HPLC法測定低溫烘焙綠豆中牡荊苷與異牡荊苷的含量及變化

王雪，肖萍，2，王步江，2，王娜，2，黃宗海，2，劉金福，2，*

（1.天津農(nóng)學(xué)院食品科學(xué)與生物工程學(xué)院，天津 300384；2.天津市農(nóng)副產(chǎn)品深加工技術(shù)工程中心，天津 300384）

綠豆又名青小豆，我國綠豆資源豐富，在黃河、淮河流域、長江下游及東北、華北地區(qū)等地均有種植[1]。一般每100 g 綠豆含蛋白質(zhì)約25 g、碳水化合物55 g～62 g、脂肪0.5 g～1.2 g，而且含有人體所需的多種維生素和礦質(zhì)元素，是營養(yǎng)豐富的食品原料[2]。綠豆作為常用的藥食兩用植物，具有清熱祛暑、利水消腫、解毒排膿、抗菌抑菌、降血脂、降血糖、抗腫瘤、預(yù)防癌癥等功能[3-5]。加之綠豆適口性好，易消化，因而對綠豆食品的開發(fā)應(yīng)用很多，比如綠豆涼粉、綠豆粉絲、綠豆糕、綠豆煎餅、綠豆沙等。近些年，也有采用去皮、磨漿、過濾、噴霧干燥等工藝生產(chǎn)綠豆全粉，但綠豆皮中的膳食纖維、黃酮類等活性物質(zhì)沒有得到充分利用，造成了綠豆資源浪費(fèi)；同時(shí)高溫干燥使綠豆中的活性成分失活，降低了綠豆的營養(yǎng)價(jià)值[6]。因此開發(fā)全綠豆?fàn)I養(yǎng)食品對綠豆產(chǎn)品的開發(fā)具有一定的現(xiàn)實(shí)意義。

研究發(fā)現(xiàn)，牡荊苷與異牡荊苷是自然界中常見的黃酮類物質(zhì)，已證實(shí)二者具有多種生物活性，如抗氧化作用及抗炎、抗病毒作用[7-9]。閆沖等對綠豆、黑豆、赤豆中的牡荊苷與異牡荊苷進(jìn)行檢測，發(fā)現(xiàn)只有綠豆中含有牡荊苷與異牡荊苷[8]。李艷榮等建議為了對綠豆藥材進(jìn)行有效的質(zhì)量控制，除測定常規(guī)成分外，還可以以牡荊苷和異牡荊苷的含量作為重要的特性指標(biāo)進(jìn)行檢測[2]。

因此，本文擬將以牡荊苷和異牡荊苷為分析指標(biāo)，通過對低溫烘焙綠豆加工前后牡荊苷和異牡荊苷含量的變化來了解低溫烘焙技術(shù)對綠豆中活性成分的影響，旨在為全綠豆?fàn)I養(yǎng)食品的開發(fā)生產(chǎn)提供檢測方法和技術(shù)參考。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

綠豆：產(chǎn)地為天津市靜海區(qū)；甲醇（色譜純）：凱馬特（天津）化工科技有限公司；冰醋酸（色譜級）：天津市科密歐化學(xué)試劑有限公司；牡荊苷、異牡荊苷標(biāo)準(zhǔn)品（純度大于99%）：上海斯信生物科技有限公司。

1.2 試驗(yàn)儀器

遠(yuǎn)紅外烤箱（UKOEO 猛瑪象）：珠海家寶德電器有限公司；電子天平（JA2003 型）：上海舜宇恒平科學(xué)儀器有限公司；超聲波清洗儀（KB3200B 型）：昆山市超聲儀器有限公司；水浴鍋（HWS-28 型）：上海恒科學(xué)儀器有限公司；高效液相色譜儀（1260 型）：美國安捷倫科技有限公司。分析過程所有用到的水均為Mili-Q 超純水。

1.3 試驗(yàn)方法

1.3.1 低溫烘焙綠豆的加工方法及感官評定

工藝流程：綠豆→挑選→清洗→瀝干→低溫烘焙

通過感官評價(jià)和烘焙的溫度、時(shí)間等單因素試驗(yàn)確定最佳工藝條件。低溫烘焙綠豆感官評定標(biāo)準(zhǔn)見表1。

1.3.2 高效液相色譜測定方法

1.3.2.1 樣品處理?xiàng)l件的優(yōu)化

將生綠豆干燥除去水分、烘焙綠豆用超微粉碎機(jī)進(jìn)行粉碎，過80 目篩，備用。準(zhǔn)確稱取5.000 g 綠豆粉末，分別置于100 mL 的燒杯中，加入30 mL 分析純甲醇，分別超聲處理30、60、120 min，減壓抽濾后棄掉濾渣，濾液過 0.22 μm 濾膜，定容于 50 mL 容量瓶，作為待測樣品。

表1 低溫烘焙綠豆感官評定標(biāo)準(zhǔn)Table 1 Sensory evaluation criteria for low temperature baked mung beans

1.3.2.2 色譜條件

采用 Venusil ABS C18（4.6 mm × 250 mm，5 μm）色譜柱；流動(dòng)相：A，超純水；B，甲醇-0.1 %冰醋酸溶液（體積比 80∶20）；梯度洗脫（0 min～3 min，85%～70%B；3 min～6 min，70%～55%B；6 min～9 min，55%～35%B；9 min～12 min，35 %～35 % B；12 min～15 min，35 %～70 % B；15 min～18 min，70 %～85 % B），檢測波長：340 nm；柱溫：30 ℃；流速：0.6 mL/min；進(jìn)樣量：10 μL。

1.3.2.3 標(biāo)準(zhǔn)品的配制

準(zhǔn)確稱取20 mg 牡荊苷和異牡荊苷標(biāo)準(zhǔn)品，加入甲醇定容至10 mL，配制成2 mg/mL 牡荊苷和異牡荊苷標(biāo)準(zhǔn)品溶液；并利用甲醇制備成不同濃度的牡荊苷與異牡荊苷混合溶液。

1.3.2.4 樣品處理

準(zhǔn)確稱取原料綠豆和烘焙綠豆粉末，按照1.3.2.1方法在最優(yōu)提取時(shí)間條件下，定容于色譜純甲醇中，作為待測樣品。

2 結(jié)果與分析

2.1 低溫烘焙綠豆加工條件及感官評價(jià)

本試驗(yàn)在155 ℃左右通過熱風(fēng)干燥的方式對綠豆進(jìn)行烘焙熟化發(fā)現(xiàn)，熟化的綠豆質(zhì)地堅(jiān)硬、疏松感差，帶有明顯的豆腥味。低溫烘焙谷物類食品是指采用遠(yuǎn)紅外加熱一般溫度不超過130 ℃條件下烘焙一定的時(shí)間，使物料熟化，并呈現(xiàn)特有的香氣和風(fēng)味。試驗(yàn)首先分別對烘焙溫度為 110、120、130、140、150 ℃、時(shí)間分別為 120、150、180、210、240 min，進(jìn)行單因素試驗(yàn)，通過色澤、香氣、風(fēng)味口感等感官評價(jià)，對適宜的烘焙溫度和時(shí)間的進(jìn)行考察，發(fā)現(xiàn)在130 ℃左右烘焙一定的時(shí)間可以得到具有熟化綠豆良好風(fēng)味和口感的產(chǎn)品，見表2。

表2 不同低溫烘焙溫度、時(shí)間的綠豆感官評價(jià)結(jié)果Table 2 Sensory evaluation results of mung beans at different temperature and time of baking

從感官評價(jià)的綜合得分來看，采用遠(yuǎn)紅外烘焙熟化綠豆適宜的條件為溫度130 ℃，時(shí)間180 min，得到的產(chǎn)品口感酥脆，粉碎研磨后綠豆的香氣濃厚，具有更好的沖調(diào)性。

2.2 高效液相色譜法（high performance liquid chromatography，HPLC）測定牡荊苷與異牡荊苷的方法學(xué)考察

2.2.1 超聲波處理時(shí)間對牡荊苷與異牡荊苷含量測定的影響

樣品前處理采用超聲輔助提取，HPLC 法分別測定了提取30、60、120 min 時(shí)原料綠豆和低溫烘焙綠豆中牡荊苷和異牡荊苷的含量，結(jié)果如圖1和圖2所示。從圖中可以看出，無論是原料綠豆還是低溫烘焙后的綠豆，牡荊苷和異牡荊苷出峰時(shí)間相同，且雜峰少，雜峰峰面積很小，牡荊苷和異牡荊苷出峰時(shí)間分別在14.4 min 和14.7 min。比較超聲波3個(gè)處理時(shí)間的牡荊苷和異牡荊苷的峰面積發(fā)現(xiàn)處理60 min 后基本穩(wěn)定，以此做為樣品的前處理?xiàng)l件。

2.2.2 精密度考察

精密吸取混合標(biāo)準(zhǔn)品10 μL，連續(xù)進(jìn)樣6 次，測定峰面積，計(jì)算牡荊苷與異牡荊苷RSD 分別為0.79%與0.84%，表明該方法的精密度良好。

2.2.3 線性關(guān)系考察

取一定濃度的牡荊苷與異牡荊苷標(biāo)準(zhǔn)品溶液，用甲醇依次稀釋制成系列濃度的溶液，按1.3.2.2 色譜條件進(jìn)行測定，見圖3、圖4。以峰面積（Y，mAu）為縱坐標(biāo)對樣品濃度（X，mg/mL））繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，得回歸方程及線性范圍分別為：牡荊苷：Y=307 742X+21.01，R2=0.999 3；異牡荊苷：Y=52 747.5X-9.24，R2=0.999 9。

2.2.4 穩(wěn)定性試驗(yàn)

取同一批樣品溶液，分別于配制0、24、48 h 后測定生綠豆和低溫烘焙綠豆中牡荊苷與異牡荊苷的含量。生綠豆中牡荊苷和異牡荊苷RSD 分別為0.7%和0.65%，低溫烘焙綠豆中RSD 分別為0.51%和0.56%，說明供試品溶液中牡荊苷與異牡荊苷至少在48 h 內(nèi)穩(wěn)定。

圖1 原料綠豆中牡荊苷和異牡荊苷含量測定HPLC色譜圖Fig.1 Determination of aparin and heterophyllin in the raw mung beans by HPLC chromatography

圖2 低溫烘焙綠豆中牡荊苷和異牡荊苷含量測定HPLC色譜圖Fig.2 Determination of aparin and Heterophyllin in low-temperature baked mung beans by HPLC chromatography

圖3 牡荊苷標(biāo)準(zhǔn)曲線Fig.3 Standard curve of aminoside

圖4 異牡荊苷標(biāo)準(zhǔn)曲線Fig.4 Standard curve of isomeronin

2.2.5 重復(fù)性試驗(yàn)

取同一批樣品溶液，按1.3.2.4 方法制備樣品溶液5 份，分別測定生綠豆和低溫烘焙綠豆中牡荊苷與異牡荊苷的含量，結(jié)果生綠豆的RSD 分別為1.32%和1.62%，低溫烘焙綠豆的RSD 分別為1.46%和1.52%。結(jié)果小于3%，表明方法重復(fù)性良好。

2.2.6 回收率試驗(yàn)

取已知含量的生綠豆粉末和低溫烘焙綠豆粉末6 份，各約5 g 精密稱定，分別精密加入牡荊苷對照品0.02 mg 及異牡荊苷對照品溶液0.2 mg 適量，按1.3.2.4項(xiàng)下方法制備樣品溶液，按照上述條件進(jìn)行含量測定，計(jì)算加樣回收率，結(jié)果綠豆中牡荊苷與異牡荊苷的平均加樣回收率為101.5%和98.37%，低溫烘焙綠豆中牡荊苷和異牡荊苷的平均加樣回收率為96.3%和92.8%，表明其回收率良好。

2.3 綠豆及低溫烘焙綠豆中牡荊苷與異牡荊苷含量及變化

樣品通過超聲輔助提取60，分別測得原料綠豆中牡荊苷和異牡荊苷的含量為（0.044±0.002）%和（0.033±0.000 5）%，低溫烘焙綠豆中牡荊苷和異牡荊苷含量分別為（0.047±0.002）%和（0.036±0.001）%，即低溫烘焙加工后綠豆中牡荊苷和異牡荊苷的含量與原料綠豆比較未發(fā)生明顯的變化，低溫烘焙加工后含量略高的原因可能是通過烘焙加工后原料質(zhì)地變得疏松，細(xì)胞易碎，提高了有效成分的溶出率。

圖5 原料綠豆和低溫烘焙綠豆中牡荊苷和異牡荊苷的含量變化Fig.5 Changes of content of aparin and isoamurenin in mung beans and low-temperature baked mung beans

由圖5綠豆中主要的藥效成分牡荊苷和異牡荊苷的含量變化來看，采用低溫烘焙工藝加工的綠豆有效的避免了一部分活性成分的損失，且低溫烘焙工藝干燥熟化的綠豆質(zhì)地疏松，易于粉碎，沖調(diào)性好，去除了豆腥味，具有濃郁的特有香氣，作為原料或配料更有利于相關(guān)產(chǎn)品的開發(fā)生產(chǎn)。

4 結(jié)論

為開發(fā)全綠豆?fàn)I養(yǎng)食品，本文采用低溫烘焙工藝，在130 ℃，加熱180 min 條件下加工熟化綠豆，并利用美國Agilent1260 系統(tǒng)建立測定了加工前后綠豆中牡荊苷與異牡荊苷含量的變化。結(jié)果表明：原料綠豆和經(jīng)低溫烘焙加工熟化后的綠豆中牡荊苷與異牡荊苷的含量分別為（0.044±0.002）%、（0.033±0.000 5）%和（0.047±0.002）%、（0.036±0.001）%，可見低溫烘焙工藝加工的綠豆中牡荊苷和異牡荊苷含量未發(fā)生明顯變化。說明該工藝加工的綠豆不僅保留了綠豆的香氣，具有較好的沖調(diào)性，而且避免了綠豆中生物活性物質(zhì)的損失，其作為原料或配料生產(chǎn)的食品可保留較高的營養(yǎng)價(jià)值。