應(yīng)用RAPD標(biāo)記技術(shù)對樹鼩遺傳多樣性的分析

黎家敏，李海燕，李婧瀟，王新興，孫曉梅，代解杰

（中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院北京協(xié)和醫(yī)學(xué)院醫(yī)學(xué)生物學(xué)研究所，昆明 650118）

樹鼩（Tupaia belangeri，tree shrew）在分類學(xué)上屬哺乳綱，有胎盤類，是一個獨(dú)立的目，稱為攀鼩目（Scandentia），主要分布在熱帶和亞熱帶，如東南亞的印度恒河北部、緬甸和越南等地，以及我國云南、廣西和海南等地［1］，中國現(xiàn)野生樹鼩僅有1個種—中緬樹鼩，6個亞種。昆明地區(qū)主要分布的是滇西亞種（Tupaia belangeri chinensis）。隨著靈長類動物資源的逐漸萎縮和模式生物小型化的發(fā)展趨勢，樹鼩因其特殊的分類地位和體型小，易馴養(yǎng)，繁殖能力強(qiáng)，新陳代謝等生理特征和解剖結(jié)構(gòu)比犬、鼠等動物更接近于非人靈長類動物，以及存在諸多自發(fā)性疾病等特性，可以作為某些人類重大疾病研究的動物模型，在醫(yī)學(xué)生物學(xué)上已呈現(xiàn)出廣泛的應(yīng)用前景。目前，樹鼩已被應(yīng)用于病毒、神經(jīng)、免疫、腫瘤和社會生物學(xué)的研究［2］，但對其遺傳背景研究極少，可供參考的遺傳信息匱乏。

Random amplified polymorphie DNA（隨機(jī)擴(kuò)增多態(tài)性DNA，RAPD）標(biāo)記是Williams J［3］和Welsh J［4］于1990年研究發(fā)明的一種新型遺傳標(biāo)記方法，具有隨機(jī)引物易得，無需預(yù)先知道目的基因組DNA序列，標(biāo)記數(shù)量多，易于操作，高靈敏度，材料用量少等優(yōu)點(diǎn)［5］。該技術(shù)已被廣泛應(yīng)用于物種的鑒定［6］、分類和遺傳多樣性研究，包括東方田鼠、長爪沙鼠［7］等實(shí)驗動物［8］。本文通過建立樹鼩RAPD標(biāo)記技術(shù)，開展樹鼩群體遺傳多樣性分析，為樹鼩的野生動物保護(hù)、引種馴化、遺傳育種、繁殖和遺傳監(jiān)測提供理論依據(jù)和方法。

1 材料和方法

1.1 實(shí)驗材料

實(shí)驗所用的樹鼩均為本實(shí)驗室于2007年野外捕捉的中緬樹鼩滇西亞種原代，實(shí)驗隨機(jī)抽取48只樹鼩，分別標(biāo)記為T1-T48，雌、雄各半。分別對樹鼩進(jìn)行股動脈采血2mL，EDTA-Na2抗凝，-20℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2 試劑及儀器

1.2.1 試劑：RAPD引物及其序列（購自上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司），見表1，PCR反應(yīng)試劑盒DRoo1A（Taq酶、dNTP Mixture、10×buffer和6X loading buffer）購于Takara公司，其他實(shí)驗試劑藥品均為實(shí)驗室常用分析級。

表1 RAPD擴(kuò)增引物序列及擴(kuò)增結(jié)果Tab.1 The sequences of primers and results of RAPD analysis

1.2.2 主要儀器設(shè)備：離心機(jī)（Sigma-202MK），PCR和水平電泳儀（Bio-Rad），凝膠自動成像分析儀（Syngene）。

1.3 DNA提取

1.3.1 紅細(xì)胞裂解：將凍存的2mL樹鼩全血于室溫解凍后加入15mL離心管中，在加入2～3倍的紅細(xì)胞裂解液（150μmol/L NH4Cl，10nmol/L KHCO3，1nmol/L Na2EDTA），37℃水浴10min，3 000r/min離心5min，棄掉上清液，重復(fù)1次，直至得到純凈的白色細(xì)胞。

1.3.2 基因組DNA提?。喊捶?氯仿常規(guī)方法提取DNA：向白細(xì)胞沉淀物加入3mL STE buffer（50mmol/L NaCl，10mmol/L Tris-Cl，1mmol/L EDTA），懸浮混勻，加入10％SDS 300μL，15μL 20mg/mL proteinase K，5μL RNase A混勻，37℃水浴過夜，以充分消化。用等體積1：1酚/氯仿、24：1酚/異戊醇各抽提1次。每次3 000r/min離心10min。將上清液移到新的離心管中，加入1/10的3mol/LNaAc和2倍的無水乙醇，離心沉淀DNA。再用70％乙醇沉淀兩次。室溫晾干后。加入適量TE緩沖溶液溶解DNA。用紫外分光光度計在A260/A280處測量DNA，當(dāng)A值為1.8～2.0時，樣品進(jìn)行基因組DNA稀釋至20ng/μL，4℃或-20℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.4 RAPD擴(kuò)增條件

RAPD反應(yīng)總體積為25μL，其中2.5μL 10×buffer（Mg2+plus）、2μL dNTP mixture（各2.5mmol/L）、0.25μL Taq酶（5U/μL）、0.25μL引物（20μmol/L）和5μL DNA（約20ng/μL），用無菌雙蒸水補(bǔ)齊至25μL。RAPD反應(yīng)程序為：94℃預(yù)變性2min，94℃變性1min，40℃退火1min，72℃延伸2min，40個循環(huán)后，再72℃延伸10min。

1.5 RAPD擴(kuò)增產(chǎn)物的電泳

PCR產(chǎn)物用2％的瓊脂糖凝膠（含溴化乙錠）于90V電壓下電泳40min，凝膠置紫外燈下進(jìn)行拍照。

1.6 數(shù)據(jù)統(tǒng)計處理

1.6.1 結(jié)果記錄：分別用“1”和“0”記錄某一擴(kuò)增帶的有無，只記錄清晰且重復(fù)性好的DNA條帶，統(tǒng)計得出所有位點(diǎn)的原始矩陣。

1.6.2 多態(tài)位點(diǎn)百分率：通過多態(tài)位點(diǎn)數(shù)/所測位點(diǎn)總數(shù)×100％計算多態(tài)位點(diǎn)百分率。

1.6.3 個體間遺傳相似系數(shù)：根據(jù)Lynch方法［9］，計算任意兩個個體間遺傳相似系數(shù)（F）：F=2Nxy/（Nx+Ny）；（Nxy一兩個個體共享的位點(diǎn)數(shù)；Nx—x個體的位點(diǎn)數(shù)；Ny—y個體的位點(diǎn)數(shù)）任意兩個個體間的遺傳距離P=1-F。得到群體內(nèi)所有個體兩兩之間比較的平均值。

1.6.4 聚類分析：用RAPDistance Package Version 1.04軟件，構(gòu)建樹鼩48只個體的Neighbor-Joining（NJ）系統(tǒng)樹［10］。

1.6.5 群體遺傳多態(tài)度參考Wachira等［11］的公式，用Popgene 1.32軟件進(jìn)行Shannon多樣性指數(shù)的相關(guān)計算：

（1）各群體遺傳多態(tài)度（H0）H0=-Xiln（Xi/n）（Xi為位點(diǎn)i在某一群體中出現(xiàn)的頻率，n為此群體檢測到的位點(diǎn)總數(shù)）；

（2）平均群體內(nèi)的遺傳多態(tài)度Hpop）Hpop=H0/n（n為所研究的群體數(shù)）；

（3）所研究種類n個群體的遺傳多態(tài)度總量（Hsp）Hsp=-X（X為n個群體的綜合表型頻率）。

2 結(jié)果

2.1 RAPD擴(kuò)增結(jié)果

經(jīng)對40條隨機(jī)引物的篩選，優(yōu)選出20條擴(kuò)增重復(fù)性好、條帶清晰、特異性強(qiáng)的RAPD引物（表1）。應(yīng)用篩選出的引物對48只樹鼩基因組DNA進(jìn)行了RAPD分析。20條隨機(jī)引物及其多態(tài)性結(jié)果見表1和圖1。實(shí)驗結(jié)果共產(chǎn)生113個條帶，各引物檢測到的RAPD位點(diǎn)數(shù)在3～8之間，平均每個引物產(chǎn)生5.65個位點(diǎn)。其中，檢測到的多態(tài)位點(diǎn)69個，多態(tài)位點(diǎn)比率為61.1％.

2.2 遺傳距離

48只樹鼩進(jìn)行RAPD擴(kuò)增得到的遺傳相似系數(shù)介于0.73～0.91之間，平均為0.8307，個體間遺傳距離在0.09～0.27之間，平均遺傳距離為0.1693。這表明個體之間差異很大（表2）。

2.3 雌、雄群體遺傳多樣性

用Shannon多樣性指數(shù)量化中緬樹鼩滇西亞種雌、雄群體遺傳多樣性（表3），樹鼩雌、雄群體平均遺傳多態(tài)度（Hpop）為0.1667，雄性群體的遺傳多態(tài)度（H0）為0.1864，略高于雌性群體的0.1470。由Hpop/Hsp比值可見，引物S37和S12分別檢測出群體內(nèi)最大和最小的遺傳變異分別為0.6286和0.1208。群體內(nèi)的遺傳變異均值為0.4829。而雌、雄群體間的差異（即1-Hpop/Hsp值），平均為0.5171。因此，有48.29％的遺傳變異是在群體內(nèi)檢測到的，而其余部分（51.71％）遺傳變異存在于雌雄群體間。

注：T1-T12分別代表12只樹鼩基因組DNA，C為空白對照，M1為DNA分子量標(biāo)記DL5，000（Takara），M2為DNA分子量標(biāo)記 DNA MarkerⅢ（TIANGEN）.圖1 部分樹鼩個體的RAPD產(chǎn)物電泳圖譜Note：Lane T1 to T12 represent 12 tree shrew individuals，respectively；C：Negative control；LanesM1 andM2 representDNAmolecularweight markerDL5，000（Takara）and DNA markerⅢ（Tiangen），respectively.Fig.1 Electrophoretogram of RAPD fragments produced by S7，S38，S86 and S151 pr imers in some tree shrew individuals

2.4 聚類分析

對20條引物擴(kuò)增所產(chǎn)生的RAPD數(shù)據(jù)進(jìn)行聚類分析得到Neighbor-Joining（NJ）系統(tǒng)樹（圖2）。由圖2可知，T15、T33和T47號樹鼩個體聚類成一大類，其余45只樹鼩個體聚成另一大類。此外，48只樹鼩群體中雌、雄個體呈相互交叉現(xiàn)象。

3 討論

本研究所使用的樹鼩均為野外捕捉于昆明郊區(qū)的中緬樹鼩滇西亞種的成年樹鼩。野生樹鼩的運(yùn)動能力強(qiáng)，活動范圍大，資源豐富，在交配時可形成一雄一雌或一雄多雌的配偶群結(jié)構(gòu)。該研究利用RAPD技術(shù)對中緬樹鼩滇西亞種的48只個體進(jìn)行分析，20條擴(kuò)增效果理想的引物共檢測到113個RAPD位點(diǎn)，其中多態(tài)性位點(diǎn)為69個，占整個研究群體的61.1％，而一些瀕危物種如銀杉（C.argyrophylla）僅為32.08％［12］。實(shí)驗結(jié)果表明，所研究樹鼩群體的遺傳多樣性較高，也符合樹鼩來自野外、群體遺傳結(jié)構(gòu)比較復(fù)雜，個體間的遺傳差異較大的特點(diǎn)。其遺傳多樣性較高，可能是由于野外生活的樹鼩活動范圍較大，種群數(shù)量大，雌、雄個體隨機(jī)交配機(jī)會增多，基因流頻繁的原因。

個體間遺傳相似系數(shù)F是衡量個體間遺傳變異程度的可靠參數(shù)，個體間共有的擴(kuò)增片段越多，F(xiàn)值就越大，表明個體間的親緣關(guān)系越近，遺傳變異越?。?3］。從樹鼩RAPD結(jié)果分析可見，不同個體間的遺傳相似系數(shù)介于0.73～0.91之間，平均為0.8307；群體內(nèi)個體間的遺傳距離平均為0.1693，遠(yuǎn)高于瀕危的滇金絲猴個體間遺傳距離的0.051［14］和一些水生生物如中國黃、渤海沿岸的對嚇（Penaeus chinensis）群的0.0941［15］，但低于龜類動物種群個體間的平均遺傳距離0.324±0.0631［16］。結(jié)果提示，本樹鼩種群的遺傳結(jié)構(gòu)較復(fù)雜，多態(tài)性較高，可有利于樹鼩在逐步實(shí)現(xiàn)實(shí)驗動物化過程中基礎(chǔ)種群的建立，馴化和選育。

通過Shannon多樣性指數(shù)結(jié)果分析可見，樹鼩

種群有48.29％的遺傳變異源于群體內(nèi)，而51.71％遺傳變異在雌、雄群體間產(chǎn)生。此外，聚類分析（NJ系統(tǒng)樹）結(jié)果發(fā)現(xiàn)，雌、雄個體間存在交叉現(xiàn)象。在今后的研究中，有待于擴(kuò)大引物的篩選，選擇更多理想的隨機(jī)引物進(jìn)行RAPD分析，并結(jié)合STR等其他分子標(biāo)記，進(jìn)一步深入開展樹鼩遺傳學(xué)的相關(guān)研究。關(guān)于樹鼩遺傳多態(tài)性分析，國內(nèi)外文獻(xiàn)報道較少，僅Srikwan［17］和Munshi-South［18］將分離出的6個泰國樹鼩（Tupaia glis）和5個馬來西亞樹鼩（Tupaia spp.）微衛(wèi)星為位點(diǎn)，并用于樹鼩遺傳多態(tài)性的研究。但因不同地理位置、不同種類的樹鼩存在遺傳差異性，現(xiàn)有可利用的位點(diǎn)極少以及微衛(wèi)星分子標(biāo)記來源困難等問題，經(jīng)濟(jì)而實(shí)用的RAPD技術(shù)可作為分析我國樹鼩遺傳背景的很好補(bǔ)充。

表2 樹鼩個體間遺傳相似性和遺傳距離（％）Tab.2 Similarity index of fragments and genetic distances among individuals of the tree shrews（％）

表3 樹鼩雄、雌群體內(nèi)和群體間的遺傳多樣性Tab.3 The genetic diversity with in and between male and female tree shrew populations

圖2 樹鼩48個個體（T1-T48）間的NJ系統(tǒng)樹Fig.2 NJ tree for 48（T1-T48）tree shrew individuals

綜上所述，昆明地區(qū)所分布的野生中緬樹鼩滇西亞種，具有遺傳多態(tài)性較高、群體遺傳結(jié)構(gòu)復(fù)雜等特點(diǎn)。雖然RAPD存在顯性位點(diǎn)在后代中不能區(qū)別是純合體還是雜合體，容易受其他因素影響造成穩(wěn)定性和重復(fù)性較差等缺點(diǎn)，但其具有操作簡單、快捷、成本低而高效等諸多優(yōu)點(diǎn)。本研究表明，只要優(yōu)化RAPD反應(yīng)條件和嚴(yán)格控制其他實(shí)驗影響因素，RAPD技術(shù)完全可用于樹鼩種群遺傳組成與遺傳多樣性變化的分析和監(jiān)測，為今后樹鼩種群的種質(zhì)保護(hù)，合理開發(fā)利用和選擇育種以及實(shí)現(xiàn)樹鼩實(shí)驗動物標(biāo)準(zhǔn)化提供一定的理論依據(jù)，還可以為深入研究樹鼩與其他物種的親緣關(guān)系、居群及種系遺傳的分析、構(gòu)建分子標(biāo)記連鎖圖、基因定位和數(shù)量性狀的選擇等提供了一種研究方法。隨著該技術(shù)在這些領(lǐng)域的拓展應(yīng)用，必將加深人們對樹鼩遺傳規(guī)律的認(rèn)識和進(jìn)一步開展利用樹鼩在生物醫(yī)學(xué)領(lǐng)域各個方面的研究。

（致謝：感謝首都醫(yī)科大學(xué)陳振文教授在論文撰寫方面的精心指導(dǎo)和幫助。）

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