舒尼替尼治療早產(chǎn)兒視網(wǎng)膜病變動(dòng)物模型的研究△

吳 寧 黃敏麗

早產(chǎn)兒視網(wǎng)膜病變(retinopathy of prematurity，ROP)以往稱為晶狀體后纖維增生癥，是早產(chǎn)低出生體質(zhì)量兒視網(wǎng)膜毛細(xì)血管發(fā)育異常的疾病，表現(xiàn)為視網(wǎng)膜缺血、新生血管形成和增生性視網(wǎng)膜病變，輕則引起近視、弱視、斜視，重則引起視網(wǎng)膜脫離導(dǎo)致永久性失明［1］。近年來，隨著醫(yī)學(xué)技術(shù)的提高，存活的早產(chǎn)兒人數(shù)顯著增加，ROP的發(fā)生率也逐年上升，已成為世界范圍內(nèi)兒童致盲的主要原因。臨床上對(duì)此疾病缺乏有效的治療方法，雖少部分病例可通過激光治療，但激光治療具有破壞性，可造成視野損害。對(duì)于新生血管的增殖，部分病例可通過手術(shù)解除，但視功能損害已不可逆轉(zhuǎn)［2］。因此，怎樣控制視網(wǎng)膜新生血管的增殖，尋找更加方便、有效的治療方法，仍是目前亟待解決的問題。本研究建立高氧誘導(dǎo)的ROP動(dòng)物模型，玻璃體內(nèi)注射不同劑量的舒尼替尼(Sunitinib)，從形態(tài)學(xué)、細(xì)胞學(xué)和基因?qū)W3個(gè)層面來觀察Sunitinib對(duì)視網(wǎng)膜新生血管的抑制作用，為ROP的治療提供新線索和新思路。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料 市售大小為50 cm×40 cm×40 cm半透明無毒硬塑料整理箱;數(shù)字測(cè)氧儀(梅城電化分析儀器廠，CY-12C);微量進(jìn)樣器(上海安亭微量進(jìn)樣器廠);Sunitinib(輝瑞公司);ADP酶(美國Amresco公司);Trizol Reagent(Invitrogen公司);cDNA逆轉(zhuǎn)錄試劑盒、PCR試劑盒、DNA Marker(TIANGEN公司);VEGFR2引物、內(nèi)參β-actin引物(上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司);醫(yī)用氧氣(廣西醫(yī)科大學(xué)第一附屬醫(yī)院)。

1.2 方法

1.2.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物及其分組 鼠齡7 d的健康Wistar鼠仔108只(廣西醫(yī)科大學(xué)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心提供)，系清潔級(jí)動(dòng)物，性別不限，與哺乳母鼠共同飼養(yǎng)，稱體質(zhì)量并統(tǒng)一編號(hào)后隨機(jī)分為6組，每組18只:A組為空氣對(duì)照組，B組為高氧對(duì)照組，C組為高氧PBS組，D組為高氧+5 μg舒尼替尼組，E組為高氧+25 μg舒尼替尼組，F(xiàn)組為高氧+125 μg舒尼替尼組。后4組于高氧環(huán)境飼養(yǎng)5 d后分別右眼玻璃體內(nèi)注射等體積(5 μL)0.1 mol·L－1PBS溶液、含舒尼替尼5 μg的PBS溶液、含舒尼替尼25 μg的PBS溶液、含舒尼替尼125 μg的PBS溶液，左眼為自身對(duì)照。給藥后在正常環(huán)境中繼續(xù)飼養(yǎng)5 d。高氧對(duì)照組只做高氧處理。

1.2.2 ROP模型的建立 將鼠齡7 d的Wistar鼠仔及其母鼠置于密閉的氧氣箱內(nèi)，接體積分?jǐn)?shù)100%濕潤醫(yī)用氧氣，調(diào)節(jié)氧氣流量(0.50～0.75)L· min－1，每天3次(9 am、3 pm、7 pm)用測(cè)氧儀監(jiān)測(cè)出氣管中的氧濃度，使其保持在體積分?jǐn)?shù)(80±2)%;溫度保持在22～25℃，濕度(50～70)%。每天將母鼠放回正常氧環(huán)境中休息12 h，防止大鼠肺損傷死亡;2 d更換一次箱內(nèi)墊料、飼料，開箱時(shí)間約15 min。在此環(huán)境中飼養(yǎng)5 d后，從氧箱中取出，在常氧環(huán)境中飼養(yǎng)5 d，到指定時(shí)間處死取標(biāo)本?？諝鈱?duì)照組一直處于正常氧環(huán)境中飼養(yǎng)，其余條件不變。

1.2.3 視網(wǎng)膜鋪片方法 A、B組分別于鼠齡12 d、14 d、17 d各取2只以及C、D、E、F組分別于鼠齡17 d各取6只做視網(wǎng)膜鋪片。在各個(gè)指定時(shí)間，體積分?jǐn)?shù)10%水合氯醛腹腔麻醉鼠，伸展四肢仰臥位固定于自制手術(shù)臺(tái)上，用4℃生理鹽水和4℃ 40 g·L－1多聚甲醛溶液(pH 7.2)心腔灌注處死，摘出眼球置于40 g·L－1多聚甲醛溶液固定，4℃過夜。去除眼前節(jié)，由視盤向四周放射狀將眼杯平分成4份，分離出視網(wǎng)膜置于40 g·L－1多聚甲醛溶液中固定，4℃過夜。ADP酶染色:用0.05 mol·L－1tris-馬來酸緩沖液(pH 7.2)漂洗視網(wǎng)膜15 min×5次，加入ADP酶染色反應(yīng)液(pH 7.2的0.2 mol·L－1tris-馬來酸緩沖液、硝酸鉛3 mmol·L－1、氯化鎂6 mmol·L－1、ADP 1 g·L－1)37℃水浴中孵育15 min，再用0.05 mol·L－1tris-馬來酸緩沖液(pH 7.2)漂洗15 min× 5次，用100 g·L－1硫化銨反應(yīng)1 min顯色，最后用0.05 mol·L－1tris-馬來酸緩沖液(pH 7.2)漂洗15 min×5次后視網(wǎng)膜鋪片，中性樹膠封片。顯微鏡下觀察結(jié)果、拍照。

1.2.4 視網(wǎng)膜病理切片 6組鼠仔于鼠齡17 d各6只頸椎脫臼處死，摘除眼球并編號(hào)。將眼球置于40 g· L－1多聚甲醛固定液中，4℃固定48 h后常規(guī)脫水，石蠟包埋，分別于平行角膜至視盤矢狀位的3個(gè)平面連續(xù)切片，貼片，厚度4～6 μm，每個(gè)平面間隔75 μm，每只眼球選取18張切片(去掉有視神經(jīng)的切面)用于檢查。每組各隨機(jī)抽取20張?zhí)K木精-伊紅(HE)染色切片，在顯微鏡下計(jì)數(shù)突破視網(wǎng)膜內(nèi)界膜的血管內(nèi)皮細(xì)胞核數(shù)目，并計(jì)算出每組的平均數(shù)及標(biāo)準(zhǔn)差，計(jì)數(shù)時(shí)僅計(jì)數(shù)與內(nèi)界膜有聯(lián)系的血管內(nèi)皮細(xì)胞核。

1.2.5 RT-PCR

1.2.5.1 取材 A、B組分別于鼠齡12 d、14 d、17 d各取2只以及C、D、E、F組分別于鼠齡17 d各取6只行RT-PCR檢測(cè)VEGFR2 mRNA的表達(dá)。在各個(gè)指定時(shí)間，頸椎脫臼處死并摘除眼球，在冰上解剖顯微鏡下剝離視網(wǎng)膜。

1.2.5.2 總RNA的提取及鑒定 將相同實(shí)驗(yàn)條件下的2只視網(wǎng)膜置于1.5 mL EP管中，為一個(gè)標(biāo)本。采用Trizol一步法提取組織總RNA。200 g·L－1瓊脂糖凝膠電泳鑒定 RNA質(zhì)量，紫外分光光度儀(DU640型，Beckman)測(cè)定RNA含量。所得RNA置－80℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.5.3 RT-PCR 目的基因引物根據(jù)Gene bank中種屬的VEGFR2基因序列設(shè)計(jì):VEGFR2(sense): 5’-TGTGAACGCTTGCCTTATGAT-3’，VEGFR2(antisense):5’-GCTCTGACTGCTGGTGATGCT-3’;β-actin (sense):5’-GGAGATTACTGCCCTGGCTCCTA-3’，βactin(anti-sense):5’-GACTCATCGTACTCCTGCTTGCTG-3’。cDNA的合成及PCR擴(kuò)增均按試劑盒說明書操作。PCR擴(kuò)增產(chǎn)物于200 g·L－1瓊脂糖凝膠電泳，圖像分析儀照相和分析結(jié)果，以VEGFR2與βactin的PCR產(chǎn)物灰度值比值作為VEGFR2 mRNA的相對(duì)含量。上述實(shí)驗(yàn)重復(fù)6次。

2 結(jié)果

2.1 視網(wǎng)膜鋪片血管形態(tài)觀察 A組鼠齡12 d視網(wǎng)膜血管由中央視盤發(fā)出，向四周放射狀均勻分布，管徑粗直，周邊血管結(jié)構(gòu)清晰，見少量無灌注區(qū)(圖1A)，14 d無灌注區(qū)消失，血管形態(tài)基本正常(圖1B)，17 d血管形態(tài)全部正常(圖1C)。B組鼠齡12 d視網(wǎng)膜血管收縮變細(xì)，走行僵直，視網(wǎng)膜中央部可見大片無灌注區(qū)(圖1D)，14 d大血管開始擴(kuò)張迂曲，仍見大片無灌注區(qū)(圖1E)，17 d大量新生血管網(wǎng)形成(圖1F)，深淺兩層血管結(jié)構(gòu)模糊不清。C組與B組17 d結(jié)果基本相似(圖1G)。D組大血管仍可見迂曲，新生血管稍減少，深淺兩層血管結(jié)構(gòu)仍模糊(圖1H)。E組大血管迂曲現(xiàn)象明顯好轉(zhuǎn)，新生血管減少，深淺兩層血管結(jié)構(gòu)較清楚(圖1I)。F組新生血管明顯減少，深淺兩層血管結(jié)構(gòu)基本正常(圖1J)。

2.2 視網(wǎng)膜病理切片結(jié)果

2.2.1 視網(wǎng)膜病理切片HE染色結(jié)果 A組:內(nèi)界膜結(jié)構(gòu)均一，血管內(nèi)皮細(xì)胞排列整齊，偶見血管內(nèi)皮細(xì)胞突破內(nèi)界膜(圖2A)。B組:可見大量血管內(nèi)皮細(xì)胞團(tuán)突破內(nèi)界膜，形成新生血管腔(圖2B)。C組與B組結(jié)果基本相似(圖2C)。D組:可見突破內(nèi)界膜血管內(nèi)皮細(xì)胞稍減少，仍有新生血管腔形成(圖2D)。E組:可見突破內(nèi)界膜的血管內(nèi)皮細(xì)胞明顯減少，形成或未形成新生血管腔(圖2E)。F組:內(nèi)界膜結(jié)構(gòu)基本均一，少量血管內(nèi)皮細(xì)胞突破內(nèi)界膜，形成或未形成新生血管腔(圖2F)。

2.2.2 突破視網(wǎng)膜內(nèi)界膜血管內(nèi)皮細(xì)胞核計(jì)數(shù)結(jié)果 A組突破視網(wǎng)膜內(nèi)界膜血管內(nèi)皮細(xì)胞核計(jì)數(shù)為:2.650±0.875，B組為31.450±0.686，C組為31.600±0.681，D組為 26.450±1.099，E組為21.250±1.070，F(xiàn)組為12.550±0.999，A組與B組之間差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)，B與C 2組間差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05)，C、D、E、F各組間比較差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(均為P＜0.05)。

2.3 RT-PCR檢測(cè)視網(wǎng)膜組織中VEGFR2 mRNA的表達(dá)結(jié)果

2.3.1 視網(wǎng)膜組織總RNA鑒定 總RNA樣品經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳之后，28 S、18 S、5 S 3條帶在紫外燈下清晰可見，且28 S條帶的亮度是18 S的2倍。紫外分光光度計(jì)比色測(cè)定顯示，所有 RNA樣品OD260/OD280均＞1.8。

Figure 1 A-F stood for the retina stretched preparation ADPase staining of the air control group and high oxygen control group at 12 days，14 days，17 days，respectively;G-J stood for the retina stretched preparation ADPase staining of the high oxygen+PBS group，high oxygen+5 μg Sunitinib group，high oxygen+25 μg Sunitinib group and high oxygen+125 μg Sunitinib group at 17 days，respectively A-F分別代表空氣對(duì)照組和高氧對(duì)照組于鼠齡12 d、14 d、17 d視網(wǎng)膜鋪片ADP酶染色結(jié)果;G-J分別代表高氧+PBS組、高氧+5 μg舒尼替尼組、高氧+25 μg舒尼替尼組、高氧+125 μg舒尼替尼組于鼠齡17 d視網(wǎng)膜鋪片ADP酶染色結(jié)果

Figure 2 A-F stood for the retina stained with HE of group A to F at 17 days，respectively A-F分別代表A-F組鼠齡17d視網(wǎng)膜HE染色結(jié)果

2.3.2 VEGFR2 mRNA表達(dá)相對(duì)含量的結(jié)果分析A組鼠齡12 d、14 d、17d時(shí)VEGFR2 mRNA表達(dá)量一直處于較低的水平;B組鼠齡12 d時(shí)VEGFR2 mRNA表達(dá)量較A組12 d明顯降低，而14 d、17 d時(shí)其表達(dá)量比A組同時(shí)間點(diǎn)明顯增加。A-F組鼠齡17 d時(shí)VEGFR2 mRNA表達(dá)的具體結(jié)果見表1，由表1可以看出:A、B組17 d時(shí)VEGFR2 mRNA表達(dá)差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)。C、B組17 d時(shí)VEGFR2 mRNA表達(dá)差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05);D、E、F組17 d時(shí)較C組VEGFR2-mRNA表達(dá)量降低，且隨著Sunitinib劑量的增加降低的效果逐漸明顯，17時(shí)C、D、E、F各組間差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(均為P＜0.05)。

表1 各組VEGFR2 mRNA表達(dá)含量Table 1 Expression of VEGFR2 mRNA in each group (xˉ±s)

3 討論

ROP的發(fā)病基礎(chǔ)是視網(wǎng)膜血管發(fā)育不完全，ROP的基本特征為新生血管形成和增生性視網(wǎng)膜病變。但ROP的發(fā)病機(jī)制至今仍未明確，目前很多研究表明ROP的產(chǎn)生與“相對(duì)缺氧”有關(guān)，持續(xù)高濃度氧抑制VEGF的表達(dá)，致使早產(chǎn)兒未發(fā)育成熟的視網(wǎng)膜血管收縮、閉塞，當(dāng)脫離高氧環(huán)境，視網(wǎng)膜組織繼發(fā)處于相對(duì)低氧狀態(tài)，又刺激VEGF表達(dá)增加，導(dǎo)致視網(wǎng)膜大量新生血管形成［2］。國內(nèi)外大量研究表明，血管內(nèi)皮生長因子(vascular endothelial growth factor，VEGF)是目前已知作用最強(qiáng)的促血管生成因子之一，是刺激新生血管形成的最重要的因素，是血管生成的先決條件和基礎(chǔ)［3］。但VEGF是通過與血管內(nèi)皮生長因子受體(vascualr endothelial grwoth factor receptors，VEGFR)結(jié)合才發(fā)揮生物學(xué)效應(yīng)作用的［4］。當(dāng)前已發(fā)現(xiàn)的VEGFR包括fms樣酪氨酸激酶(fms-like tyrosine kinase，flt-1)即VEGFR-1、VEGFR-2、VEGFR-3(flt-4)。此外還有一些相關(guān)受體，如神經(jīng)纖維蛋白(neuropilin-1，2，NRP-1、2)等［5］。其中VEGFR-2為酪氨酸激酶受體，屬于膜受體類，僅存在于血管內(nèi)皮細(xì)胞膜上，是介導(dǎo)VEGF發(fā)揮促有絲分裂、趨化性和血管侵潤作用的主要激酶受體［6-8］。近年來一系列下調(diào)或阻斷VEGF或其受體的藥物和抑制二者結(jié)合發(fā)揮生物學(xué)效應(yīng)的藥物已成為治療ROP等視網(wǎng)膜新生血管性疾病研究的熱點(diǎn)之一。

根據(jù)ROP的國際分類法(ICROP)［9］和臨床多中心研究(cRYo-ROP)［10］，目前ROP的治療以手術(shù)治療為主，藥物治療為輔，常用的冷凝、激光光凝、鞏膜環(huán)扎術(shù)及玻璃體切割術(shù)等雖能有效的控制ROP病變的發(fā)展，保留患者殘存的視力，但手術(shù)治療的并發(fā)癥較多，甚至?xí)淖冄鄄康恼＝Y(jié)構(gòu)。2009年召開的“第2屆國際早產(chǎn)兒視網(wǎng)膜病變(ROP)會(huì)議”提出目前應(yīng)用最廣、療效突出的是抗VEGF藥物貝伐單抗(Avastin)，但對(duì)活動(dòng)性增生性伴附加病變的16眼注射0.6 mg Avastin發(fā)現(xiàn)黃斑裂孔、血管變細(xì)和肝功能異常等并發(fā)癥，且研究表明對(duì)于3期ROP尤其合并其他系統(tǒng)并發(fā)癥時(shí)，單用玻璃體內(nèi)注射Avastin雖比激光治療復(fù)發(fā)更慢、更晚，但不能完全阻止疾病復(fù)發(fā)，仍需聯(lián)合激光治療［11］。因此，尋找一種療效更好、安全性更高的新藥具有重要意義。蘋果酸舒尼替尼(Sunitinib malate，SU11248，Sutent)是一種多靶點(diǎn)小分子酪氨酸激酶抑制劑(tyrosine kinase inhibitor，TKI)，可靶向抑制VEGF-R1、VEGF-R2、VEGFR3和PDGF受體等酪氨酸激酶的活性，通過特異性阻斷這些信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑達(dá)到抗血管生成和抗腫瘤增生的活性［12］。VEGFR在正常組織中表達(dá)甚微，在病理?xiàng)l件下表達(dá)顯著增加［4］，故而以VEGFR為靶點(diǎn)的Sunitinib具有特異性高、不易產(chǎn)生耐受性、毒性小的等優(yōu)點(diǎn)。目前國內(nèi)外關(guān)于Sunitinib的研究大多局限于抗腫瘤領(lǐng)域，Sunitinib已經(jīng)成為抗腫瘤的一線藥物，但在眼科抗視網(wǎng)膜新生血管方面的研究甚少。侯培等［13］研究已經(jīng)證實(shí)了Sunitinib能夠抑制體外培養(yǎng)的視網(wǎng)膜微血管內(nèi)皮細(xì)胞增殖和遷移，這可能是其抑制血管生成的途徑之一，但Sunitinib在體內(nèi)是否亦對(duì)視網(wǎng)膜新生血管有抑制作用，且抑制作用是否呈劑量依賴性仍是值得探討的問題。

鑒于此，本實(shí)驗(yàn)選擇不同劑量的Sunitinib作用于ROP動(dòng)物模型，采用ADP酶視網(wǎng)膜鋪片觀察視網(wǎng)膜血管形態(tài)、視網(wǎng)膜組織病理切片計(jì)數(shù)突破視網(wǎng)膜內(nèi)界膜血管內(nèi)皮細(xì)胞核數(shù)及RT-PCR檢測(cè)視網(wǎng)膜組織VEGF-R2 mRNA表達(dá)的方法，從形態(tài)學(xué)、細(xì)胞學(xué)和基因?qū)W3個(gè)層面來研究Sunitinib對(duì)視網(wǎng)膜新生血管的影響。本研究ADP酶視網(wǎng)膜鋪片結(jié)果顯示，持續(xù)高氧視網(wǎng)膜血管收縮閉塞，相對(duì)缺氧視網(wǎng)膜血管迂曲擴(kuò)張且生成大量新生血管，玻璃體腔內(nèi)注射不同劑量的Sunitinib后視網(wǎng)膜新生血管不同程度減少，且減少的程度隨劑量增加而明顯。視網(wǎng)膜組織病理切片計(jì)數(shù)突破視網(wǎng)膜內(nèi)界膜血管內(nèi)皮細(xì)胞核的結(jié)果顯示，Sunitinib能夠明顯減少突破視網(wǎng)膜內(nèi)界膜血管內(nèi)皮細(xì)胞核的數(shù)目，而且這種抑制作用具有明顯的劑量依賴性。RT-PCR檢測(cè)視網(wǎng)膜組織VEGF-R2 mRNA表達(dá)的結(jié)果顯示，持續(xù)高氧抑制VEGF-R2 mRNA的表達(dá)，相對(duì)缺氧又刺激VEGF-R2 mRNA的表達(dá)，且Sunitinib能夠明顯降低VEGF-R2 mRNA的表達(dá)，其抑制作用同樣具有明顯的劑量依賴性。本研究3種實(shí)驗(yàn)方法技術(shù)成熟，在國內(nèi)外廣泛應(yīng)用，3種方法所得結(jié)論一致，均證實(shí)Sunitinib能夠抑制視網(wǎng)膜新生血管的生成，且其抑制作用具有明顯的劑量依賴性。與目前研究的同類藥物相比，從有效性和安全性總體評(píng)價(jià)，Sunitinib具有明顯優(yōu)勢(shì)。Sunitinib很可能會(huì)成為治療ROP等視網(wǎng)膜新生血管性疾病的一種潛在藥物，但其最佳治療劑量以及臨床應(yīng)用價(jià)值需要更多更廣泛的實(shí)驗(yàn)來確立。

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