清醒狀態(tài)下電刺激大鼠上矢狀竇模型后腦內Fos陽性神經元的分布

王曉琳，于生元，姜 磊，董 釗，王曉輝，周志斌

（中國人民解放軍總醫(yī)院神經內科，北京 100853）

偏頭痛是一種臨床上常見的慢性、復發(fā)性腦功能異常所致的原發(fā)性頭痛。到目前為止，偏頭痛的發(fā)病機制仍未完全闡明，主要有血管源性學說、三叉神經血管學說、皮層擴布性抑制學說等。針對不同機制建立的多種偏頭痛實驗動物模型已被廣泛應用于偏頭痛的發(fā)病機制、藥物治療、行為學觀察等研究中。

硬腦膜是顱內主要的傷害性感受組織，在偏頭痛的發(fā)病過程中起著重要的作用。硬腦膜神經源性刺激模型作為三叉神經血管反射學說所反映的病理生理過程的典型代表，特別是電刺激上矢狀竇附近硬腦膜模型，目前被廣泛運用于偏頭痛的發(fā)病機制、藥物治療等方面的研究［1］。電刺激硬腦膜使得腦膜血管擴張加上擴張后釋放炎癥介質激活了分布于硬腦膜上的三叉神經終末感受器，傷害性信息沿三叉神經節(jié)、脊束核、丘腦傳遞至皮層，產生痛覺，同時激活的三叉神經脊束核逆向調節(jié)神經終末釋放血管活性物質，進一步增強了傷害性信息，使疼痛在程度和時間上都有所增加［2］。然而，目前使用的該模型基本上是建立在動物麻醉基礎上的，對給予刺激的幅度大小主要靠對動物實時心臟、血壓、呼吸等方面的監(jiān)測來反映［3］。

即使不考慮模型制備的復雜性，模型模擬的真實性上也存在明顯的問題。因為偏頭痛的患者不可能在麻醉的情況下發(fā)病，麻醉不但可以減輕疼痛的程度，也會減少劇烈疼痛可能引發(fā)的情感及自主神經系統(tǒng)反應。因此，我們實驗室建立了一種清醒狀態(tài)下電刺激上矢狀竇硬腦膜觀察動物行為學改變的偏頭痛實驗動物模型，并從動物行為學、血液流變、對嗎啡的反應等方面進行了驗證。為了進一步明確該模型在給予相應電刺激后腦內的激活情況我們設計了本實驗。

1 材料和方法

1.1 實驗動物分組

健康雄性SD大鼠30只，體重225～250g。隨機分為實驗組（電刺激）、對照組（假手術）和正常組（空白），每組各10只。實驗組以臺式牙鉆顱骨鉆洞暴露SSS后，安放電極并給予方波電流刺激2h；對照組除不給予電流刺激外所有操作同實驗組；正常組在麻醉后直接處死。所有實驗動物均由解放軍總醫(yī)院實驗動物中心提供（雄性SD大鼠，SCXK（京）2006-0009）。

1.2 動物模型的建立

實驗動物以10％水合氯醛（0.4mL/100g，解放軍總醫(yī)院）腹腔內注射麻醉后，剪掉頭正中部毛發(fā)，固定于立體定位儀上。消毒并逐層切開皮膚、筋膜及骨膜以暴露顱骨。臺式牙鉆在顱骨上鉆直徑約1mm圓孔，取點方法為顱中線冠狀縫交點前4mm后6mm，暴露上矢狀竇硬腦膜。將金屬電極的兩極分別置于刺激孔的硬腦膜上，并用牙科水泥固定。75％酒精消毒切口及皮膚周圍后縫合皮膚，將大鼠置于原環(huán)境中靜養(yǎng)，期間給予抗生素喂食（阿莫西林膠囊，按30mg/kg與食物混合喂食，3/日），環(huán)境中保持安靜，室溫在25℃左右。大約4～5d后，對實驗組大鼠給予電刺激。采用日本光電工業(yè)株式會社生產的刺激器（SEN-7103）和分離器（SS-102J）給予電刺激2h（Duration=50，Intervel=250）。實驗結束后灌注固定動物。以上所有操作均保證無菌條件，嚴格按照實驗動物倫理委員會關于動物實驗相關要求進行。

1.3 灌注固定及染色

所有動物以致死量10％水合氯醛腹腔注射麻醉，插管至左心室，先以100mL生理鹽水沖洗血液，再給予500mL含4％多聚甲醛的0.1mol/L磷酸緩沖液（PBS，pH 7.4）灌注固定。灌畢立即取腦，置于上述新鮮固定液中后固定4h，再移入含30％蔗糖的PBS中至組織塊沉底（4℃）。將大鼠腦組織用恒溫切片機作連續(xù)冠狀切片，切片厚度25μm，切片隔2張取一張，分3套收集。

第1套切片行免疫組織化學染色，具體步驟：①切片放入小鼠抗Fos血清（1：500；Chemicon）室溫下孵育18～24h；②生物素標記的二抗室溫下孵育4h；③辣根過氧化酶標記得鏈霉卵白素室溫下孵育30min；④二氨基聯(lián)苯胺（DAB）中呈色，邊反應邊觀察，待免疫陽性細胞呈棕色時以蒸餾水終止反應。上述抗體和復合物的稀釋液均用含0.3％的Triton X-100和0.5％正常羊血清的PBS，各步驟間用PBS徹底清洗片子。最后將切片脫水透明封片并進行觀察。

第2套切片用于正常小鼠血清的孵育，后續(xù)的反應過程同上，進行替代對照試驗。第3套切片進行Nissl染色，用以對照觀察和定位免疫組織化學染色的陽性結果。

2 結果

鏡下切片背景為棕黃色，Fos免疫反應陽性神經元呈深棕黃色或深褐色，形狀呈卵圓形或橢圓形，直徑在5～8um之間，與以往報道相同［4］。

實驗組Fos免疫反應陽性神經元在腦內分布較廣泛，主要集中的高頸段脊髓后角、三叉神經脊束核尾側亞核、中縫核簇、中腦導水管周圍灰質、腳間核、下丘腦、丘腦等部位。其中，高頸段脊髓后角、三叉神經脊束核尾側亞核、中縫核簇、中腦導水管周圍灰質的數量較多，與以往研究報道類似［5］。而對照組的Fos免疫反應陽性神經元在形態(tài)上與實驗組一致，但在分布位置和數量上存在明顯差別：主要分布在中腦導水管周圍，數量較實驗組明顯下降；在高頸段脊髓后角和三叉神經脊束核尾側亞核僅有零散分布?？瞻捉M未發(fā)現Fos免疫反應陽性神經元。

圖1 fos陽性神經元中腦導水管Fig.1 fos-immunoreactive neurons in the aqueduct（Aq）

圖2 fos表達部位的示意圖（The rat brain 5th.Paxinos andWatson）.Fig.2 Drew pictures showing the distribution of fos-immunoreactive neurons.Each black dot indicates 3 positive neurons.

3 討論

即刻早期基因c-fos和它的轉錄產物Fos蛋白作為細胞功能活動狀態(tài)的標志，常常被用于機能與形態(tài)相結合的實驗研究［6］。當細胞受到刺激后，胞核內的c-fos基因mRNA轉移至胞漿并翻譯為Fos蛋白，對該蛋白進行免疫組織化學染色可以間接的反應機能相關的細胞在腦內的分布。但是這種方法的特異性較弱，Fos蛋白對刺激反應敏感，任何刺激（光、溫度、機械或其他刺激）都可以引起表達。因此，在進行用Fos免疫組織化學染色時需要嚴格控制實驗條件，盡量減少外界非特異性刺激，同時進行了對照實驗，以保證結果的特異性［7］。

本實驗的研究結果所呈現的Fos陽性神經元與既往研究一致。與麻醉狀態(tài)下進行的中樞神經系統(tǒng)內Fos染色結果有差異［8］，除了報道的高頸段脊髓后角、三叉神經脊束核尾側亞核外和中腦導水管周圍灰質外，尚有中縫核簇、腳間核、下丘腦和丘腦等部位也觀察到了分布密集的Fos陽性神經元。

我們都知道疼痛的三級神經元傳遞機制：即被根節(jié)（三叉神經節(jié)）-脊髓后角（三叉神經脊束核尾側亞核）-丘腦-皮層。作為疼痛初級中樞，脊髓后角、三叉神經脊束核尾側亞核外和丘腦在有傷害性信息傳遞時細胞呈活躍狀態(tài)是可以理解的［9］。由于頭面部的感覺支配主要是由高頸段和三叉神經的分支，所以在電刺激硬腦膜所致的偏頭痛模型中，高頸段脊髓后角、三叉神經脊束核尾側亞核和丘腦出現Fos陽性神經元，從形態(tài)學角度說明該模型有效模擬了頭面部的疼痛。

在中樞神經系統(tǒng)內存在對疼痛自行調節(jié)的兩個下行系統(tǒng)：即內源性下行抑制系統(tǒng)和易化系統(tǒng)［10］。目前的研究認為兩者均起源于PAG，并經由中縫核簇和藍斑、藍斑下核介導后分布在延髓和脊髓后角，完成其對傷害性信息的調控。在偏頭痛的研究過程中，發(fā)現在人的PAG植入電極并加以刺激可以誘導出偏頭痛樣發(fā)作［11］；由于血管性或炎性病變等破壞PAG可使原本沒有頭痛的病人罹患偏頭痛樣頭痛［12］；神經影像學檢查提示偏頭痛發(fā)作時PAG部位代謝活躍，血流增加，各種證據證明PAG在其發(fā)病和后續(xù)病理生理改變中擔任了重要角色［13］。在本實驗中，PAG和中縫核簇內分布了大量的Fos陽性細胞，說明在刺激后這些部位的神經元激活，符合上述研究結論，但激活后的功能尚需進一步的研究。

腳間核屬于邊緣系統(tǒng)，對其在功能上的認識曾有報道其參與疼痛、情緒等方面的調節(jié)，但具體還不是很清楚。下丘腦是一個非常重要的皮質下中樞，是自主神經系統(tǒng)的最高中樞，控制著機體血壓、心率、呼吸、體溫、胃腸道等，對維持機體內環(huán)境的穩(wěn)定和平衡起著重要作用。同時，下丘腦還參與調控周期性情感，有研究認為下丘腦功能障礙是抑郁癥發(fā)病的機制之一［14］。我們知道在偏頭痛的發(fā)生過程中，一般伴隨有惡心、嘔吐、大汗、心慌等自主神經反應，并且慢性偏頭痛的患者往往伴有抑郁、焦慮等負面情緒甚至病癥，因此在治療時推薦同時抗抑郁或焦慮治療，而且復合治療比單純治療的效果滿意。本實驗中得到的這一結果尚未見有類似報道，麻醉狀態(tài)下的Fos表達并未涉及中腦以上部位，但是由于腳間核和下丘腦在自主神經控制、情感調節(jié)方面功能，所以該結果對偏頭痛的研究是有意義的，可能參與了偏頭痛發(fā)作時伴隨癥狀的發(fā)生。

本實驗對清醒狀態(tài)下電刺激大鼠上矢狀竇硬腦膜模型大鼠的腦內Fos蛋白表達進行了系統(tǒng)的研究，從結果來看激活腦區(qū)主要在高頸段脊髓后角、三叉神經脊束核尾側亞核、中縫核簇、中腦導水管周圍灰質、腳間核、丘腦和下丘腦等部位，從形態(tài)學角度評估了該模型，為進一步的功能及藥物研究提供了基礎。

［1］Benjamin L，Levy MJ，Lasalandra MP，et al.Hypothalamic activation after stimulation of the superior sagittal sinus in the cat：a Fos study［J］.NeurobiolDis，2004，16：500-505.

［2］Welch K，Michael MD，Cutrer F，et al.Migraine pathogenesis：Neural and vascularmechanis ms［J］.Neurology，2003，60：9-14.

［3］Goadsby PJ，Hoskin KL，Kinght YE.Substance P blockade with the potent and centrally acting antagonist GR205171 does not effect central trigeminal activity with superior sagittal sinus stimulation［J］.Neuroscience，1998，86（1）：337-343.

［4］王賀波，于生元，王衛(wèi)東.刺激貓上矢狀竇區(qū)硬腦膜誘發(fā)三叉神經脊束核尾側段和上頸段后角c-fos蛋白的表達［J］.中國疼痛醫(yī)學雜志，2002，8（1）：26-30.

［5］Karen L，Hoskin，David C.E.，Bulmer et al.Fos expression in the midbrain periaqueductal grey after trigeminovascular stimulation［J］.J Anat，2001，198：29-35.

［6］宿長軍，段麗，饒志仁，等.大鼠束縛后腦內Fos蛋白的表達［J］.解剖學報，2005，36：123-126.

［7］劉俊華，趙正卿，雷輝，等.熱應激對大鼠腦橋臂旁核Fos和GFAP表達的影響［J］.神經解剖學雜志.2007，23（4）：367-372.

［8］Hoskin KL，Bulmer DC，Goadsby PJ.Fos expression in the trigeminocervical complex of the cat after stimulation of the superior sagittal sinus is reduced byL-NAME［J］.NeurosciLett，1999，266（3）：173-176.

［9］Chen T，Dong YX，Li YQ.Fos expression in serotonergic neurons in therat brainstem following noxious stimuli：an immunohistochemical double-labelling study［J］.J Anat，2003，203（6）：579-588.

［10］PaceMC，Mazzariello L，PassavantiMB，et al.Neurobiology of pain［J］.J Cell Physiol.2006，209（1）：8-12.

［11］Raskin NH，Hosobuchi Y，Lamb S.Headache may arise from perturbation of brain［J］.Headache，1987，27（8）：416-420.

［12］HaasDC，Kent PF，Friedm8n D I.Headache caused by a single lesion of multiple sclerosis in the periaqueductal gray aera［J］.Headache，1993，33：452-455.

［13］劉若卓，于生元.中腦導水管周圍灰質在大鼠血管源性頭痛模型中的作用［J］.中華神經醫(yī)學雜志，2005，4（7）：672-676.

［14］Wang SS，KamphuisW，Huitinga I，et al.Gene expression analysis in the human hypothalamus in depression by laser microdissection and real-t ime PCR：the presence of multiple receptor imbalances［J］.Mol Psychiatry，2008，13（8）：786-799.