曹 焱 戴偉男 戴鳳海
(1.黑龍江林業(yè)科學研究所,哈爾濱 150081;2.黑龍江省林木種苗管理總站,哈爾濱 150090)
紅松(Pinuskoraiensis)合子胚愈傷組織誘導是紅松離體再生研究的前期準備,也是通過體細胞胚胎發(fā)生途徑進行植株再生的重要基礎(chǔ)。筆者經(jīng)過大量試驗,誘導出形態(tài)各異的紅松愈傷組織,可旺盛增殖,但絕大多數(shù)最終不能分化出具有胚性感受態(tài)的細胞組織,因此有效愈傷組織的增殖與更新則成為針葉樹體細胞胚胎發(fā)生的一個關(guān)鍵環(huán)節(jié)[1]。根據(jù)Arm strong標準將得到的愈傷組織分為3類:I型,結(jié)構(gòu)致密、復(fù)雜多樣、生長緩慢,通過器官發(fā)生途徑分化芽和根,產(chǎn)生胚狀體較少,不易長期繼代;Ⅱ型,結(jié)構(gòu)松散、易碎、呈顆粒狀、生長較快,長期繼代仍有胚性,能通過胚狀體途徑再生;Ⅲ型,結(jié)構(gòu)粘軟、水浸狀、白色透明或半透明,容易繼代培養(yǎng),但幾乎喪失分化能力,為非胚性愈傷組織[2]。試驗中,我們根據(jù)Arm strongⅡ型愈傷組織的標準,來辨識哪些是有效愈傷組織,并對此進行繼代培養(yǎng)。
取紅松成熟種子,采種地點為黑龍江省哈爾濱市阿城區(qū)小嶺林場。紅松人工林樹齡30a左右,現(xiàn)已結(jié)實7a。采種后置于4℃冰箱低溫保存4周后進行接種。
1.2.1 接種前材料處理
接種完整外植體前,將滅菌后的合子胚分別放置于蔗糖溶液(10、20、30、50、70g·L-1)、PEG 6000(50、70、100、200、450 g·L-1)、甘露醇水溶液(0.5、1、2、4、8mmol·L-1)浸泡處理24h后接種。比較不同處理對愈傷組織誘導的影響。
1.2.2 培養(yǎng)基中不同蔗糖濃度處理
其他條件不變,取愈傷組織小塊置于蔗糖濃度分別為1%、2%、3%、4%、5%的培養(yǎng)基中。觀察不同蔗糖濃度對愈傷組織增殖的影響。
1.2.3 添加ABA、PEG、甘露醇處理
在紅松愈傷組織增殖培養(yǎng)階段,研究ABA、PEG 6000和甘露醇對愈傷組織及有效愈傷組織增殖的影響。分別添加1、3、5、10、25g·L-1ABA;10、15、20、40、70 g·L-1PEG 6000;0.5、1、2、5、10g·L-1甘露醇。
所有處理均設(shè)3次重復(fù),每個培養(yǎng)皿3~10個外植體,室溫23~25℃,濕度大于60%。暗培養(yǎng)。4~6周繼代一次。
1.2.4 數(shù)據(jù)獲得及統(tǒng)計分析方法
試驗中獲得的各種愈傷組織均用解剖鏡觀察外部形態(tài),并記錄、拍照。試驗數(shù)據(jù)采用Excel 和SPSS軟件進行方差分析和差異顯著性檢驗。
接種之前,將滅菌后的完整胚分別置于各濃度的甘露醇溶液(M)、PEG 6000溶液(PEG)和蔗糖溶液(Su)中,浸泡24h后,取出外植體均接種于LM基本培養(yǎng)基添加2mg·L-12,4-D、0.5mg·L-16-BA、0.5mg·L-1TDZ。起初的2周內(nèi)外植體無愈傷組織產(chǎn)生,整個外植體變白并膨大,15d后逐漸產(chǎn)生愈傷組織,形態(tài)多為疏松水漬狀,無色透明或半透明。45d愈傷大量分化,在沒更換培養(yǎng)基的情況下,60d仍能保持鮮活的狀態(tài),褐化率極低。據(jù)此推斷,經(jīng)過甘露醇、PEG 6000和蔗糖溶液處理的合子胚,其表面或內(nèi)部細胞在外部物質(zhì)的刺激下排列上發(fā)生變化,可以使得外植體幾乎處在同一時間脫分化,并在很大程度上減少了褐化率,放慢了褐化速度。后期培養(yǎng)發(fā)現(xiàn),甘露醇處理好于PEG 6000和蔗糖溶液處理。綜合得出:對外植體進行甘露醇、PEG 6000和蔗糖溶液浸泡處理,均可以明顯提高愈傷組織的初始分化率和誘導量,并可以相對長時期保持愈傷組織的旺盛分化能力。
蔗糖濃度不只對細胞增殖起作用,同時也是影響細胞分化的因素之一。將產(chǎn)生的紅松愈傷組織分小塊(直徑0.5~1cm)接種于添加0.5mg·L-12,4-D、0.2mg·L-16-BA的LM培養(yǎng)基中,分為1%、2%、3%、4%、5%的蔗糖濃度,以蔗糖濃度為3%的處理作為對照,繼代30d左右觀察增殖效果,試驗結(jié)果如圖1。不同蔗糖濃度對有效愈傷組織的增殖和保持能力不同,但差異不顯著(p<0.05),說明蔗糖濃度對有效愈傷的增殖率影響不大。從增殖出的有效愈傷組織的外部形態(tài)來看:蔗糖濃度3%的處理產(chǎn)生的愈傷組織為淺黃色疏松、鮮活狀,有的還產(chǎn)生瘤狀小凸起,分化比較旺盛;蔗糖濃度在1%、2%時,表面產(chǎn)生細胞顆?;蚪q毛狀細胞,這是營養(yǎng)供應(yīng)較差、碳源供應(yīng)不足的表現(xiàn);蔗糖濃度在4%時增殖率偏低,原有愈傷組織轉(zhuǎn)變?yōu)閳F塊狀并且開始干燥,表明此種滲透壓過大,培養(yǎng)物吸收營養(yǎng)物質(zhì)較為困難;蔗糖濃度在5%時,原愈傷組織褐化后重新分化出具有鮮活特性的有效愈傷組織,這表明在愈傷組織受到高滲透壓脅迫時,褐化的愈傷組織內(nèi)部聚集了一定的活性物質(zhì),通過能量的轉(zhuǎn)化后產(chǎn)生新的有效愈傷組織,但這種變化發(fā)生的頻率較低。高滲透壓下外植體新陳代謝加快,導致大部分的愈傷組織褐化死亡。綜合看來,蔗糖濃度為3%的培養(yǎng)基對有效愈傷的增殖比較穩(wěn)定。
ABA、PEG 6000和甘露醇被認為具有促進胚性愈傷組織誘導和增殖的作用,可以延緩甚至減少外植體所受脅迫的危害。以LM為基本培養(yǎng)基,不添加其他激素,將誘導出的愈傷組織分別繼代于添加1、3、5、10、25 g·L-1ABA,10、15、20、40、70g·L-1PEG 6000,0.5、1、2、5、10g·L-1甘露醇的各處理中,空白LM培養(yǎng)基作為對照,繼代30d后觀察增殖效果。
對照的有效愈傷增殖率為6.5%±4.2%。圖2~圖4分別顯示了添加不同活性物質(zhì)后對有效愈傷組織增殖的作用效果。從圖中可明顯看到,添加了5g·L-1ABA的處理與對照及其他處理差異極顯著(p<0.01),有效愈傷增殖率也為所有處理中最高,這表明5g·L-1ABA為較適宜的濃度。PEG 6000在10、15g·L-1時與對照差異顯著(p<0.05),有效愈傷增殖率達到25%~26%,隨著PEG 6000濃度逐漸升高,有效愈傷組織增殖率急速下降,這表明PEG 6000濃度偏大,不適宜有效愈傷的誘導增殖,建議選在PEG 6000濃度為10~15g·L-1時增殖效果較好。甘露醇在0.5g·L-1時有效愈傷增殖率為顯著水平(p<0.05),隨著濃度逐漸升高,先是急速下降,而后緩步上升,并趨近平穩(wěn),這表明應(yīng)加入低濃度的甘露醇促進有效愈傷的增殖。
本試驗中經(jīng)過蔗糖溶液、PEG 6000和甘露醇浸泡處理24 h的合子胚,在誘導過程中顯示出了不易褐化并且旺盛分化的效果。試驗中三種處理的外植體誘導率都達到了相當高的水平,說明經(jīng)過處理的外植體其表面或內(nèi)部結(jié)構(gòu)發(fā)生了變化,對外界的刺激變得敏感,有利于愈傷組織的誘導。但到繼代培養(yǎng)的后期,愈傷組織雖增殖迅速,卻未見胚狀體的發(fā)生,因此對其是否能促進胚性愈傷組織的發(fā)生還需繼續(xù)探索。
在植物組織培養(yǎng)中蔗糖能支持大多數(shù)離體培養(yǎng)物的旺盛的生長,以至大多數(shù)合成培養(yǎng)基均以蔗糖作為唯一的碳源。因此,蔗糖的用量不僅影響培養(yǎng)物生長的速度和生長量,而且影響其代謝水平,次生代謝物的合成以及細胞形態(tài)和發(fā)生,是影響植物組織培養(yǎng)成功的關(guān)鍵[3]。本研究表明,當蔗糖濃度為2%時,有效愈傷組織誘導率最高,但有效愈傷組織不容易保持,容易在表面產(chǎn)生絨毛狀細胞;當蔗糖濃度高達5%時,在一定的培養(yǎng)時間內(nèi)有效愈傷組織迅速增加,培養(yǎng)基中營養(yǎng)元素耗費加速,外植體新陳代謝加快,從而導致培養(yǎng)物迅速褐化;而當蔗糖濃度在3%時,有效培養(yǎng)物可保持較長時間,并不斷分化。由此可見,蔗糖濃度對提高有效愈傷組織的誘導頻率以及形成高質(zhì)量的培養(yǎng)物尤為關(guān)鍵。
本試驗中,添加了5g·L-1ABA的增殖培養(yǎng)基產(chǎn)生的有效愈傷達到極顯著水平,說明ABA可以促進有效愈傷組織的產(chǎn)生。PEG在10~15g·L-1的范圍也與其他濃度的誘導率達到顯著水平。之前曾說PEG有促進愈傷組織分化、刺激細胞生長、調(diào)節(jié)細胞狀態(tài)等優(yōu)點,本試驗的結(jié)果驗證了這一理論。甘露醇只在0.5g·L-1的水平下,有效愈傷增殖達到了顯著水平。這表明,在愈傷組織的增殖培養(yǎng)中,添加適當濃度的具有調(diào)節(jié)細胞勢、滲透壓等的物質(zhì)可提高愈傷組織的增殖率。
接種紅松成熟合子胚之前,用蔗糖、PEG、甘露醇等高滲透壓的物質(zhì)浸泡種子更有利于愈傷組織的誘導以及使產(chǎn)生的愈傷組織活性延長。紅松有效愈傷組織增殖階段,蔗糖濃度與一般樹種對碳水化合物的需求基本相同,最佳為3%;在培養(yǎng)基中加入適量的高滲透壓物質(zhì),可以促進紅松有效愈傷組織的增殖。
[1]王偉達,李成浩,楊靜莉,張含國.不同植物生長調(diào)節(jié)物質(zhì)對雜種落葉松胚性愈傷組織增殖的影響[J].東北林業(yè)大學學報,2008,(9):5~7.
[2]曹昆,李霞.木本植物組織培養(yǎng)不定芽誘導研究[J].江蘇林業(yè)科技,2008,(10):43~48.
[3]Flowler MW, Wastson Rlyons. In Proc.5th Ind. Cong[M].Plant Tissue and Cell Culture,1982:225~228.