分子結構對辛烯基琥珀酸淀粉酯荷載多酚行為影響的研究

鄒妍，王力，王梅，董楠，*

（1.貴州輕工職業(yè)技術學院，貴州 貴陽 550025；2.貴州省農業(yè)科學院生物技術研究所，貴州 貴陽 550025）

糖基類表面活性劑是典型的非離子型生物表面活性劑，通常以單糖、寡糖和多糖與長鏈脂肪醇、羧酸及羧酸衍生物發(fā)生酯化、醚化或?；铣蒣1-2]。通常以脂肪酸和辛烯基琥珀酸酐作為長鏈脂肪酸的供體。它們的親水基團為糖基，疏水基團為長鏈脂肪酸。除具有表面活性外，同時具有良好的生物相容性、可降解性和安全性等優(yōu)點[2]。研究報道中，作為多糖基類表面活性劑與單糖和寡糖類表面活性劑相比，不僅能夠形成分子間自聚集體，而且還能形成分子內自聚集體。它們在稀溶液狀態(tài)下，仍能保證一定的乳化效果[3]，還具有更好的分散、乳化、增稠和穩(wěn)定性能。目前，親水性膠體包括淀粉[4]、菊粉[5]、透明質酸[6-8]、魔芋葡甘露聚糖[9]等均已實現疏水分子的嫁接，形成辛烯基琥珀酸多糖酯。前期文獻研究發(fā)現，辛烯基琥珀酸淀粉酯可在溶液內部，通過疏水基團相互靠攏，締合形成以淀粉分子中疏水鏈段為非極性內核，親水長鏈與水接觸的極性外殼的膠束。膠束結構有兩種形態(tài)：1）單個分子鏈即能夠卷曲成團，疏水鏈段締合形成脫水狀態(tài)（單分子膠束）；2）分子之間相互纏結，締合成多分子膠束。近幾年，利用這種結構搭載多酚等疏水性應用性研究成為熱點。但少有文獻關注到多酚結構對其與辛烯基琥珀酸淀粉酯相互作用的影響。本文以辛烯基琥珀酸淀粉酯為載體，荷載不同結構類型的多酚，以期為探明二者相互作用的機制而提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

糯玉米淀粉：湛江市恒煜淀粉有限公司；2-辛烯基琥珀酸酐（純度＞99%）：美國Sigma-Aldrich 公司；高良姜素、山奈素、槲皮素、桑色素、芹菜素、木犀草素、香葉木素、黃芪素、染料木素、芒柄花黃素、異鼠李素、柚皮素、圣草酚、柚皮素：成都普瑞法科技開發(fā)有限公司，純度＞98%；黃芪苷、大豆苷、大豆苷元、染料木苷、蘆丁、楊梅素、楊梅苷、柚皮苷、鄰香豆酸、間香豆酸、表兒茶素（epicatechin，EC）、表兒茶素沒食子酸酯（epicatechin gallate，ECG）、表沒食子兒茶素（epigallocatechin，EGC）、表沒食子兒茶素沒食子酸酯（epigallocatechin gallate，EGCG）、對香豆酸、咖啡酸、阿魏酸、芥子酸、原兒茶素、香草酸、沒食子酸、丁香酸：北京索萊寶科技有限公司，純度＞98%；乙腈（色譜純）：成都市科龍化工試劑廠；鹽酸、氫氧化鈉、磷酸、甲醇、乙醇、異丙醇（分析純）：國藥集團化學試劑有限公司。

1.2 儀器與設備

85-1 型恒溫磁力攪拌器、PHS-3C 型 pH 計：上海儀天科學儀器有限公司；QL-866 型漩渦混合器：海門市其林貝爾儀器制造有限公司；METTLER AE100 型分析天平：梅特勒-托利多儀器上海有限公司；20A 高效液相色譜儀：日本島津公司；ZORBAX Eclipse Plus C18色譜柱：美國 Agilent 公司；DSC 4000 差示掃描量熱儀：美國Perkin-Elmer 公司；TGL-20M 型臺式高速冷凍離心機：長沙邁佳森儀器設備有限公司；LGJ-10型真空冷凍干燥機：北京松源華興科技發(fā)展有限公司。

1.3 試驗方法

1.3.1 辛烯基琥珀酸淀粉酯的制備

辛烯基琥珀酸淀粉酯的制備：參照文獻[10]稍作修改，用電子天平準確稱取糯玉米淀粉50.0 g（干重），按質量分數35%將其分散于去離子水中，不斷攪拌，得到淀粉漿。取1.5 mL（淀粉質量的3%）辛烯基琥珀酸酐，用7.5 mL 異丙醇稀釋。淀粉漿置于35 ℃恒溫水浴鍋中，邊攪拌邊滴加稀釋后的辛烯基琥珀酸酐，同時滴加NaOH 溶液控制反應體系pH 8.5±0.1，辛烯基琥珀酸酐滴加完后（控制在2 h 內加完），保持pH 值不變，繼續(xù)攪拌反應30 min，用稀HCl 溶液調節(jié)pH 值至6.5±0.1。過濾，所得濾渣用去離子水洗滌3 次，再用70 %乙醇洗滌3 次，抽濾，干燥，過100 目篩后即制得辛烯基琥珀酸淀粉酯，真空袋保存?zhèn)溆?。取代度經滴定法[11]測定為 0.232±0.043。

1.3.2 多酚單體與辛烯基琥珀酸淀粉酯的相互作用

多酚單體與辛烯基琥珀酸淀粉酯的相互作用：準確稱取辛烯基琥珀酸淀粉酯40 mg，用20 mL 去離子水混勻，液體加熱至沸后5 min，冷卻至室溫。而后加入多酚1 mg，在恒溫（25 ℃）磁力攪拌器中作用24 h，經過離心（8 000×g，10 min），收集上清液，測定多酚在辛烯基琥珀酸淀粉酯中的溶解度（μg/mL）。以未加辛烯基琥珀酸淀粉酯的多酚溶液為對照，測定多酚在蒸餾水中的溶解度（μg/mL）。根據標準曲線計算多酚濃度并計算辛烯基琥珀酸淀粉酯對多酚的荷載量：

多酚荷載量/（μg/mg）=[（C1-C0）×V]/（C×V）

式中：C1為辛烯基琥珀酸淀粉酯中的多酚濃度，μg/mL；C0為對照多酚濃度，μg/mL；V 為體系總體積，mL；C 為辛烯基琥珀酸淀粉酯的濃度，mg/mL。

1.3.3 多酚的測定

準確稱取各多酚單體0.100 0 g，溶于1 000 mL 甲醇中，配制成濃度100 μg/mL 的母液，分別稀釋至5、10、15、20、30、40 μg/mL 的多酚溶液，用于制作標準曲線。多酚單體的高效液相色譜（high performance liquid chromatography，HPLC）條件如下：色譜柱為ZORBAX Eclipse Plus C18（250 mm×4.6 mm，5 μm），以2 %（質量分數）磷酸（A）和甲醇（B）為流動相，運行時間50 min，柱溫30 ℃，流速0.8 mL/min，檢測波長280 nm，進樣量10 μL。各多酚單體的流動相配比如表1所示。

表1 多酚單體的流動相配比Table 1 The mobile phase during the elution of polyphenol monomer

1.4 數據處理

使用SPSS 22.0 進行數據分析。用Tukey’s HSD 進行方差分析，結果以平均值±標準偏差表示。

2 結果與分析

為考察多酚與辛烯基琥珀酸淀粉酯的相互作用，試驗共選取多酚種類7個，單體36 種。其中多酚種類為黃酮類、異黃酮類、黃酮醇類、黃烷醇類、黃烷酮類、羥基肉桂酸類和羥基苯甲酸類。不同多酚的結構及辛烯基琥珀酸淀粉酯對多酚單體的荷載量見表2。

由表2可知，多酚結構不同，辛烯基琥珀酸淀粉酯對多酚單體的荷載量差異顯著。首先，7個種類多酚與辛烯基琥珀酸淀粉酯的相互作用差異顯著；其次，同種多酚不同單體與辛烯基琥珀酸淀粉酯的相互作用也不同，這主要是因為同一主體中不同單體羥基數量、甲氧基或甲基及糖苷化不同，最終導致各單體與辛烯基琥珀酸淀粉酯的荷載量不同。

表2 多酚主體結構及辛烯基琥珀酸淀粉酯對多酚單體的荷載量Table 2 Chemical structure of polyphenol and polyphenol carrying capacity of starch octenylsuccinate

試驗選取兩組羥基數量相同，但主體結構不同的類黃酮類多酚，以進一步考察類黃酮主體碳架結構對辛烯基琥珀酸淀粉酯多酚荷載量的影響。兩組羥基數量相同的多酚單體分別為①3個羥基的多酚單體：高良姜素、芹菜黃素、柚皮素、染料木素；②4個羥基的多酚單體：山奈素、木犀草素、圣草酚。與辛烯基琥珀酸淀粉酯的相互作用從小到大為①高良姜素＜染料木素＜芹菜黃素＜柚皮素；②山奈素＜木犀草素＜圣草酚。不同類黃酮異構體與辛烯基琥珀酸淀粉酯的作用以黃酮醇最強，其次為黃酮，再次為異黃酮，黃烷酮作用最弱。

2.1 羥基化作用對辛烯基琥珀酸淀粉酯-多酚相互作用的影響

黃酮類多酚是由一個氧原子、一個3 碳鏈和兩個苯環(huán)連接而成的三環(huán)結構（C6-C3-C6 分別對應A、C、B 環(huán)）。黃酮類多酚兩個苯環(huán)間的電子共振對其抗氧化活性及其它生理活性有重要作用。羥基化對辛烯基琥珀酸淀粉酯多酚荷載量的影響見表3。

表3 羥基化對辛烯基琥珀酸淀粉酯多酚荷載量的影響Table 3 Effects of hydroxylation of flavonoids on their loading into starch octenylsuccinate

如表3所示，黃酮類單體的羥基數量不同，與辛烯基琥珀酸淀粉酯的相互作用差異顯著。在B 環(huán)的3′碳位置（芹菜黃素→木犀草素）、C 環(huán)的3 碳原子（芹菜黃素→山奈素）和B 環(huán)的2′碳原子（槲皮素→楊梅素）上引入羥基使得黃酮類物質和黃酮醇類物質荷載量顯著降低。羥基數目相同，辛烯基琥珀酸淀粉酯對其荷載量也有所不同，如辛烯基琥珀酸淀粉酯對山奈素荷載量低于木犀草素。由此可知，B 環(huán)的3′H→OH 比C環(huán)的3H→OH 更有利于與辛烯基琥珀酸淀粉酯的作用。在碳原子上引入羥基后，單體發(fā)生變化，辛烯基琥珀酸淀粉酯對其荷載量也產生相應變化，如辛烯基琥珀酸淀粉酯對槲皮素的荷載量比對木犀草素的荷載量高32.0%，而槲皮素即為木犀草素C 環(huán)上引入羥基變化而來；在黃酮醇B 環(huán)的4′碳原子上引入羥基，辛烯基琥珀酸淀粉酯對其荷載量提高了740.0%；在山奈素B 環(huán)的3′和5′碳原子上引入羥基變?yōu)殚纹に睾蜕Ｉ?，辛烯基琥珀酸淀粉酯對它們的荷載量分別提高了476.1%和1 778.0%。

盡管槲皮素和桑色素B 環(huán)上的羥基數量相同，但辛烯基琥珀酸淀粉酯對槲皮素（9.98±0.75）μg/mg 的荷載量低于桑色素（31.52±3.75）μg/mg。這說明辛烯基琥珀酸淀粉酯與B 環(huán)5′碳原子上的羥基作用強于B 環(huán)3′碳原子上的羥基。槲皮素B 環(huán)2′碳原子上引入羥基變?yōu)闂蠲匪?，辛烯基琥珀酸淀粉酯對其荷載量反而降低了68.0%。大豆苷元A 環(huán)5 碳原子引入羥基變?yōu)槿玖夏舅兀料┗晁岬矸埘λ暮奢d量提高了101.0%。同時，柚皮素B 環(huán)的4′碳原子上引入羥基變?yōu)槭ゲ莘?，辛烯基琥珀酸淀粉酯對其荷載量也有所提高。

2.2 糖苷化作用對辛烯基琥珀酸淀粉酯/菊粉酯-多酚相互作用的影響

植物中大多數黃酮以β-糖苷的形式存在，主要包括3-O-糖苷和7-O-糖苷。糖苷化對辛烯基琥珀酸淀粉酯多酚荷載量的影響見表4。

表4 糖苷化對辛烯基琥珀酸淀粉酯多酚荷載量的影響Table 4 Effects of glycosylation of flavonoids on their loading into starch octenylsuccinate

由表4可知，黃酮糖苷化后辛烯基琥珀酸淀粉酯對其荷載量均顯著提高。與各自的配基相比，辛烯基琥珀酸淀粉酯對黃芪苷荷載量提高了6 093.5%，對楊梅苷荷載量提高了15 768%，對蘆丁荷載量提高了257.5 %，對大豆苷荷載量提高了454.3 %，對染料木苷荷載量提高了140.3 %，對柚皮苷荷載量提高了377.2 %。這可能是因為糖苷化使得黃酮的水溶性提高，親水基團更容易與辛烯基琥珀酸淀粉酯的親水外殼發(fā)生作用。

2.3 甲基化作用對辛烯基琥珀酸淀粉酯/菊粉酯-多酚相互作用的影響

甲基化和甲氧基化對辛烯基琥珀酸淀粉酯多酚荷載量的影響見表5。

表5 甲基化和甲氧基化對辛烯基琥珀酸淀粉酯多酚荷載量的影響Table 5 Effects of methylation and methoxylation of polyphenols on their loading into starch octenylsuccinate

由表5可知，甲基化對多酚的影響較為復雜。在黃酮類主體木犀草素單體B 環(huán)4′碳原子上引入甲基，辛烯基琥珀酸淀粉酯對其荷載量提高了176.2%。然而，當甲基化發(fā)生在異黃酮類大豆苷元，辛烯基琥珀酸淀粉酯對其荷載量下降了59.3%；甲基化發(fā)生在黃酮醇類槲皮素，辛烯基琥珀酸淀粉酯對其荷載量下降了98%；甲基化發(fā)生在黃烷酮類圣草酚，辛烯基琥珀酸淀粉酯對其荷載量下降了35.4%。就羥基肉桂酸而言，當咖啡酸甲基化變成阿魏酸，辛烯基琥珀酸淀粉酯對其荷載量提高了149.1%；阿魏酸甲氧基化變成芥子酸，辛烯基琥珀酸淀粉酯對其荷載量則降低了52.6%。對于羥基苯甲酸而言，原兒茶素3位碳原子甲基化變成香草酸，辛烯基琥珀酸淀粉酯對其荷載量提高了61.3%。沒食子酸和香草酸分別甲基化和甲氧基化后變成丁香酸，辛烯基琥珀酸淀粉酯對它們衍生物的荷載量均有所降低。

2.4 香豆酸和兒茶素與辛烯基琥珀酸淀粉酯/菊粉酯-多酚相互作用的對比

如表2所示，辛烯基琥珀酸淀粉酯對香豆酸同分異構體荷載量的順序為：對位＜間位＜鄰位。這可能是因為香豆酸官能團所處的位置不同，活性不同，最終導致辛烯基琥珀酸淀粉酯對它們的荷載量存在差異。鄰香豆酸和間香豆酸主要以氫鍵的方式與辛烯基琥珀酸淀粉酯結合，相互作用效果較強；而對香豆酸主要是疏水基與之結合，相互作用較弱。EC 經過沒食子酸酰化后變?yōu)?ECG，荷載量由（72.92±1.10）μg/mg 下降為（0.68±0.02）μg/mg，荷載量顯著降低；同樣，EGC經過沒食子酸?；笮料┗晁岬矸埘ζ浜奢d量明顯降低。這可能是因為兒茶素引入沒食子酸后，分子的疏水性變強，親水性變弱。

3 結論

多酚與辛烯基琥珀酸淀粉酯之間相互作用受到多酚結構影響顯著。不同主體結構間與其作用強度存在顯著差異，且同一主體結構中，羥基數量、糖苷化、甲基或甲氧基化都會影響到最終與辛烯基琥珀酸淀粉酯的相互作用。類黃酮異構體與辛烯基琥珀酸淀粉酯的作用強弱順序為：黃烷酮＜異黃酮＜黃酮＜黃酮醇。糖苷化后，黃酮與辛烯基琥珀酸淀粉酯的相互作用顯著提高。辛烯基琥珀酸淀粉酯對香豆酸的荷載力高低順序為：對香豆酸＜間香豆酸＜鄰香豆酸。辛烯基琥珀酸淀粉酯與EC 和 EGC 的相互作用強于與 ECG 和EGCG 的相互作用。