高效液相-紫外檢測(cè)法測(cè)定當(dāng)歸中藁本內(nèi)酯含量

李 平, 李榆梅

(山西生物應(yīng)用職業(yè)技術(shù)學(xué)院生物制藥工程系, 太原 030031)

當(dāng)歸為傘形科(Umbelliferae)植物當(dāng)歸 Angelica sinensis(Oliv.)Diels的干燥根,入肝、心 、脾經(jīng) ,藥性甘、辛、溫,具有補(bǔ)血活血、祛瘀、調(diào)經(jīng)止痛、潤(rùn)燥滑腸之功效,用于月經(jīng)不調(diào)、貧血、經(jīng)閉、痛經(jīng)、崩漏等[1]。當(dāng)歸為臨床使用頻率最高的中藥之一,素有“十方九歸”之說(shuō)。國(guó)內(nèi)外許多學(xué)者對(duì)當(dāng)歸的化學(xué)成分、藥理作用以及臨床應(yīng)用均進(jìn)行了較為詳細(xì)的研究,當(dāng)歸中含有苯酞類、萜類、芳香族化合物等成分[2-5]。

當(dāng)歸對(duì)子宮具有興奮和抑制“雙向性”作用,其興奮活性物質(zhì)為水溶性或醇溶性的非揮發(fā)性物質(zhì),抑制活性物質(zhì)主要為其揮發(fā)油中的藁本內(nèi)酯(ligustilide)[6,7]。藁本內(nèi)酯對(duì)兔離體子宮,無(wú)論早孕或未孕均有明顯抑制作用,表現(xiàn)為張力下降、節(jié)律變慢、收縮力減弱,幾分鐘后完全松弛,作用時(shí)間持久[8,9]。因此對(duì)當(dāng)歸中藁本內(nèi)酯的含量進(jìn)行控制是非常必要的。但在現(xiàn)有文獻(xiàn)中,藁本內(nèi)酯的含量測(cè)定方法多采用氣相色譜法,但氣相色譜設(shè)備不普及,此外操作復(fù)雜,實(shí)驗(yàn)成本高,因此本文探索以更常用的高效液相法檢測(cè)當(dāng)歸中藁本內(nèi)酯的含量。

1 儀器與試藥

1.1 儀器 AL204型電子天平(瑞士 Mettler Toledo),UV-2102PCS型分光光度計(jì)(上海 Unico),LC-10ATvp高效液相色譜儀(日本島津公司),KQ250DB型數(shù)控超聲波清洗器(昆山市超聲儀器有限公司),arium 611UF超純水純化系統(tǒng)(德國(guó)賽多利斯公司),PZB-5韋氏比重秤(上海東方科技有限公司)。

1.2 材料與試劑 Hypersil ODS2柱(4.6 mm×200 mm,5μm)(大連依利特分析儀器有限公司),當(dāng)歸藥材(上海華宇藥業(yè)股份有限公司,產(chǎn)地:甘肅)。甲醇、乙腈為色譜純(Merck公司),其他試劑均為分析純。藁本內(nèi)酯對(duì)照品由本實(shí)驗(yàn)室分離制得,經(jīng)氣相色譜面積歸一化法測(cè)定,藁本內(nèi)酯含量為98.3%(g/g)。

2 方法與結(jié)果

2.1 對(duì)照品溶液的配制 精密稱取藁本內(nèi)酯對(duì)照品 11.3 mg,置 50 ml量瓶中,加甲醇溶解并稀釋至刻度,搖勻,為對(duì)照品溶液(Ⅰ),濃度為0.226 mg/ml;精密吸取對(duì)照品溶液(Ⅰ)0.5 ml,置于 100 ml量瓶中,以甲醇稀釋至刻度,作為對(duì)照品溶液(Ⅱ),濃度為0.001 13 mg/ml。

2.2 檢測(cè)波長(zhǎng)的選擇 配制一定濃度的藁本內(nèi)酯甲醇溶液,以甲醇為空白,在 200-450 nm范圍內(nèi)進(jìn)行紫外光譜掃描,確定檢測(cè)波長(zhǎng)為350 nm。

2.3 色譜條件 Hypersil ODS2柱(4.6 mm×200 mm,5 μm);紫外檢測(cè)器 ;乙腈-水 (80∶20)為流動(dòng)相,流速 1 ml/min,洗脫 30 min。

2.4 系統(tǒng)適應(yīng)性試驗(yàn) 用十八烷基硅烷鍵合硅膠為填充劑,乙腈-水(80∶20)為流動(dòng)相,檢測(cè)波長(zhǎng)為350 nm,色譜柱理論塔板數(shù)以藁本內(nèi)酯計(jì)算為10 350,拖尾因子為1.021,色譜峰對(duì)稱性良好,藁本內(nèi)酯與其他峰的分離度符合要求,保留時(shí)間為14.067 min,見圖1。

圖1 藁本內(nèi)酯高效液相色譜圖Fig 1 The high performance liquid chromatogram of ligustilide

2.5 線性關(guān)系考察 取對(duì)照品溶液(Ⅰ)2,10μl,對(duì)照品溶液(Ⅱ)4,12,40μl,分別注入液相色譜儀,進(jìn)樣分析,記錄峰面積。以進(jìn)樣量(ng)為橫坐標(biāo),峰面積 A為縱坐標(biāo),繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線,進(jìn)行回歸分析,回歸方程為A=165 4X+494,r=0.999 9,結(jié)果見圖2。結(jié)果表明,藁本內(nèi)酯在 0-2.26μg的范圍內(nèi),進(jìn)樣量與其峰面積呈良好的線性關(guān)系。

圖2 藁本內(nèi)酯標(biāo)準(zhǔn)曲線Fig 2 Calibration curve of ligustilide

2.6 精密度試驗(yàn) 取對(duì)照品溶液Ⅰ,進(jìn)樣 10μl,連續(xù)進(jìn)樣 6次,計(jì)算平均峰面積及其相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差,結(jié)果見表1。說(shuō)明該法精密度良好。

表1 藁本內(nèi)酯精密度試驗(yàn)Tab 1 The results of precision test

2.7 供試品溶液的穩(wěn)定性試驗(yàn) 取粉碎過(guò) 80目篩的當(dāng)歸藥材粉末 0.01 g,精密稱定,置 10 ml量瓶中,超聲 30 min,加甲醇稀釋至刻度,搖勻,作為供試品溶液;取供試品溶液分別于 0,1,2,4,6,12 h進(jìn)樣分析,記錄峰面積,觀察供試品溶液的放置穩(wěn)定性,結(jié)果見表2。結(jié)果表明,供試品溶液在 12 h內(nèi) RSD小于 2%,基本保持穩(wěn)定。

表2 供試品溶液的穩(wěn)定性試驗(yàn)Tab 2 The results of stability test

2.8 重復(fù)性試驗(yàn) 取同一批號(hào)的當(dāng)歸藥材共 6份,精密稱定,分別以甲醇超聲提取 30 min,濾過(guò),將濾液進(jìn)樣分析,結(jié)果見表3。結(jié)果表明,本方法重復(fù)性良好。

表3 重復(fù)性試驗(yàn)Tab 3 The results of repeatability test

2.9 加樣回收率試驗(yàn) 取同一批號(hào)的當(dāng)歸藥材,共6份,精密稱定,置 10 ml量瓶中,超聲 30 min,加甲醇稀釋至刻度,搖勻,作為供試品溶液,測(cè)定含量;分別精密加入濃度為0.049 42 mg/ml的對(duì)照品溶液 2 ml,3 ml和濃度為0.098 83 mg/ml的對(duì)照品溶液 2 ml,進(jìn)行加樣回收率的測(cè)定。結(jié)果表明該方法的準(zhǔn)確度良好,見表4。

表4 回收率試驗(yàn)Tab 4 The results of recovery test

2.10 藁本內(nèi)酯最低檢測(cè)限及最低定量限的確定取藁本內(nèi)酯對(duì)照品溶液,經(jīng)多次稀釋后進(jìn)樣分析,最后按信噪比 S/N≥3確定藁本內(nèi)酯的最低檢測(cè)限為0.002 47μg;按信噪比 S/N≥10確定藁本內(nèi)酯的最低定量限為4.52 ng。

2.11 當(dāng)歸中藁本內(nèi)酯的含量測(cè)定 取粉碎過(guò) 80目篩的當(dāng)歸藥材粉末 0.01 g,精密稱定,置 10 ml量瓶中,超聲 30 min,加甲醇稀釋至刻度,搖勻,作為供試品溶液;另取藁本內(nèi)酯對(duì)照品適量,加甲醇制成0.001 mg/ml的對(duì)照品溶液,分別吸取供試品溶液和對(duì)照品溶液各 10μl,按高效液相色譜法進(jìn)樣測(cè)定,按外標(biāo)法以峰面積計(jì)算含量,藁本內(nèi)酯的含量分別為1.70%(g/g)、1.66%(g/g)、1.64%(g/g)。

3 討論

文獻(xiàn)報(bào)道的有采用氣相色譜-質(zhì)譜法、雙波長(zhǎng)薄層掃描法測(cè)定當(dāng)歸中藁本內(nèi)酯的含量,而在實(shí)際研究工作中,氣相色譜儀的普及率遠(yuǎn)不及液相色譜儀。因此本文探索建立高效液相色譜法測(cè)定藁本內(nèi)酯含量。在色譜條件選擇過(guò)程中,比較了 C8柱與C18柱,最終確定了對(duì)樣品分離較好的C18柱;檢測(cè)器比較了示差、蒸發(fā)光散射、紫外檢測(cè)器,最終確定選用較通用的紫外檢測(cè)器;在流動(dòng)相的選擇中,比較了不同比例的甲醇-水及乙腈-水系統(tǒng)。確定了乙腈-水(80∶20)為流動(dòng)相,流速 1 ml/min,洗脫 30 min。在該體系下,藁本內(nèi)酯色譜峰峰形好,柱效高,甲醇溶劑不干擾測(cè)定,樣品中藁本內(nèi)酯與其他峰的分離度符合要求,定量準(zhǔn)確。經(jīng)方法學(xué)考察結(jié)果表明,本法符合藥典規(guī)定,靈敏度高,精密度好,可為含有藁本內(nèi)酯的藥材或制劑的質(zhì)量控制提供依據(jù)。

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