G蛋白偶聯(lián)受體激酶5在穩(wěn)定表達(dá)α-Synuclein的SHSY5Y細(xì)胞中的基因表達(dá)調(diào)控功能

劉 鵬，王曉映，高 寧，朱 華，代小偉，黃 瀾，徐艷峰，馬春梅，秦 川

（中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物研究所北京協(xié)和醫(yī)學(xué)院比較醫(yī)學(xué)中心衛(wèi)生部人類疾病比較醫(yī)學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，北京 100021）

GRKs（G protein-coupled receptor kinases）是G蛋白偶聯(lián)受體激酶，屬于絲氨酸/酪氨酸蛋白激酶家族。目前發(fā)現(xiàn)GRKs的主要功能是對G蛋白偶聯(lián)受體（G protein-coupled receptor，GPCRs）進(jìn)行磷酸化，從而介導(dǎo)GPCR的脫敏反應(yīng)［1，2］。最近研究發(fā)現(xiàn)GRKs除了具有通過GPCR發(fā)揮G蛋白偶聯(lián)受體激酶的作用外，還可以通過磷酸化一些非受體底物發(fā)揮作用。GRK5是GRKs家族中的一員，具有所有GRK成員的共同特點(diǎn)，其中包括它既可以磷酸化GPCRs，也可以磷酸化一些非受體底物，如tubulin［3］，synucleins［4］和核蛋白體P2蛋白［5］等。目前根據(jù)GRK5的分布和功能確定出了一些結(jié)構(gòu)和功能域：N-末端磷脂酰環(huán)己六醇-4，5-二磷酸（PIP2）結(jié)合域，磷脂結(jié)合域（氨基酸殘基552-562），自體抑制結(jié)構(gòu)域（氨基酸殘基563-590），兩個(gè)鈣調(diào)蛋白（CaM）結(jié)合域（N末端氨基酸殘基20-39和C末端氨基酸殘基540-578）以及一個(gè)DNA結(jié)合細(xì)胞核定位序列（DNA-binding nuclear localization sequence，NLS）（氨基酸殘基388-395）［6-9］。

Arawaka等［10］通過對散發(fā)性帕金森病人腦組織進(jìn)行免疫組化染色發(fā)現(xiàn)，路易小體中存在有GRK5蛋白和α-synuclein蛋白，同時(shí)發(fā)現(xiàn)GRK5具有磷酸化α-synuclein 129位點(diǎn)絲氨酸的功能，而αsynuclein的這種磷酸化修飾作用可能是其對多巴胺神經(jīng)元具有毒性作用的基礎(chǔ)。這一發(fā)現(xiàn)揭示了GRK5在帕金森病可能具有致病作用。緊接著Bychkov等［11］發(fā)現(xiàn)GRK5的mRNA水平和蛋白水平在帕金森癡呆病人中表達(dá)均升高。由于GRK5參與了GPCRs介導(dǎo)的多種細(xì)胞信號(hào)通路的傳導(dǎo)，因此GRK5的表達(dá)變化可能會(huì)導(dǎo)致帕金森病中信號(hào)傳導(dǎo)通路紊亂，從而導(dǎo)致疾病的發(fā)生。

本課題組前期的研究發(fā)現(xiàn)帕金森病α-synuclein轉(zhuǎn)基因小鼠模型具有更高表達(dá)水平的GRK5［12］，在本文中我們對穩(wěn)定表達(dá)hα-synuclein的SHSY5Y細(xì)胞系進(jìn)行GRK5蛋白表達(dá)變化的研究，并對其亞細(xì)胞水平的表達(dá)變化進(jìn)行觀察。GRK5的DNA結(jié)合細(xì)胞核定位序列的發(fā)現(xiàn)［9］，使人們對GRK5在細(xì)胞核內(nèi)是否具有調(diào)控功能產(chǎn)生了研究興趣。2000年，Eckhart等人［13］發(fā)現(xiàn)GRK5對一些基因的表達(dá)具有調(diào)控作用。2008年Martini等人［14］又發(fā)現(xiàn)了GRK5除了通過其經(jīng)典的磷酸化GPCR的功能外，還可以作為HDAC激酶實(shí)現(xiàn)對核內(nèi)基因的調(diào)控作用，從而參與心肌肥大疾病的發(fā)生。同年Sorriento等［15］發(fā)現(xiàn)GRK5通過增加細(xì)胞核內(nèi)IκBα，進(jìn)而抑制NFκB的轉(zhuǎn)錄活性?；谝陨蠄?bào)道，本文在確定帕金森病模型中GRK5蛋白表達(dá)分布變化的基礎(chǔ)上對其核內(nèi)相關(guān)功能進(jìn)行了進(jìn)一步的研究。

1 材料與方法

1.1 試劑和抗體

Ripa蛋白裂解液（碧云天公司），Trizol試劑（Invitrogen），RevertAidTMFirst Strand cDNA Synthesis Kit（Fermentas公司），Realtime-PCR Master Mix（SYBR Green）（Toyobo公司），BCA蛋白定量試劑盒（Pierce公司），硝酸纖維素膜（Millipore公司），丙烯酰胺、N，N’-亞甲基甲叉雙丙烯酰胺和TEMED均購自北京鼎國生物公司，所有引物均由上海生工生物公司合成。GRK5抗體（Santa Cruz公司），αsynuclein抗體（Abcam公司），Bcl-2抗體（Abcam公司），HRP標(biāo)記的GAPDH抗體（上?？党缮锕荆?，羊抗兔、羊抗鼠IgG/HRP購自北京中杉金橋生物公司。Lipofectin TM2000 transfection Kit（Invitrogen公司），NE-PER Nuclear and Cytoplasmic Extraction Reagents（Pierce公司），干擾GRK5的shRNA（Open Biosystems公司），HDAC Assay Kit（colorimetric detection）（Upstate公司）。

1.2 穩(wěn)定表達(dá)hα-synuclein的SHSY5Y細(xì)胞系的建立

神經(jīng)母細(xì)胞瘤細(xì)胞SHSY5Y購自中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院細(xì)胞中心，穩(wěn)定表達(dá)hα-synuclein的SHSY5Y細(xì)胞系由本課題組建立［16］。

1.3 ShRNA干擾

對轉(zhuǎn)染用shRNA質(zhì)粒進(jìn)行提取，將所提取質(zhì)粒的測序結(jié)果與Open Biosystems公司給出的shRNA核苷酸序列進(jìn)行比較，序列正確的質(zhì)粒進(jìn)行細(xì)胞轉(zhuǎn)染，轉(zhuǎn)染后72h提取細(xì)胞總RNA和總蛋白。用real-time PCR和Western blotting對目標(biāo)基因進(jìn)行檢測。根據(jù)得到的實(shí)驗(yàn)結(jié)果，我們從5種shRNA中選擇了抑制GRK5表達(dá)效果較好的2種shRNA進(jìn)行了后續(xù)相應(yīng)的實(shí)驗(yàn)。序列為：

shRNA1-GRK5：5′-CCGGACGAGATGATAGAAACAG AATCTCGAGATTCTGTTTCTATCATCTCGTTTTTT-3′；

shRNA2-GRK5：5′-CCGGCCACCACATAAACTCAAA CCACTCGAGTGGTTTGAGTTTATGTGGTGGTTTTT-3′。

1.4 蛋白提取以及Western Blotting

離心收集細(xì)胞，加入含PMSF蛋白裂解液。冰上充分裂解后4℃14 000r/min離心20min。提取上清液于即為總蛋白。利用NE-PER nuclear and cytoplasmic extraction reagents（胞漿胞核蛋白提取試劑）進(jìn)行胞核和胞漿蛋白的提取，具體步驟參見說明。BCA試劑盒進(jìn)行蛋白定量后，取等量樣本蛋白，加入SDS上樣緩沖液，混勻后沸水中變性，10％SDSPAGE電泳分離，電轉(zhuǎn)移至硝酸纖維素膜，含5％脫脂奶粉的TBST緩沖液封閉，抗體4℃過夜雜交。次日 TBST洗膜，辣根過氧化物酶標(biāo)記的二抗室溫孵育lh，TBST洗膜，ECL顯影定影顯現(xiàn)信號(hào)。HRP標(biāo)記的GAPDH抗體作為總蛋白內(nèi)參。α-tubulin以及PCNA分別作為胞漿蛋白和胞核蛋白內(nèi)參。

1.5 RNA提取以及Real-time PCR

Trizol法常規(guī)提取RNA，經(jīng)DNA酶處理后，逆轉(zhuǎn)錄為cDNA，采用實(shí)時(shí)定量聚合酶鏈反應(yīng)（real time PCR）進(jìn)行檢測。

GRK5引物序列為：

5′-GACCACACAGACGACGACTTC-3′和5′-CGTTC AGCTCCTTAAAGCATTC-3′；

bcl-2引物序列為：5′-TTCTTTGAGTTCGGTGGGGTC-3′和5′-TGCATATTTGTTTGGGGCAGG-3′；

GAPDH引物序列為：5′-CATGGGT GTGAACCATGAGAGA-3′和5′-TGTGGTCATGAGTC CTTCCA-3′。

1.6 HDAC活性檢測

按照說明進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)品稀釋，建立標(biāo)準(zhǔn)曲線（0～1mmol/L）。在樣品孔、陽性對照品孔和空白對照孔加入2×HDAC assay buffer（緩沖液），在陰性對照孔中加入4μmol/L trichostatin A，同時(shí)在陽性對照孔再加入Hela nuclear extract（核提取物）。各孔均加入4mmol/L HDAC assay substrate，充分混勻37℃孵育60min，加入activator solution（活性物溶液），充分混勻室溫孵育20min，酶標(biāo)儀405nm讀數(shù)。

2 結(jié)果

2.1 穩(wěn)定表達(dá)hα-synuclein SHSY5Y細(xì)胞系中GRK5的mRNA和蛋白水平均明顯增高

用real-time PCR和Western blotting分析hαsynuclein穩(wěn)定轉(zhuǎn)染SHSY5Y細(xì)胞系和對照組細(xì)胞中GRK5的mRNA水平和蛋白水平的變化。圖1A顯示穩(wěn)定表達(dá)hα-synuclein的SHSY5Y細(xì)胞系比對照組SHSY5Y細(xì)胞具有更高水平的GRK5mRNA。圖1B顯示在穩(wěn)定轉(zhuǎn)染細(xì)胞系中GRK5蛋白明顯多于對照組SH-SY5Y細(xì)胞，圖示為三次獨(dú)立實(shí)驗(yàn)并各重復(fù)三次的代表圖，GAPDH作為內(nèi)參。

2.2 穩(wěn)定表達(dá)hα-synuclein SHSY5Y細(xì)胞核和細(xì)胞漿中GRK5的蛋白水平均明顯增高

分別提取胞漿蛋白和胞核蛋白，用Western blotting分析hα-synuclein穩(wěn)定轉(zhuǎn)染SHSY5Y細(xì)胞系中GRK5蛋白表達(dá)的亞細(xì)胞分布。圖2顯示穩(wěn)定轉(zhuǎn)染細(xì)胞系中GRK5蛋白在胞漿中和胞核的表達(dá)均明顯多于對照組SHSY5Y細(xì)胞，α-tubulin作為胞漿蛋白內(nèi)參，PCNA作為胞核蛋白內(nèi)參。圖示為三次獨(dú)立實(shí)驗(yàn)并各重復(fù)三次的代表圖。

2.3 hα-synuclein穩(wěn)定轉(zhuǎn)染SHSY5Y細(xì)胞系中HDAC活性增強(qiáng)

（A）Real-time PCR的統(tǒng)計(jì)結(jié)果，＊＊P＜0.01。（B）Western blotting顯示hα-synuclein穩(wěn)定轉(zhuǎn)染SH-SY5Y細(xì)胞GRK5蛋白表達(dá)高于對照組SHSY5Y細(xì)胞。圖1 hα-synuclein穩(wěn)定轉(zhuǎn)染SH-SY5Y細(xì)胞GRK5的mRNA和蛋白的表達(dá)分析（A）The statistical results of real-time PCR.（B）.Western blot analysis of total protein extracted from hα-synuclein stably transfected cells and SHSY5Y cells（control）.Fig.1 Analyzing GRK5 mRNA and protein expression in hα-synuclein stably transfected SH-SY5Y cells

為了研究GRK5蛋白在細(xì)胞核中的功能，我們用HDAC assay kit對穩(wěn)定表達(dá)hα-synuclein的SHSY5Y細(xì)胞系的HDAC活性進(jìn)行檢測，之后用shRNA1-GRK5和shRNA2-GRK5轉(zhuǎn)染SHSY5Y細(xì)胞觀察GRK5蛋白表達(dá)抑制是否會(huì)對HDAC的活性產(chǎn)生影響。圖3A顯示與對照組SHSY5Y細(xì)胞相比，穩(wěn)定表達(dá)hα-synuclein的SHSY5Y細(xì)胞的HDAC活性明顯增加，對照組SHSY5Y細(xì)胞的HDAC活性設(shè)定為100％，hα-synuclein穩(wěn)定轉(zhuǎn)染SHSY5Y細(xì)胞的HDAC活性為139％。圖3B顯示shRNA1-GRK5和shRNA2-GRK5轉(zhuǎn)染SHSY5Y細(xì)胞72h后，HDAC活性明顯低于陰性對照組SHSY5Y細(xì)胞。shRNA1-GRK5轉(zhuǎn)染SHSY5Y細(xì)胞中HDAC活性降低約80％，shRNA2-GRK5轉(zhuǎn)染SHSY5Y細(xì)胞中HDAC活性降低約50％。與對照組比較，＊P＜0.05，＊＊P＜0.01。

圖2 hα-Synuclein穩(wěn)定轉(zhuǎn)染SHSY5Y細(xì)胞核和胞漿中GRK5蛋白的增高。Fig.2 Western blotting of nuclear and cytoplastic proteins extracted from hα-syn-transfected cells and SHSY5Y cells（control）.

圖3 GRK5對HDAC活性的調(diào)控Fig.3 Analysis of the histone deacetylase activity regulated by GRK5.

2.4 穩(wěn)定表達(dá)hα-synucle in的SHSY5Y細(xì)胞系中bcl-2蛋白表達(dá)增加，GRK5對bcl-2基因的表達(dá)具有調(diào)控作用

我們首先用real-time PCR和Western blotting分析穩(wěn)定表達(dá)hα-synuclein的SHSY5Y細(xì)胞系和對照組SHSY5Y細(xì)胞中bcl-2的mRNA水平和蛋白水平的變化。由圖4A可見穩(wěn)定表達(dá)hα-synuclein的SHSY5Y細(xì)胞系比對照組SHSY5Y細(xì)胞具有較低水平的Bcl-2mRNA。圖4B顯示穩(wěn)定轉(zhuǎn)染細(xì)胞系中bcl-2蛋白的表達(dá)水平明顯低于對照組SHSY5Y細(xì)胞。接著用shRNA1-GRK5和shRNA2-GRK5轉(zhuǎn)染SHSY5Y細(xì)胞后分析bcl-2mRNA、蛋白的表達(dá)情況。圖4C顯示，shRNA1-GRK5和shRNA2-GRK5轉(zhuǎn)染SHSY5Y細(xì)胞72h后，可見GRK5mRNA的表達(dá)明顯低于陰性對照組SHSY5Y細(xì)胞。同時(shí)，可見shRNA1-GRK5、shRNA2-GRK5轉(zhuǎn)染SHSY5Y細(xì)胞與陰性對照組SHSY5Y細(xì)胞相比，bcl-2mRNA的表達(dá)明顯增加。圖4D顯示，shRNA1-GRK5和shRNA2-GRK5轉(zhuǎn)染SHSY5Y細(xì)胞72h后，GRK5蛋白的表達(dá)明顯低于陰性對照組SHSY5Y細(xì)胞。同時(shí)，shRNA1-GRK5、shRNA2-GRK5轉(zhuǎn)染SHSY5Y細(xì)胞與陰性對照組SHSY5Y細(xì)胞相比，bcl-2蛋白的表達(dá)明顯增加。說明GRK5的表達(dá)抑制可以促使bcl-2的表達(dá)增加。GAPDH作為內(nèi)參，圖示為三次獨(dú)立實(shí)驗(yàn)并各重復(fù)三次的代表圖。＊P＜0.05，＊＊P＜0.01與對照相比。

3 討論

本研究發(fā)現(xiàn)，在穩(wěn)定表達(dá)hα-synuclein的SHSY5Y細(xì)胞系中GRK5的mRNA水平和蛋白水平均明顯增加，通過進(jìn)一步檢測GRK5蛋白的亞細(xì)胞分布時(shí)發(fā)現(xiàn)無論是在細(xì)胞的胞漿中還是在細(xì)胞的胞核中GRK5蛋白表達(dá)均高于相應(yīng)的對照組細(xì)胞，這些結(jié)果提示我們GRK5蛋白的表達(dá)增加在帕金森病中可能具有一定的致病作用。

近期研究顯示GRK5中包含的DNA結(jié)合細(xì)胞核定位序列的發(fā)現(xiàn)［9］，GRK5作為HDAC激酶實(shí)現(xiàn)對核內(nèi)基因的調(diào)控作用參與心肌肥大疾病的發(fā)生［14］以及GRK5通過增加細(xì)胞核內(nèi)IκBα（抑制性κBα）抑制NFκB（核因子κB）的轉(zhuǎn)錄活性［15］，上述實(shí)驗(yàn)結(jié)果提示我們GRK5蛋白在細(xì)胞核內(nèi)具有非常重要的作用，因此我們通過HDAC活性檢測試驗(yàn)以及RNA干擾試驗(yàn)對GRK5在穩(wěn)定表達(dá)hα-synuclein的SHSY5Y細(xì)胞胞核中的相關(guān)功能進(jìn)行了研究。我們發(fā)現(xiàn)與對照組SHSY5Y細(xì)胞相比，穩(wěn)定表達(dá)hα-synuclein的SHSY5Y細(xì)胞的HDAC活性明顯增加，而且HDAC的活性隨著GRK5蛋白的表達(dá)減少而顯著降低。這些結(jié)果說明在SHSY5Y細(xì)胞中，GRK5對HDAC活性同樣具有調(diào)節(jié)作用。hα-synuclein蛋白的表達(dá)增加，可能通過增加GRK5蛋白的表達(dá)，從而抑制了HDAC的活性，調(diào)控基因的轉(zhuǎn)錄和翻譯。在穩(wěn)定表達(dá)hα-synuclein的SHSY5Y細(xì)胞中bcl-2的mRNA和蛋白水平都是明顯降低的，而通過shRNA干擾降低GRK5蛋白表達(dá)后，bcl-2的表達(dá)顯著增加。這一結(jié)果證實(shí)了GRK5具有對bcl-2基因轉(zhuǎn)錄和表達(dá)調(diào)控的作用，而這一作用可能是通過調(diào)控HDAC活性實(shí)現(xiàn)的。Blc-2基因表達(dá)的調(diào)控是很復(fù)雜的，最近文獻(xiàn)報(bào)道的GRK5可以通過增加細(xì)胞核內(nèi)IκBα抑制NFκB的轉(zhuǎn)錄活性［15］，而1999年Tamatani等［17］證實(shí)NFκB可以調(diào)控bcl-2基因的表達(dá)。因此，我們發(fā)現(xiàn)的GRK5的表達(dá)增加抑制了bcl-2基因的轉(zhuǎn)錄和翻譯，可能是由我們證實(shí)的GRK5通過影響HDAC活性進(jìn)行的，也有可能是通過GRK5抑制NFκB轉(zhuǎn)錄而實(shí)現(xiàn)。基因轉(zhuǎn)錄和翻譯的調(diào)控本身就是非常復(fù)雜的，受到多種蛋白的調(diào)控，各種蛋白相互協(xié)調(diào)相互作用，共同調(diào)控，所以我們相信GRK5對bcl-2基因的調(diào)控也不僅限于這兩個(gè)方面，更多的參與此調(diào)控途徑的蛋白還有待于進(jìn)一步研究。

穩(wěn)定表達(dá)hα-synuclein的SHSY5Y細(xì)胞系bcl-2的mRNA表達(dá)水平（A）和蛋白水平（B），β-actin作為內(nèi)參，圖示為三次獨(dú)立實(shí)驗(yàn)并各重復(fù)三次的代表圖。shRNA1-GRK5、shRNA2-GRK5瞬時(shí)轉(zhuǎn)染SHSY5Y細(xì)胞以及對照組SHSY5Y細(xì)胞中GRK5和bcl-2mRNA的表達(dá)情況（C）以及蛋白的表達(dá)情況（D）。圖4 GRK5對bcl-2基因的轉(zhuǎn)錄和表達(dá)具有調(diào)控作用The detection of bcl-2mRNA（A）and protein levels（B）in hα-synuclein-expressing cells and SHSY5Y cells（control）.Analysis of The mRNA level（C）and protein level（D）of GRK5 and bcl-2 in SHSY5Y cells transiently transfected with shRNA1-GRK5 and shRNA2-GRK5.Fig.4 GRK5 regulates bcl-2 gene transcription and expression

綜上所述，我們通過研究發(fā)現(xiàn)帕金森病模型中GRK5具有bcl-2基因轉(zhuǎn)錄和翻譯的調(diào)控功能，證實(shí)了GRK5在帕金森病中具有一定的作用。這些發(fā)現(xiàn)提示我們GRK5可能作為一個(gè)新的靶點(diǎn)在帕金森病治療中發(fā)揮一定的作用，同時(shí)我們的發(fā)現(xiàn)為進(jìn)一步研究GRKs家族的基因調(diào)控功能提供了新的研究方向。

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