組織相容性復(fù)合體在實驗雞中的應(yīng)用

高彩霞,韓凌霞,韓建林

(1.中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院哈爾濱獸醫(yī)研究所實驗動物中心,哈爾濱 150001;

2.甘肅農(nóng)業(yè)大學(xué)動物科學(xué)技術(shù)學(xué)院,蘭州 730070; 3.中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院國家家畜研究所畜禽牧草遺傳資源聯(lián)合實驗室,北京 100094)

專家論壇

組織相容性復(fù)合體在實驗雞中的應(yīng)用

高彩霞1,2,韓凌霞1,韓建林3

(1.中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院哈爾濱獸醫(yī)研究所實驗動物中心,哈爾濱 150001;

2.甘肅農(nóng)業(yè)大學(xué)動物科學(xué)技術(shù)學(xué)院,蘭州 730070; 3.中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院國家家畜研究所畜禽牧草遺傳資源聯(lián)合實驗室,北京 100094)

雞主要組織相容性復(fù)合體(MHC)基因位于雞 16號染色體上,具有高度的多態(tài)性?，F(xiàn)已發(fā)現(xiàn),不同MHC-B單倍體對各種疾病的抗性不同。本文主要介紹了雞MHC的結(jié)構(gòu)特點、雞MHC與抗病性的關(guān)系、雞MHC檢測方法的研究進(jìn)展以及其在雞抗病育種中的應(yīng)用前景。

雞MHC;抗病育種;遺傳質(zhì)量控制

雞作為實驗動物最早可以追溯到 1789年P(guān)asteur用雞做雞霍亂的研究,近年來為了應(yīng)對越來越復(fù)雜的禽傳染病研究,對實驗動物雞的質(zhì)量要求也越來越高。而且作為實驗動物,不允許進(jìn)行疫苗免疫和使用抗生素,因此微生物質(zhì)量的保證和敏感品系的建立只能通過遺傳學(xué)選育的方式。雞主要組織相容性復(fù)合體 (major histocompatibility complex, MHC)是目前發(fā)現(xiàn)的多態(tài)性最豐富的基因群,與各種疾病高度相關(guān),是禽病免疫學(xué)研究和疾病防控技術(shù)研究的主要候選基因。例如美國 ADOL(The Avian Disease and OncologyLaboratory)根據(jù)MHC單倍體已經(jīng)建立了多種近交系和同類系實驗雞群,為闡明包括多種腫瘤性疾病的致病機(jī)理和確定致瘤相關(guān)基因提供了不可代替的實驗材料[1]。本文將對雞MHC的結(jié)構(gòu)特點、雞MHC-B單倍體與疾病的抗病性關(guān)系及檢測方法做一綜述。

1 雞M HC的結(jié)構(gòu)特點

雞MHC作為血型群基因座首先被發(fā)現(xiàn),也稱為復(fù)合體[2]。雞 B血型基因座與基因控制組織相容性有關(guān)[3],它是由緊密連鎖、高度多態(tài)的基因座位組成的一個遺傳區(qū)域,與核仁組織區(qū)(NOR)相連鎖,高度多態(tài)和保守。它包含 B基因座和 Rfp-Y基因座兩個基因座,它們均被定位于 16號染色體上,但二者在遺傳上不連鎖。

B基因座主要包括三個高度多態(tài)的基因座:B-F (Class I)、B-L(Class II)和 B-G(Class IV),分別編碼細(xì)胞表面的 I類、II類和 IV類抗原[4]。其中 I類和 II類與哺乳動物中相應(yīng)染色體上的糖蛋白分子在結(jié)構(gòu)、功能、組織分布和存在的 T淋巴細(xì)胞表面抗原等相似, IV類抗原是禽類所特有,在紅細(xì)胞上和特定的間質(zhì)細(xì)胞以及腸上皮細(xì)胞中有其表達(dá)產(chǎn)物。這 3個基因座雖然是高度多態(tài)的,但它們之間的重組率卻較低[5]。B-F和 B-L基因同處 B-F/B-L亞區(qū),雞MHC的 B-F/B-L區(qū)結(jié)構(gòu)簡單、緊湊,在 92 kb的DNA中包含 19個基因,與 B-G亞區(qū)緊密連鎖。從 Class IIβ基因延伸到 Class I基因的中心區(qū)域尤其緊湊,沒有重復(fù)單位,此區(qū)域 11個基因的內(nèi)含子長為 200 nt,基因間距 (不包括啟動子)只有 30 nt,使得總長度約為 44 kb,大約只有哺乳動物同源物的 1/3,比人的MHC小 20倍 (圖 1)[6]。

脊椎動物MHC基因中,Class II類基因分別由編碼 Class II類抗原分子的α鏈、β鏈基因所組成,但雞的 class IIα(B-LA)基因位于離 B基因座的 5 cM處[7],不在 MHC區(qū)域內(nèi),所以通常所說的雞MHC II類基因一般指B-LB基因。根據(jù)序列相似性雞B-LB基因分為 3個基因家族:B-LBII家族(包括B-LB I和 B-LB II基因)、B-LBIII家族 (包括 B-LBⅢ、Ⅳ、Ⅴ基因)和 B-LBⅥ基因[8]。三個家族的基因數(shù)目在雞MHC每個單倍體中均有差異,有 1～3個 B-LB II基因,1～3個 Y-LB(BLB III)基因,沒有或只有一個B-L B V I基因。

Rfp-Y基因座是第二個具有多態(tài)性且獨(dú)立遺傳的一組MHC基因,也包括多態(tài)的 I類基因、II類基因、C-型植物血凝素 (lectin)基因和其它基因座位[9,10]。

2 雞M HC與抗病性的關(guān)系

MHC單倍體分型在雞的抗病性研究中具有重要意義,已報道的有與雞馬立克氏病 (Marek’s disease,MD)、禽流感 (Avian influenza,A I)、勞氏肉瘤病 (Rous sarcoma,RS)、禽白血病 (Avian leukosis, AL)、傳染性法氏囊病 (Infectious bursal disease, I

BD)、禽傳染性支氣管炎 (Infectious bronchitis, IB)、球蟲病以及沙門氏菌 (Sa lm onella enteritidis,SE)和大腸桿菌 (E.coli)等細(xì)菌性疾病抗性的關(guān)系,見表1。

由表 1可看出,研究最多的單倍體包括B2、B5、B12、B13、B15、B19和 B21?？共⌒暂^好的單倍體有B2、B12和B21,而抗性較差的有B5、B13、B15和B19,例如B5和B13對所研究的病毒均有明顯的易感性,但對于多數(shù)單倍體來說,對不同疾病的抗性不同,如 B2對MD、 IBD和 RS有抗性,卻易感ALV和球蟲;B21對MD、A I、 IBD和球蟲病抗性強(qiáng),死亡率低,但對AL、 IB和大腸桿菌抗性弱;B12對AL和RS有抗性,卻易感 IBDV;對病毒似乎有較廣泛的易感性;B19對AL有抗性,卻對MDV、 IBDV和球蟲易感。當(dāng)然,這些疾病的抗性一般都是由多基因控制,這些基因中既有B復(fù)合體,又有非MHC基因也可能起著重要的作用。

圖 1 B12單倍體的B-F/B-L區(qū)的基因序列 (Kaufman,et al.1999)Fig.1 Gene sequences ofB-F/B-L region ofB12 haplotype

表1 雞MHC-B單倍體與各種疾病抗性的關(guān)系Tab.1 The relation be tweenMHC-B haplotypes and disease resistance

3 實驗雞M HC檢測方法的研究進(jìn)展

實驗動物的遺傳質(zhì)量對生命科學(xué)研究中動物實驗結(jié)果的準(zhǔn)確性、重復(fù)性及科學(xué)性有重要影響。我國實驗動物遺傳檢測工作起步較晚,目前只有針對近交系小鼠和大鼠的生化標(biāo)記位點國家檢測標(biāo)準(zhǔn),尚無實驗禽類的遺傳學(xué)檢測標(biāo)準(zhǔn)。從上世紀(jì)八十年代開始,分子遺傳學(xué)的理論和技術(shù)飛速發(fā)展,產(chǎn)生了一系列高新技術(shù)手段,應(yīng)用較廣泛的有:限制性片段長度多態(tài)性 (restriction fragment length polymorphis m,RFLP)、隨機(jī)引物擴(kuò)增多態(tài)性 DNA (random amplified polymorphis m DNA,RAPD)、擴(kuò)增片段 長 度 多 態(tài) 性 (amplified fragmentlength polymorphis m,AFLP)、微衛(wèi)星 DNA標(biāo)記技術(shù)(microsatellite DNA,Ms DNA)和單核苷酸多態(tài)性(single nucleotide polymorphis m,SNP)等。

RFLP是最早研究并應(yīng)用的分子標(biāo)記之一。其基本原理是基因組DNA由于突變,增加或減少了某些限制性內(nèi)切酶位點,在限制性內(nèi)切酶作用下產(chǎn)生大小不等的 DNA片段。RFLP在各種生物的各類DNA中普遍存在,只要有探針就可以檢測不同物種同源DNA分子的 RFLP;無表型效應(yīng),其檢測不受環(huán)境、性別及年齡的影響;等位基因間呈共顯性,非等位基因間無基因互作效應(yīng)。但是,多數(shù) RFLP突變率太低,位點信息含量較低,且費(fèi)用昂貴,操作復(fù)雜,檢測周期長,不適用于分析樣本量較大的群體,還有一個主要的缺陷,就是克隆可表現(xiàn)基因組DNA多態(tài)性的探針較為困難。

RAPD是利用隨機(jī)脫氧核苷酸序列引物擴(kuò)增基因組DNA,擴(kuò)增的不同DNA片段反映了基因組相應(yīng)區(qū)域的 DNA多態(tài)性。RAPD擴(kuò)增引物沒有物種和數(shù)量上的限制,一套引物可用于不同物種基因組分析而且可以囊括基因組中所有位點,其技術(shù)簡捷方便,可進(jìn)行大量樣品的篩選。但引物模板的非特異配對使 RAPD產(chǎn)物對 PCR反應(yīng)條件非常敏感,穩(wěn)定性、重復(fù)性和可比性較差,而且它作為顯性標(biāo)記,不能鑒別雜合子和純合子。

AFLP是將基因組 DNA進(jìn)行限制性內(nèi)切酶酶切,然后選擇特定的片段進(jìn)行 PCR擴(kuò)增,使用雙鏈人工“接頭”與基因組DNA的酶切片段相連接作為擴(kuò)增反應(yīng)模板,“接頭”與“接頭”相鄰的酶切片段的幾個堿基序列作為引物的結(jié)合位點。AFLP技術(shù)對基因組 DNA質(zhì)量要求較高,操作成本也相對較高,且所得到的分子標(biāo)記多為顯性標(biāo)記。

微衛(wèi)星DNA是指以少數(shù)幾個核苷酸(多為 1～6 bp)為單位構(gòu)成核心序列,經(jīng)多次串聯(lián)重復(fù)形成的DNA片段,由兩側(cè)保守的側(cè)翼序列定位于染色體上,核心序列重復(fù)數(shù)的差異形成微衛(wèi)星的高度多態(tài)性。微衛(wèi)星 DNA能夠準(zhǔn)確判定變異位點,敏感性高、樣本需要量少、簡便快速,但操作復(fù)雜;工作量大;判型主觀性大,成本高。

SNP是生物體基因組中存在最廣泛的一類變異,由堿基置換、插入或缺失等單堿基突變造成位點多態(tài)性,因此由點突變引起的 RFLP也屬于 SNP。它們是所有基因組中可以檢測到的最普遍的多態(tài)性,大多數(shù)的基因型變異可以導(dǎo)致表型發(fā)生變化。SNP遺傳穩(wěn)定,在基因組中的數(shù)目多,覆蓋密度大,檢測快速高效,但它與 RFLP一樣,突變率太低,由于 SNP在任一特定位點上只有 2個等位基因,因此,與簡單序列長度多態(tài)性相比,多態(tài)信息含量很有限。

4 展望

由于雞MHC單倍體型與機(jī)體的免疫應(yīng)答密切相關(guān),且遺傳穩(wěn)定,是研究實驗禽抗病性、與病原體相互作用機(jī)制極好的遺傳標(biāo)記,最終為禽病學(xué)研究和防制措施的建立提供依據(jù)。

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Application ofMajor Histocompatibility Complex in Laboratory Chickens

GAO Cai-xia1,2,HAN Ling-xia1,HAN Jian-lin3
(1.LaboratoryAn imal Center of Harbin Veterinary Research Institute,CAAS,Harbin 150001,China; 2.College ofAnimal Science and Technology of Gansu AgriculturalUniversity,Lanzhou 730070; 3.CAAS- ILR IJointLaboratory ofLivestock and Forage Genetic Resources,Institute of Animal Science,Chinese Academy ofAgricultural Sciences,Beijing 100094)

Chicken major histocompatibility complex(MHC)has been a research focus for its high polymorphism and close relation with varying resistance against diseases.It is located on a microchromosome(chromosome 16).It has been found that it has different resistance against diseases for different B haplotypes. The article gives a detailed introduction about structural characteristics,relation to diseases resistance,the progress in detection methods of chicken MHC,and the prospect of application ofMHC in molecular breeding for disease resistance in chickens.

ChickenMHC;Breeding,disease resistance;Genetic quality control

R-33

A

1671-7856(2010)02-0001-05

2009-11-15

高彩霞(1982-),女,甘肅農(nóng)業(yè)大學(xué)在讀博士。E-mail:gaocx78@163.com。

韓凌霞,副研究員。E-mail:hlx1993@126.com;韓建林,研究員。E-mail:hanjl@iascaas.net.cn。

本文由《中國比較醫(yī)學(xué)雜志》副主編曲連東研究員推薦