紅花黃色素氯化鈉注射液細菌內毒素檢查方法的建立

段陳平, 劉 芳, 高天紅

(1山西華輝凱德制藥有限公司, 晉中 030600; 2山西省藥品檢驗所)

紅花黃色素氯化鈉注射液用于治療冠心病穩(wěn)定型勞累性心絞痛的有效藥物,現(xiàn)參照文獻[2-4],按照《中國藥典》2005年版一部附錄ⅩⅢ D細菌內毒素檢查法[1]及附錄ⅩⅧ B中藥注射劑安全性檢查指導原則[1],研究紅花黃色素氯化鈉注射液對細菌內毒素試驗的干擾情況,建立其細菌內毒素限量檢查的方法。

1 試藥與儀器

紅花黃色素氯化鈉注射液(批號為90301019、90301028、90301031,規(guī)格 100 ml/瓶,山西華輝凱德制藥有限公司)。細菌內毒素工作標準品(WSE)(批號:2007-5,效價:100 EU/支,中國藥品生物制品檢定所)。鱟試劑(TAL):廈門鱟試劑廠(批號:071160,λ=0.125 EU/ml,規(guī)格為0.5 ml/支 ;批號:0902063,λ=0.03 EU/ml,規(guī)格為0.5 ml/支 );湛江博康海洋生物有限公司(批號為0806183,λ=0.125 EU/ml,規(guī)格為0.5 ml/支;批號為081125,λ=0.03 EU/ml,規(guī)格為0.5 ml/支);湛江安度斯生物有限公司(批號:0710190,λ=0.25 EU/ml,規(guī)格為0.5 ml/支);細菌內毒素檢查用水(BET水)(批號:2006-12,規(guī)格為10 ml/支,中國藥品生物制品檢定所)。超凈工作臺(蘇州凈化設備有限公司);2型旋渦混合器(上海精科實業(yè)有限公司);試驗所用玻璃器皿均經(jīng) 250℃干烤至少 1 h。

2 方法與結果

2.1 鱟試劑靈敏度復核 按中國藥典 2005年版一部附錄ⅩⅢ D細菌內毒素檢查法進行,所用鱟試劑的靈敏度測定值 λc均在 0.5λ-2.0λ之間,符合規(guī)定,可用于本試驗,結果見表1。

表1 鱟試劑靈敏度復核結果Tab 1 The TAL sensitive test results

2.2 供試品細菌內毒素限值(L)確定 L=K/M式中 K為按規(guī)定的給藥途徑不同,人每千克體重每小時可接受的內毒素最大劑量,注射劑的K=5 EU/(kg·h),M為人體每千克體重每小時給藥的最大劑量,參考使用說明書以紅花黃色素計,人用最大劑量為100 ml/次,中國人體重按 60 kg計,M=1.7 ml/kg,L=K/M=3 EU/ml,而大容量注射劑細菌內毒素限值為0.5 EU/ml,本品限值標準定為L=0.5 EU/ml。

2.3 最大有效稀釋倍數(shù)(MVD) 供試品稀釋倍數(shù)按公式 MVD=CL/λ計算,其中 L為細菌內毒素限值 0.5 EU/ml,當限值單位為EU/ml時,C為1 ml/ml,λ為鱟試劑的標示靈敏度,目前市面上售鱟試劑靈敏度在 0.5-0.03 EU/ml,經(jīng)計算,本品 MVD在2-16倍之間。

2.4 供試品干擾試驗

2.4.1 供試品干擾預試驗 取供試品,加 BET水,分別稀釋至 2,4,8,16倍的溶液(記此系列溶液為NPC),并用其分別將內毒素標準品制成含 2λ,0.25λ的一系列濃度(記此系列溶液為PPC),用三個廠家不同鱟試劑(λ=0.125 EU/ml,λ=0.25 EU/ml)考察每個供試品濃度下的干擾情況,并設陰性對照和陽性對照,結果見表2-4。預試驗結果表明,紅花黃色素氯化鈉注射液對三廠家鱟試劑在PPC2(0.25λ)系列反應中,在 2,4倍稀釋時均表現(xiàn)為凝集反應,表明本品對鱟試劑的凝集反應表現(xiàn)為增強作用。采用廈門鱟試劑廠與湛江博康海洋的鱟試劑在 16倍稀釋時,對鱟試劑的凝集反應無增強或抑制作用;而采用湛江安度斯的鱟試劑在 8倍稀釋時,對鱟試劑的凝集反應無增強或抑制作用。所以用 16倍稀釋倍數(shù)進行供試品干擾試驗。

表2 干擾預試驗結果 (廈門鱟試劑廠,λ=0.125 EU/ml)Tab 2 Results of preliminary interference test for TAL from Xiamen TAL Ltd. (λ=0.125 EU/ml)

表3 干擾預試驗結果(湛江博康海洋生物有限公司,λ=0.125 EU/ml)Tab 3 Results of preliminary interference test for TAL from Zhangjiang Bokang Marane Biological Co.,Ltd.(λ=0.125 EU/ml)

表4 干擾預試驗結果(湛江安度斯生物有限公司,λ=0.25EU/ml)Tab 4 Results of preliminary interference test for TAL from Zhanjiang A＆C Biological Ltd. (λ=0.25EU/ml)

2.4.2 供試品干擾試驗 根據(jù)預試驗的結果,用細菌內毒素檢查用水分別稀釋成 16倍供試品,將內毒素工作標準品制成0.25,0.125,0.06,0.03 EU/ml的一系列濃度,分別用 2個廠家的鱟試劑同時考察 3批供試品每個濃度下的干擾情況,每一濃度做 4管,同時作陰性對照和供試品陰性對照,結果見表5。

表5 供試品干擾試驗結果Tab 5 Results of interference test for sample

結果表明,紅花黃色素氯化鈉注射液采用廈門鱟試劑廠與湛江博康海洋生物制品有限公司的鱟試劑在 16倍稀釋時,對鱟試劑的凝集反應無增強或抑制作用,所以確定樣品稀釋倍數(shù)為16倍。

2.5 供試品細菌內毒素檢查 按《中國藥典》2005年版一部ⅩⅢ D細菌內毒素檢查法,取 3批供試品,按 16倍稀釋倍數(shù),分別用兩個不同廠家的鱟試劑對其進行細菌內毒素檢查,結果符合規(guī)定,見表6。

表6 供試品細菌內毒素檢測結果Tab 6 The results of bacterial endotoxin test

3 討論

TAL用于細菌內毒素的檢測具有操作簡單、靈敏度、重現(xiàn)性好、實用性強等優(yōu)點。由于中藥注射劑干擾因素多,本實驗也證明,不同廠家的鱟試劑,對紅花黃色素氯化鈉注射液細菌內毒檢查所產生的干擾情況存在著較大差異。就該產品采用靈敏度為0.03 EU/ml的鱟試劑檢測時,若干擾程度增加,則該檢測方法就不適用[5],因此對于中藥注射劑采用細菌內毒素替代熱原檢查法目前存在較多爭議。本文對于紅花黃色素氯化鈉注射液的細菌內毒素檢查方法的建立給中藥注射劑采用細菌內毒素法代替熱原檢查法提供一種參考。

本試驗用二個廠家的TAL對紅花黃色素氯化鈉注射液三批供試品溶液進行干擾試驗,結果表明紅花黃色素氯化鈉注射液最大不干擾稀釋倍數(shù)為16倍,其內毒素限值為:每 1 ml含內毒素量應小于0.5 EU/ml。試驗中對我公司生產的90301019、90301028、90301031三批紅花黃色素氯化鈉注射液進行了細菌內毒素檢查,結果符合規(guī)定。

綜上所述,我們認為紅花黃色素氯化鈉注射液,可以采用細菌內毒素方法進行檢查,若出現(xiàn) 3家鱟試劑結果的差異,可采用特殊鱟試劑進行進一步研究。

[1] 國家藥典委員會.中華人民共和國藥典 2005版:一部[M].北京:化學工業(yè)出版社,2005:79,116.

[2] 李道明.注射用頭孢孟多酯鈉細菌內毒素檢查法的建立[J].中國藥事,2008,22(11):1002.

[3] 劉英華,王志良,葛慧卿,等.注射用阿奇霉素細菌內毒素檢查方法的研究[J].中國藥事,2007,21(9):752.

[4] 廖一靜,麥曦,李蔚雯,等.葡萄糖酸依諾沙星注射液中細菌內毒素的檢查[J].江西醫(yī)學院學報,2007,47(5):33.

[5] 李霞.細菌內毒素檢查法在藥品申報資料中應注意的問題[J].中國藥事,2007,21(6):401.