對(duì)照品(批號(hào)111521-201507，含量94.3%)均來源于中國(guó)食品藥品檢定研究院；乙腈為色譜純，水為重蒸餾水，其他試劑為分析純。

注：1為和厚樸酚；2為厚樸酚；3為牡荊素葡萄糖苷；4為牡荊素鼠李糖苷；5為牡荊素；6為金絲桃苷?qǐng)D1 高效液相色譜圖：A為混合對(duì)照品；B為樣品；C為厚樸陰性供試品；D為山楂(炒制)和山楂(炭制)陰性樣品

2 實(shí)驗(yàn)方法與結(jié)果

2.1色譜條件色譜柱：Venusil MP C18柱(200 mm×4.6 mm，5 μm)；流動(dòng)相：乙腈-1.0%冰醋酸溶液，梯度洗脫(0～11 min，16.0%A；11～20 min，16.0%A→28.0%A；20～39 min，28.0%A→45.0%A；39～45 min，45.0%A→16.0%A)；0～20 min在294 nm[5-8]波長(zhǎng)下檢測(cè)和厚樸酚及厚樸酚；20～45 min在340 nm[9-11]波長(zhǎng)下檢測(cè)牡荊素葡萄糖苷、牡荊素鼠李糖苷、牡荊素和金絲桃苷；流速：0.9 mL/min；柱溫：30 ℃。

2.2溶液的制備

2.2.1 對(duì)照品溶液的制備 精密稱取對(duì)照品和厚樸酚、厚樸酚、牡荊素葡萄糖苷、牡荊素鼠李糖苷、牡荊素和金絲桃苷各適量，分別用甲醇制成對(duì)照品儲(chǔ)備液(和厚樸酚0.594 g/L、厚樸酚0.852 g/L、牡荊素葡萄糖苷0.718 g/L、牡荊素鼠李糖苷4.136 g/L、牡荊素0.532 g/L、金絲桃苷0.368 g/L)。再依次吸取各對(duì)照品儲(chǔ)備液：5.0、5.0、5.0、5.0、2.5、2.5 mL，用甲醇制成各成分濃度分別為0.029 7、0.042 6、0.035 9、0.206 8、0.013 3、0.009 2 g/L的混合對(duì)照品溶液。

2.2.2 樣品溶液的制備 取研細(xì)后的調(diào)氣丸約2.0 g，精密稱定，精密加入甲醇50 mL，稱定重量，采用超聲波(功率200 W，頻率40 kHz)超聲提取30 min，放冷，用甲醇補(bǔ)足所減失的重量，搖勻，過濾，即得調(diào)氣丸樣品溶液。

2.2.3 陰性樣品溶液的制備 按調(diào)氣丸的制備工藝，分別制備不含厚樸(姜制)的陰性樣品、不含山楂(炒制)和山楂(炭制)的陰性樣品，再按“2.2.2”項(xiàng)下的方法制成對(duì)應(yīng)的2個(gè)陰性樣品溶液。

2.3專屬性試驗(yàn)精密吸取“2.2.1～2.2.3”項(xiàng)下的溶液各適量，依法進(jìn)樣測(cè)定，結(jié)果顯示混合對(duì)照品溶液、樣品溶液在相應(yīng)的和厚樸酚、厚樸酚、牡荊素葡萄糖苷、牡荊素鼠李糖苷、牡荊素和金絲桃苷的保留時(shí)間處均有吸收峰，厚樸陰性樣品溶液色譜圖中無和厚樸酚、厚樸酚的吸收峰，山楂(炒制)和山楂(炭制)陰性樣品溶液色譜圖中無牡荊素葡萄糖苷、牡荊素鼠李糖苷、牡荊素和金絲桃苷的吸收峰，說明各成分的檢測(cè)不受干擾，色譜圖見圖1。

2.4標(biāo)準(zhǔn)曲線的制備分別精密量取“2.2.1”項(xiàng)下對(duì)照品儲(chǔ)備液各0.1、0.2、0.5、1.0、1.5、2.0 mL，置于6個(gè)20 mL量瓶中，用甲醇制成6個(gè)不同濃度的混合對(duì)照品溶液(樣品1：和厚樸酚2.97 mg/L、厚樸酚4.26 mg/L、牡荊素葡萄糖苷3.59 mg/L、牡荊素鼠李糖苷20.68 mg/L、牡荊素2.66 mg/L、金絲桃苷1.84 mg/L；樣品2：和厚樸酚5.94 mg/L、厚樸酚8.52 mg/L、牡荊素葡萄糖苷7.18 mg/L、牡荊素鼠李糖苷41.36 mg/L、牡荊素5.32 mg/L、金絲桃苷3.68 mg/L；樣品3：和厚樸酚14.85 mg/L、厚樸酚21.30 mg/L、牡荊素葡萄糖苷17.95 mg/L、牡荊素鼠李糖苷103.40 mg/L、牡荊素13.30 mg/L、金絲桃苷9.20 mg/L；樣品4：和厚樸酚29.70 mg/L、厚樸酚42.60 mg/L、牡荊素葡萄糖苷35.90 mg/L、牡荊素鼠李糖苷206.8 mg/L、牡荊素26.60 mg/L、金絲桃苷18.40 mg/L；樣品5：和厚樸酚44.55 mg/L、厚樸酚63.90 mg/L、牡荊素葡萄糖苷53.85 mg/L、牡荊素鼠李糖苷310.20 mg/L、牡荊素39.90 mg/L、金絲桃苷27.60 mg/L；樣品6：和厚樸酚59.40 mg/L、厚樸酚85.20 mg/L、牡荊素葡萄糖苷71.80 mg/L、牡荊素鼠李糖苷413.60 mg/L、牡荊素53.20 mg/L、金絲桃苷36.80 mg/L)，依法進(jìn)樣測(cè)定和厚樸酚、厚樸酚、牡荊素葡萄糖苷、牡荊素鼠李糖苷、牡荊素和金絲桃苷的峰面積，以質(zhì)量濃度(x，mg/L)作為橫坐標(biāo)，峰面積y為縱坐標(biāo)，得和厚樸酚、厚樸酚、牡荊素葡萄糖苷、牡荊素鼠李糖苷、牡荊素和金絲桃苷的回歸方程，結(jié)果見表1。

表1 線性關(guān)系試驗(yàn)結(jié)果

2.5加樣回收率試驗(yàn)取批號(hào)為1602005的調(diào)氣丸6份，研細(xì)，每份約1.0 g，精密稱定，置具塞錐形瓶中，加入精密稱定的牡荊素鼠李糖苷對(duì)照品6.34 mg，精密加入和厚樸酚、厚樸酚、牡荊素葡萄糖苷、牡荊素和金絲桃苷混合對(duì)照品溶液(和厚樸酚0.714 mg/L、厚樸酚1.302 mg/L、牡荊素葡萄糖苷0.859 mg/L、牡荊素0.313 mg/L、金絲桃苷0.199 mg/L)1.0 mL，再精密加入甲醇50 mL，按“2.2.2”的方法制備加樣回收樣品溶液，依法進(jìn)樣測(cè)定，計(jì)算和厚樸酚、厚樸酚、牡荊素葡萄糖苷、牡荊素鼠李糖苷、牡荊素和金絲桃苷的回收率及相應(yīng)的RSD，結(jié)果見表2。

表2 加樣回收率實(shí)驗(yàn)結(jié)果

2.6重復(fù)性試驗(yàn)取同一批次調(diào)氣丸樣品(批號(hào)1602005)，按“2.2.2”項(xiàng)下制備方法制備調(diào)氣丸供試品溶液6份，依法進(jìn)樣測(cè)定，分別計(jì)算和厚樸酚、厚樸酚、牡荊素葡萄糖苷、牡荊素鼠李糖苷、牡荊素和金絲桃苷的含量，結(jié)果所測(cè)6個(gè)組分含量的RSD依次為1.22%、0.75%、1.06%、0.37%、1.21%和0.94%。

2.7精密度試驗(yàn)取“ 2.2.1”項(xiàng)下的混合對(duì)照品溶液，連續(xù)進(jìn)樣6次，依法測(cè)定和厚樸酚、厚樸酚、牡荊素葡萄糖苷、牡荊素鼠李糖苷、牡荊素和金絲桃苷的峰面積，結(jié)果所測(cè)各成分峰面積的RSD分別為1.06%、0.95%、1.27%、0.73%、1.41%和1.12%。

2.8穩(wěn)定性試驗(yàn)取同一份供試品溶液，在室溫下分別于0、2、4、6、8、10、12 h后，依法進(jìn)樣測(cè)定和厚樸酚、厚樸酚、牡荊素葡萄糖苷、牡荊素鼠李糖苷、牡荊素和金絲桃苷的峰面積值，結(jié)果調(diào)氣丸在室溫下12 h內(nèi)穩(wěn)定，所測(cè)6個(gè)成分峰面積的RSD分別為1.05%、0.94%、1.01%、0.86%、1.19%和1.21%。

2.9調(diào)氣丸樣品含量測(cè)定取3個(gè)不同批號(hào)的調(diào)氣丸，按“2.2.2”項(xiàng)下制備方法制備調(diào)氣丸供試品溶液，依法進(jìn)樣測(cè)定和厚樸酚、厚樸酚、牡荊素葡萄糖苷、牡荊素鼠李糖苷、牡荊素、金絲桃苷的峰面積，所測(cè)各成分含量結(jié)果見表3。

表3 調(diào)氣丸樣品含量測(cè)定結(jié)果/(mg/g)

3 討論

3.1色譜條件的考察作者在實(shí)驗(yàn)中分別考察了甲醇—水[12-13]、乙腈—水、乙腈—1.0%冰醋酸溶液[14]和乙腈—0.5%磷酸溶液等流動(dòng)相體系，以色譜峰基線平穩(wěn)情況和所測(cè)各成分分離情況為指標(biāo)，優(yōu)選最佳的流動(dòng)相體系，對(duì)比結(jié)果顯示乙腈—1.0%冰醋酸溶液優(yōu)于其他流動(dòng)相體系，但所測(cè)成分和厚樸酚、牡荊素鼠李糖苷的分離效果不太理想。在此基礎(chǔ)上對(duì)流動(dòng)相的比例進(jìn)行摸索，最終選優(yōu)最佳的流動(dòng)相體系為：乙腈—1.0%冰醋酸溶液梯度洗脫(0～11 min，16.0%A；11～20 min，16.0%A→28.0%A；20～39 min，28.0%A→45.0%A；39～45 min，45.0%A→16.0%A)。

3.2供試品提取方法的確定筆者在調(diào)氣丸供試品溶液的制備實(shí)驗(yàn)中，分別考察不同的提取方式(回流、超聲、索氏)對(duì)所測(cè)6個(gè)成分和厚樸酚、厚樸酚、牡荊素葡萄糖苷、牡荊素鼠李糖苷、牡荊素、金絲桃苷提取效果的影響，結(jié)果三種提取方式提取效果差異不大，超聲提取較為簡(jiǎn)便，故調(diào)氣丸供試品溶液提取方式選為超聲提取；在此基礎(chǔ)上又對(duì)超聲提取的功率和頻率(150 W 28 kHz、200 W 40 kHz、300 W 40 kHz)、提取溶劑(70%甲醇、純甲醇、純乙醇)、提取時(shí)間(15、30、45 min)、溶劑量(25、50、100 mL)進(jìn)行了考察，最終選優(yōu)最佳的調(diào)氣丸供試品溶液的制備方法為：加入50 mL甲醇超聲(功率200 W，頻率40 kHz)提取30 min。

3.3檢測(cè)波長(zhǎng)的選擇取所測(cè)各成分和厚樸酚、厚樸酚、牡荊素葡萄糖苷、牡荊素鼠李糖苷、牡荊素、金絲桃苷對(duì)照品儲(chǔ)備溶液適量，在200～400 nm波長(zhǎng)范圍內(nèi)進(jìn)行紫外掃描，結(jié)果和厚樸酚、厚樸酚在294 nm處有最大吸收，牡荊素葡萄糖苷、牡荊素鼠李糖苷、牡荊素、金絲桃苷在340 nm處有最大吸收。同時(shí)參考《中國(guó)藥典》2015年版一部厚樸、山楂葉提取物項(xiàng)下各成分的檢測(cè)波長(zhǎng)，結(jié)合所測(cè)各成分的色譜圖，最終確定采用波長(zhǎng)切換法0～20 min時(shí)在294 nm波長(zhǎng)下檢測(cè)和厚樸酚及厚樸酚，20～45 min在340 nm波長(zhǎng)下檢測(cè)牡荊素葡萄糖苷、牡荊素鼠李糖苷、牡荊素和金絲桃苷。

綜上所述，本研究采用高效液相波長(zhǎng)切換聯(lián)合梯度洗脫法測(cè)定調(diào)氣丸中6個(gè)成分的含量，方法簡(jiǎn)單快速而且準(zhǔn)確度高，填補(bǔ)了本品液相色譜分析方面的研究空白，可在一定程度上保證調(diào)氣丸功效及質(zhì)量。