基因敲除模型技術(shù)及其在眼科研究中的應(yīng)用現(xiàn)狀△

黃 倞 胡 芳 曾祥云

基因敲除是上世紀(jì)80年代末發(fā)展起來，建立在基因定位整合技術(shù)以及小鼠胚胎干細(xì)胞(embryonic stem cells，ESC)體外培養(yǎng)技術(shù)基礎(chǔ)上的一種新興生物技術(shù)。人類基因組計劃的完成，對于人類自身和其他具有重要學(xué)術(shù)和經(jīng)濟(jì)價值的生物的所有基因進(jìn)行了序列測定。為了進(jìn)一步揭示已測序基因的功能，對所獲大量DNA序列和基因進(jìn)行結(jié)構(gòu)和功能分析已成為人們?nèi)找嬷匾暤膯栴}。基因敲除技術(shù)能通過一定的途徑使機(jī)體特定的基因失活或缺失，從而為人們在動物體內(nèi)分析某一特定基因的功能提供了有力手段。自從1988年人類培育出第一例基因敲除動物模型，揭開基因敲除動物模型建立序幕以來，生命科學(xué)的各個領(lǐng)域、各個學(xué)科基因敲除動物模型都得到了廣泛的應(yīng)用［1］。在發(fā)展迅速的眼科學(xué)基礎(chǔ)研究中，基因敲除小鼠模型的應(yīng)用，對于明確特定基因在眼發(fā)育及維持正常視覺功能中的作用，提供了準(zhǔn)確、高效的研究手段。

1 同源重組基因敲除方法的主要步驟

同源重組作為經(jīng)典的基因敲除理論，是以胚胎干細(xì)胞培養(yǎng)、DNA同源重組(又稱基因打靶-gene targeting)和胚胎移植等手段為基礎(chǔ)的轉(zhuǎn)基因動物技術(shù)［1］。通過將構(gòu)建的重組載體轉(zhuǎn)染入胚胎干細(xì)胞系，從而使目的基因突變，來制作所需的基因敲除動物模型。直到現(xiàn)在，運(yùn)用基因同源重組進(jìn)行基因敲除，依然是構(gòu)建基因敲除動物模型中最普遍的使用方法。

1.1 重組載體的構(gòu)建 在設(shè)計重組載體時，通常把目的基因和與細(xì)胞內(nèi)靶基因特異片段同源的DNA分子重組到帶有標(biāo)記基因(如Neo基因、TK基因等)的載體上［2］，成為重組載體。由于基因敲除模型的建立，通常是為了使某一基因失去其生理功能，以觀察所造成的表型變化，所以一般設(shè)計為替換型載體［2-3］。

1.2 制備ESC ESC可以在體外增殖并維持多潛能未分化的狀態(tài)，有利于各種體外操作，并具有發(fā)育成胚系各種組織的能力。目前的基因敲除技術(shù)一般采用鼠ESC，常用的鼠種系是129及其雜合體，因?yàn)檫@類小鼠具有自發(fā)突變形成畸胎瘤和畸胎肉瘤的傾向，是基因敲除的理想實(shí)驗(yàn)動物。同時具有其他遺傳背景的ESC系也逐漸被發(fā)展并應(yīng)用于基因敲除過程中［4-6］。

1.3 同源重組及篩選 在完成對重組載體和ESC的制備之后，將重組載體通過電穿孔或顯微注射的方法導(dǎo)入同源ESC中［7］，使外源DNA與ESC基因組中相對應(yīng)部分發(fā)生同源重組，將重組載體中的DNA序列整合入內(nèi)源基因組中，從而得以表達(dá)。由于基因同源重組自然發(fā)生率極低，動物的重組概率約為0.01%～1.00%。因此，如何篩選真正發(fā)生同源重組的ESC非常重要。目前常用的方法是正負(fù)篩選(positive-negative-selection，PNS)法、標(biāo)記基因的特異位點(diǎn)表達(dá)法以及PCR法。其中應(yīng)用最多的是PNS法［8］，該方法中所設(shè)計的載體包含10～15 kb大小的靶基因同源片斷，一個新霉素抗性基因(neomycin resistant gene，Neor)插入到載體同源序列內(nèi)的一個外顯子中部，作為正選擇標(biāo)記;同時在同源區(qū)外插入一個單純皰疹病毒胸苷激酶基因(HSV-tk)作為負(fù)選擇標(biāo)記。載體中插入 Neor基因的主要目的是打斷靶基因的編碼序列，整合重組細(xì)胞的一個選擇標(biāo)記。因Neor基因所攜帶的氨基糖苷磷酸轉(zhuǎn)移酶活性，能夠使其在G418選擇性培養(yǎng)基中耐受成活，反之，沒有重組進(jìn)Neor基因的ESC則在選擇性培養(yǎng)基中死亡而淘汰。HSV-tk基因位于打靶載體的同源序列與非同源序列之間，反向選擇是根據(jù)同源重組發(fā)生時，同源片段末段將被切除而發(fā)生隨機(jī)整合時，由于HSV-tk基因的存在而使ESC被殺死，通過這種雙向選擇的方法可使同源重組的篩選效率最高提高2 000倍。

1.4 制成動物模型 將通過標(biāo)記基因篩選出的發(fā)生同源重組的ESC在體外進(jìn)行擴(kuò)增。再將帶有此ESC的囊胚移植入假孕鼠的子宮內(nèi)，發(fā)育成一個嵌合體(Chimera)。由于同源重組常常發(fā)生在一對染色體中的一條染色體上，因此為了使外源基因純合，必需進(jìn)一步經(jīng)過至少2代的雜交傳代，以得到穩(wěn)定遺傳的純合體基因敲除模型，觀察目的基因變化前后對小鼠生物學(xué)性狀的影響［9］。

2 基因敲除技術(shù)在眼科的應(yīng)用

利用上述方法人為的定點(diǎn)修飾、改造基因組中某些基因的結(jié)構(gòu)和組成，并使之在動物個體水平上得以表現(xiàn)和傳遞，為眼科研究特定基因的功能及相關(guān)疾病發(fā)病機(jī)制提供了有效的分子水平研究平臺，同時為許多眼科疾病的基因治療提供了實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)。

2.1 眼發(fā)育研究中的應(yīng)用 以視網(wǎng)膜為例，我們已知視網(wǎng)膜主要由6種神經(jīng)細(xì)胞和一種膠質(zhì)細(xì)胞組成，并且這些細(xì)胞類型均由視網(wǎng)膜祖細(xì)胞按照固定的順序發(fā)育分化而來，并在視網(wǎng)膜的固定層間形成固定的排列。在這一系列復(fù)雜的發(fā)育分化過程中，存在著大量的基因調(diào)控過程，憑借動物基因敲除模型，越來越多的相關(guān)基因功能被發(fā)現(xiàn)。如在視網(wǎng)膜發(fā)育初期，bHLH族轉(zhuǎn)錄因子Hes1和Hes5作為關(guān)鍵調(diào)控因子直接控制著視網(wǎng)膜祖細(xì)胞的數(shù)量和增殖狀態(tài)［10-12］，為視網(wǎng)膜發(fā)育過程中出現(xiàn)足夠的細(xì)胞數(shù)量和豐富的細(xì)胞類型提供保證［13］。而bHLH族基因Mash1和Math3以及同源結(jié)構(gòu)域基因Chx10為雙極細(xì)胞發(fā)育過程中所必需，其中Mash1和Math3的存在使祖細(xì)胞接受雙極細(xì)胞命運(yùn)分化為雙極細(xì)胞，而Chx10則決定雙極細(xì)胞在視網(wǎng)膜中的特定層間形成固定的排列［13-14］。國外眾多學(xué)者研究發(fā)現(xiàn)，bHLH族基因Math3和NeuroD這2種基因缺失時會造成無長突細(xì)胞選擇性地減少［15-17］。Inoue等［18］最新的研究發(fā)現(xiàn)，HIPK基因家族成員與眼球的發(fā)育密切相關(guān)，在利用基因敲除技術(shù)使 HIPK基因家族成員Hipk1和Hipk2失活之后，發(fā)現(xiàn)在眼發(fā)育過程中，眼球尺寸整體變小，晶狀體和視網(wǎng)膜的層次結(jié)構(gòu)發(fā)育異常。證明HIPK基因家族在眼發(fā)育后期的正?；钚允茄矍蛘０l(fā)育的重要因素。Xu等［19］在研究視網(wǎng)膜神經(jīng)節(jié)細(xì)胞發(fā)育的過程中，利用CD3zeta基因敲除小鼠，觀察到當(dāng)CD3zeta基因缺失時，視網(wǎng)膜神經(jīng)節(jié)細(xì)胞的突觸發(fā)育發(fā)生明顯障礙，具體表現(xiàn)為神經(jīng)節(jié)細(xì)胞的樹突數(shù)量減少、密度增加，以及一種由谷氨酸介導(dǎo)的選擇性突觸的活性消失。說明CD3zeta基因在視網(wǎng)膜神經(jīng)節(jié)細(xì)胞樹突發(fā)育及進(jìn)行正常的生理性信息轉(zhuǎn)導(dǎo)過程中具有重要的作用。在針對感光細(xì)胞的研究中，Katoh等［20］研究發(fā)現(xiàn)，為了保證在視網(wǎng)膜發(fā)育過程中感光細(xì)胞能夠正常地發(fā)育分化，鋅指轉(zhuǎn)錄因子家族成員Blimp1通過抑制雙極細(xì)胞命運(yùn)選擇基因Chx10的活性，而保證視網(wǎng)膜祖細(xì)胞向感光細(xì)胞方向分化。以上的研究成果無一不是通過基因敲除技術(shù)建立突變動物模型而成功的，可見基因敲除技術(shù)已越來越成為眼科分子水平基礎(chǔ)研究中不可或缺的研究平臺。

2.2 眼科臨床研究中的應(yīng)用 基因敲除技術(shù)不僅在眼科基礎(chǔ)研究中發(fā)揮了重要的作用，而且在與眼科臨床疾病相關(guān)的基因診斷和治療中，基因敲除模型仍具有十分廣泛的應(yīng)用。

2.2.1 眼科遺傳病研究 在近期關(guān)于眼遺傳病的研究中，Boye等［21］利用鳥苷酸環(huán)化酶-1基因敲除小鼠模型研究GC1基因與萊伯先天性黑矇的發(fā)病密切相關(guān)。當(dāng)GC1基因缺失時，小鼠出現(xiàn)與萊伯先天性黑矇相似的視錐細(xì)胞的嚴(yán)重?fù)p害;而利用病毒載體使GC1基因持續(xù)性過表達(dá)時，可以使已受損的視錐細(xì)胞功能得到部分的恢復(fù)。為這種遺傳性疾病的治療提供了新的思路。在另一種棘手的遺傳性眼病-視網(wǎng)膜色素變性的研究中，Budzynski等［22］發(fā)現(xiàn)視紫紅質(zhì)的基因突變會造成常染色體顯性遺傳的視網(wǎng)膜色素變性。在其構(gòu)建的2種視紫紅質(zhì)基因敲除小鼠模型中，觀察到視紫紅質(zhì)基因Y102H和I307N缺失時，會造成光誘導(dǎo)性的視網(wǎng)膜色素變性。這些動物模型將成為研究視紫紅質(zhì)誘導(dǎo)的視網(wǎng)膜色素變性的發(fā)病機(jī)制和治療方案的重要工具。

2.2.2 眼表疾病研究 Lu等［23］在研究影響角膜上皮外傷后愈合的影響因素時，應(yīng)用基因敲除技術(shù)制作了Plk3基因敲除小鼠，研究該基因在影響角膜上皮愈合時的作用，結(jié)果發(fā)現(xiàn)Plk3基因的缺失將嚴(yán)重延遲角膜上皮損傷后的愈合，并且是缺氧條件下細(xì)胞數(shù)量增生緩慢的重要原因之一。

2.2.3 葡萄膜炎相關(guān)研究 葡萄膜炎的病因和治療一直是臨床眼科的難題之一。Sonoda等［24］在研究自身免疫性葡萄膜炎的發(fā)病機(jī)制時，在小鼠模型中應(yīng)用基因敲除技術(shù)，觀察到當(dāng)CCR2基因缺失、巨噬細(xì)胞數(shù)量大量減少時，中性粒細(xì)胞取而代之并大量增加，最終將導(dǎo)致感光細(xì)胞內(nèi)的視黃醇結(jié)合蛋白肽的免疫反應(yīng)形成以中性粒細(xì)胞為主的葡萄膜炎。為葡萄膜炎發(fā)病機(jī)制的研究提供了新的相關(guān)治病基因。

2.2.4 視網(wǎng)膜血管性疾病 隨著生活水平的提高，視網(wǎng)膜血管性疾病已成為眼底疾病的主要組成部分。Yanni等［25］在研究視網(wǎng)膜Müller膠質(zhì)細(xì)胞時，發(fā)現(xiàn)作為視網(wǎng)膜血管性疾病致病因子血管內(nèi)皮生長因子的主要來源，Müller細(xì)胞所釋放的血管內(nèi)皮生長因子產(chǎn)物受到COX-2基因的調(diào)控。當(dāng)使用缺氧條件誘導(dǎo)血管內(nèi)皮因子的產(chǎn)生時，COX-2基因敲除小鼠由于COX-2基因的失活，觀察發(fā)現(xiàn)產(chǎn)生血管內(nèi)皮生長因子明顯減少。說明至少有部分血管內(nèi)皮生長因子是COX-2基因依賴性的，為許多視網(wǎng)膜血管性疾病的基因治療提供了新的思路。Zheng等［26］根據(jù)糖尿病視網(wǎng)膜病變中氨基丁酸的活性主要是視網(wǎng)膜小動脈松弛，從而增加視網(wǎng)膜血流量、氨基丁酸活性受到明顯抑制。利用基因敲除技術(shù)，制作了氨基丁酸受體rho-1基因突變小鼠。觀察到rho-1在維持視網(wǎng)膜神經(jīng)遞質(zhì)的穩(wěn)態(tài)平衡中發(fā)揮著重要的作用，并且在缺失時會造成視網(wǎng)膜血管發(fā)生類似于缺氧狀態(tài)下的通透性增加的病理變化。

2.2.5 全身性疾病的眼部研究 在關(guān)于全身性疾病對眼部影響的最新研究中，Westfall等［27］利用基因敲除小鼠模型，最新觀察發(fā)現(xiàn)茹貝爾綜合征的治病基因Ahi1，當(dāng)該基因缺失時會造成視網(wǎng)膜感光細(xì)胞變性，從而嚴(yán)重影響視功能。

由此可見由基因敲除技術(shù)所制作的基因敲除動物模型的應(yīng)用，對眼科基礎(chǔ)研究和臨床治療的發(fā)展都起到了巨大的推動作用。

3 基因敲除技術(shù)的應(yīng)用前景

3.1 建立生物模型、研究基因功能 基因敲除技術(shù)的最直接作用仍然表現(xiàn)在對基因功能研究中的生物模型建立上?；蚯贸夹g(shù)的優(yōu)勢在于可以建立某種特定基因缺失的生物模型，從而進(jìn)行針對性較強(qiáng)的特定研究。這些特定的研究目標(biāo)可以是細(xì)胞，也可以是完整的動植物或微生物個體。

3.2 為人類疾病研究服務(wù) 在利用生物模型對相關(guān)基因在其他生物體中的功能明確之后，人類疾病的發(fā)病機(jī)制和基因治療研究便有了可以借鑒的理論依據(jù)。通過基因敲除技術(shù)研究特定基因的性質(zhì)以及對機(jī)體的影響，對了解疾病的根源或是尋找基因治療的靶目標(biāo)都具有重大的意義。同時在進(jìn)行人類器官移植時，基因敲除技術(shù)可以將特定的免疫因子去除或替換，從而使同異源器官移植過程中產(chǎn)生的免疫排異反應(yīng)降到最低，從而大幅提高各種器官移植手術(shù)的成功率。而且通過基因敲除技術(shù)，不僅僅能夠降低現(xiàn)有生物品種器官移植的排異，還能夠?qū)ι矬w進(jìn)行定向改造，為培育出新型生物器官以緩解目前的移植供體缺陷提供了重要的技術(shù)支持，是遺傳工程的重大飛躍。

隨著基因敲除技術(shù)的不斷完善發(fā)展，早期的許多不足和缺陷都已經(jīng)解決，但仍然存在著一些難以克服的缺點(diǎn)。首先敲除掉一個基因所獲取的表型改變，并不一定就是該基因功能的準(zhǔn)確體現(xiàn)，其原因包括:(1)許多基因家族中成員在功能上是相互聯(lián)系、共同作用的，敲掉其中一個基因，有可能引起基因家族中其他成員的代償反應(yīng)，由于基因功能的相近，可能造成不容易識別的表型;(2)針對一些必需基因的研究，在敲除后會造成細(xì)胞的致死性，也就無法對這些必需基因進(jìn)行相應(yīng)的研究了;(3)由于制作基因敲除小鼠時，采用的動物種系的遺傳背景不同，也可能影響到基因敲除后表型的變化。

總之，基因敲除技術(shù)是一項(xiàng)十分有前途的技術(shù)。隨著基因敲除動物模型建立方法的進(jìn)一步完善，基因敲除技術(shù)將更加廣泛、有效的在基因功能研究和基因突變、染色體畸變與疾病的關(guān)系等領(lǐng)域發(fā)揮重要的作用。

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