覆盆子漿對(duì)原發(fā)性肝癌細(xì)胞影響的臨床研究

亓貫和 ，王 靜，李業(yè)永

（1.山東省泰安市第一人民醫(yī)院，山東 泰安271000； 2.山東省泰安市中醫(yī)醫(yī)院，山東 泰安271000）

原發(fā)性肝癌（HCC）是常見的惡性腫瘤，具有發(fā)病率高、治療效果差、病死率高的特點(diǎn)，在我國已成為第二大癌癥殺手［1］。原發(fā)性肝癌起病隱匿，且早期多無明顯癥狀，約80%患者就診時(shí)已經(jīng)屬于中晚期，失去了手術(shù)切除的機(jī)會(huì)。HCC自然病程約為2～6個(gè)月，總的生存率僅為3%～5%［2］。積極防治肝癌已經(jīng)成為我國乃至全世界廣泛重視的課題。

覆盆子為薔薇科懸鉤子屬植物，因其僅分布于華東地區(qū)，故名華東覆盆子。《中華人民共和國藥典》（2005年）收載的覆盆子品種是華東覆盆子的果實(shí)，果味甜，可食，具有補(bǔ)腎固精、助陽縮尿的功效。藥理實(shí)驗(yàn)證明，覆盆子具有抗誘變［3］、延緩衰老［4］、增強(qiáng)免疫的作用［5］。文獻(xiàn)記載，覆盆子中的 β-谷甾醇（βsitosterol）等化學(xué)成分具有一定的抗癌作用［6-7］，但對(duì)肝癌細(xì)胞的抑制作用目前國內(nèi)未見報(bào)道。本研究探討覆盆子漿對(duì)人原發(fā)性肝癌細(xì)胞的影響，為臨床抗癌新藥的開發(fā)提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試劑與儀器

DMEM細(xì)胞培養(yǎng)液：北京賽馳生物科技有限公司；四唑鹽（MTT）、二甲亞砜（DMSO）、臺(tái)盼藍(lán)：美國Sigma公司；胰蛋白酶、胎牛血清：北京鼎國生物技術(shù)有限公司；倒置顯微鏡：日本OLYMPUS CK40；全自動(dòng)酶聯(lián)免役檢測儀：南京華標(biāo)儀器廠。

1.2 覆盆子漿的制備

將覆盆子于60℃烘干，粉碎，取20目～40目粉末100 g，加12倍水浸泡30 min后煎煮1 h，分離出提取液，藥渣再加10倍水煎煮1 h，分離出提取液，將兩次提取液合并，抽濾，濾液用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀減壓濃縮至稠膏狀，60℃真空干燥，得覆盆子總提取物，將制備的干燥覆盆子提取物用DMEM（腫瘤細(xì)胞培養(yǎng)液）溶解，即得到不同濃度的覆盆子漿。

1.3 原發(fā)性肝癌細(xì)胞的來源與培養(yǎng)

1.3.1 標(biāo)本來源 2007年6月-2009年10月原發(fā)性肝癌新鮮腫瘤切除標(biāo)本25例，來自泰安市腫瘤醫(yī)院11例，泰安市第一人民醫(yī)院8例，泰安市中醫(yī)醫(yī)院6例。

1.3.2 制備腫瘤細(xì)胞懸液 取新鮮腫瘤組織，在無菌條件下，去除腫瘤的纖維組織及壞死部分，眼科剪剪碎，置入細(xì)胞濾器中，用100目銅網(wǎng)過濾，D-Hank液沖洗，臺(tái)盼蘭染色活細(xì)胞≥90%，用DMEM制備成5×105/mL單細(xì)胞懸液。

1.3.3 腫瘤細(xì)胞培養(yǎng) 將細(xì)胞懸液分裝入培養(yǎng)瓶內(nèi)，然后用含20%胎牛血清、100 U/mL青霉素、100U/mL鏈霉素的DMEM接種于50 mL培養(yǎng)瓶中，于37℃5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，次日更換培養(yǎng)液，觀察細(xì)胞生長情況，待細(xì)胞生長至單層時(shí)進(jìn)行傳代。棄去舊培養(yǎng)液，PBS液洗滌細(xì)胞，加入0.25%胰蛋白酶1 mL，輕輕搖動(dòng)培養(yǎng)瓶，使胰蛋白酶鋪滿瓶底，流遍細(xì)胞表面，置倒置顯微鏡下觀察，見細(xì)胞質(zhì)回縮，偽足將要消失時(shí)，向培養(yǎng)瓶中加入3 mL完全培養(yǎng)液終止消化，然后按1∶2的比例在新培養(yǎng)瓶中繼續(xù)培養(yǎng)。

1.4方 法

1.4.1 四唑鹽（MTT）比色法測定覆盆子對(duì)肝癌細(xì)胞的敏感性實(shí)驗(yàn) 收集對(duì)數(shù)生長期的細(xì)胞，調(diào)整濃度為5×104/mL的單細(xì)胞懸液，接種于96孔培養(yǎng)板中，每孔200 μL，于37℃ 5%CO2飽和濕度的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h后，更換培養(yǎng)液，實(shí)驗(yàn)組加入以DMEM完全培養(yǎng)液配制的覆盆子，終濃度分別為0.005 g/L、0.01 g/L、0.02 g/L、0.04 g/L、0.08 g/L，另設(shè)陰性、空白對(duì)照組，每組設(shè)8個(gè)復(fù)孔。將培養(yǎng)板置培養(yǎng)箱中分別于 12 h、24 h、48 h、72 h、96 h、120 h、144 h 各取出1塊培養(yǎng)板，吸棄其中5個(gè)復(fù)孔內(nèi)培養(yǎng)液，加入5g/L MTT溶液20 μL，繼續(xù)培養(yǎng)4 h，吸棄孔內(nèi)培養(yǎng)液，每孔加入 DMSO 100 μL，震蕩搖勻 10 min，使結(jié)晶物充分溶解，選擇570 nm波長，在全自動(dòng)酶標(biāo)儀上測定各孔的吸光度（A）值，取5孔平均值，計(jì)算細(xì)胞生長抑制率。應(yīng)用直線回歸法計(jì)算IC50值，并尋找藥物作用的合適的濃度與作用時(shí)間。

1.4.2 細(xì)胞膜完整性檢測 取另外3孔，制成單細(xì)胞懸液，0.4%臺(tái)盼藍(lán)染色，光鏡下觀察，細(xì)胞膜破裂的細(xì)胞，被染成藍(lán)色，而活細(xì)胞膜完整，拒染。

1.4.3 細(xì)胞形態(tài)學(xué)觀察 倒置顯微鏡下，觀察藥物作用后肝癌細(xì)胞生長情況及形態(tài)變化。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

2 結(jié) 果

2.1 MTT法敏感性試驗(yàn)

每個(gè)濃度的覆盆子對(duì)肝癌細(xì)胞的增殖均有抑制作用，只是抑制的程度有所不同，濃度為0.005 g/L覆盆子組的抑制率與空白對(duì)照組相比差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義；但是從0.02 g/L起，每個(gè)時(shí)間段隨著覆盆子濃度的增加，抑制作用增強(qiáng)，并且與前一個(gè)濃度相比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.01），呈現(xiàn)出劑量依賴趨勢(shì)；每個(gè)濃度隨著作用時(shí)間的增加，抑制作用增強(qiáng)，并且與前一個(gè)時(shí)間段相比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.01），呈現(xiàn)時(shí)間依賴趨勢(shì)，以0.08 g/L的覆盆子在72 h時(shí)，其抑制率與前一個(gè)濃度相比較、與前一個(gè)時(shí)間段相比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.001），作用最為明顯（結(jié)果見表1），以72 h不同濃度覆盆子處理組與抑制率進(jìn)行相關(guān)分析，呈正線性趨勢(shì)，相關(guān)方程為Y=1.37+0.7282X，相關(guān)系數(shù)r=0.9812，D50為0.065 g/L，經(jīng)過不同濃度的覆盆子處理后，細(xì)胞生長速率開始變慢，然后細(xì)胞數(shù)逐漸減少，失去了正常細(xì)胞快速增值期（指數(shù)生長期），說明加藥后細(xì)胞生長受到抑制，并呈現(xiàn)出與藥物濃度、作用時(shí)間的依賴性。

表1 覆盆子對(duì)25例肝癌細(xì)胞的平均抑制率 （%）

2.2 臺(tái)盼藍(lán)拒染法檢測細(xì)胞膜完整性實(shí)驗(yàn)結(jié)果

隨著覆盆子濃度的增加，作用時(shí)間的延長，藍(lán)染細(xì)胞數(shù)隨之增加，活細(xì)胞率下降，濃度為0.08 g/L覆盆子作用144 h時(shí)，活細(xì)胞率為31.2%（結(jié)果見表2），說明肝癌細(xì)胞在此藥物濃度及作用時(shí)間作用下，有明顯的被抑制作用。

表2 覆盆子對(duì)25例肝癌細(xì)胞作用后平均活細(xì)胞率 （%）

2.3 形態(tài)學(xué)觀察結(jié)果

陰性對(duì)照組：細(xì)胞呈上皮樣貼壁生長，生長速度較快，細(xì)胞呈多角形，細(xì)胞間接觸緊密，在培養(yǎng)瓶部分區(qū)域出現(xiàn)“疊堆生長”現(xiàn)象，增值旺盛，離壁細(xì)胞少（結(jié)果見圖1）；覆盆子組：細(xì)胞數(shù)減少，普遍收縮，部分細(xì)胞生長區(qū)域出現(xiàn)“接觸抑制”現(xiàn)象，細(xì)胞間距增大，細(xì)胞間接觸松散，細(xì)胞增值受到明顯抑制（結(jié)果見圖 1）。

圖1 藥物作用后肝癌細(xì)胞生長情況及狀態(tài)變化

3 討 論

肝癌的治療方法很多，如外科手術(shù)、病灶局部的介入放射治療、全身化學(xué)藥物治療等。近年來，國內(nèi)在肝癌的免疫基因治療、癌基因和抑癌基因治療、自殺基因治療及耐藥基因治療等方面的研究取得了一定成績，但多數(shù)尚處于基礎(chǔ)研究階段，而手術(shù)、放射治療、化學(xué)藥物治療現(xiàn)在仍然是治療肝癌的主要手段，由于大部分肝癌患者在確診后已失去了手術(shù)切除的機(jī)會(huì)，目前，臨床確診的原發(fā)性肝癌患者能接受肝切除術(shù)者只占10%～30%［8］，而且手術(shù)切除后的肝癌患者復(fù)發(fā)率很高，目前學(xué)者們已經(jīng)充分認(rèn)識(shí)到針對(duì)肝癌進(jìn)行外科手術(shù)，應(yīng)強(qiáng)調(diào)針對(duì)患者的全身情況進(jìn)行預(yù)防和綜合治療［9-10］，全身化學(xué)藥物治療在原發(fā)性肝癌的綜合治療中始終占重要地位，但由于缺乏特異性，在殺傷腫瘤細(xì)胞的同時(shí)，也會(huì)對(duì)正常細(xì)胞產(chǎn)生殺傷效應(yīng)，導(dǎo)致骨髓移植，肝腎損害等致死性毒副作用。因此，尋找和開發(fā)新型的副作用小、療效好、作用比較溫和的化療藥物，已迫在眉睫。

中醫(yī)中藥治療腫瘤是我國在腫瘤治療領(lǐng)域的一大特色，臨床實(shí)踐證明，單獨(dú)用中藥或中西醫(yī)結(jié)合治療腫瘤療效確切，同時(shí)還可減輕放化療的毒副作用，因此，應(yīng)用中醫(yī)藥治療腫瘤備受國內(nèi)外學(xué)者的青睞，已經(jīng)成為國內(nèi)外抗腫瘤藥物開發(fā)研究的重要組成部分，特別是從中草藥中提取抗腫瘤藥物，成為近年來中藥的研究熱點(diǎn)。中醫(yī)藥是肝癌治療的一條重要途徑，具有廣闊的研究開發(fā)前景。

異常增殖是腫瘤細(xì)胞的特征之一，抑制腫瘤細(xì)胞的生長增殖是治療腫瘤的途徑之一，也是對(duì)抗腫瘤藥物的基本要求。覆盆子為薔薇科懸鉤子屬植物，對(duì)懸鉤子屬化學(xué)成分的系統(tǒng)研究始于20世紀(jì)70年代末80年代初，從中分離出β-谷甾醇、胡蘿卜苷、椴樹苷、山奈酚-3-β-D（rha）-glc 等 50 多個(gè)化合物［6］。本試驗(yàn)通過對(duì)原發(fā)性肝癌細(xì)胞的體外培養(yǎng)，覆盆子處理后，MTT藥物敏感性試驗(yàn)結(jié)果表明，覆盆子對(duì)肝癌細(xì)胞的生長、增殖具有抑制作用，并且抑制率呈現(xiàn)出與藥物劑量、作用時(shí)間的依賴趨勢(shì)（P<0.01）；從生長曲線上看，覆盆子處理后的細(xì)胞，失去了正常細(xì)胞快速增值期（指數(shù)生長期）；同時(shí)，形態(tài)學(xué)觀察也進(jìn)一步顯示覆盆子對(duì)原發(fā)性肝癌細(xì)胞生長增殖具有抑制作用，從而降低了肝癌的惡性程度。目前，抗癌中藥大體上有4個(gè)方面的作用，即抑殺腫瘤細(xì)胞的祛邪作用；調(diào)整機(jī)體免疫功能等抗癌潛能的扶正作用；提高手術(shù)、放療、化療等效果的增敏作用；減低治療腫瘤過程中的毒副作用。覆盆子作為中藥，對(duì)機(jī)體損害小，作用溫和，因此，可能成為治療肝癌的化學(xué)治療藥物，為肝癌的臨床治療提供一條重要的途徑，為抗癌新藥的開發(fā)提供理論與實(shí)踐依據(jù)。本實(shí)驗(yàn)表明，覆盆子對(duì)肝癌細(xì)胞的生長增殖能有效地抑制，但其單一成分的作用機(jī)制還需要進(jìn)一步研究與探討。

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