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    STK15的表達對NIH3T3細胞的影響

    2010-02-16 14:55:40王祿增董婉維鄭志紅
    中國比較醫(yī)學雜志 2010年2期
    關(guān)鍵詞:室溫孵育質(zhì)粒

    朱 焱,王祿增,楊 威,于 洋,王 維,董婉維,汪 瑛,秦 英,鄭志紅

    (1.中國醫(yī)科大學實驗動物部,沈陽 110001;2.沈陽市公安醫(yī)院,沈陽 110001)

    STK15基因是絲/蘇氨酸激酶家族成員之一[1]。STK15基因是一種與中心體結(jié)構(gòu)及功能緊密相關(guān)的基因,并具有高水平的酪蛋白激酶活性[2]。STK15基因的擴增和過表達使中心體異常擴增,從而導致染色體的異常分配及不穩(wěn)定,最終癌基因激活,導致腫瘤產(chǎn)生[3],所以STK15的過表達與腫瘤的發(fā)生存在一定的聯(lián)系。本實驗構(gòu)建了pcDNA3.1-STK15質(zhì)粒,并將其瞬時轉(zhuǎn)染NIH3T3,觀察STK15高表達對NIH3T3細胞的影響,以進一步闡明STK15基因在腫瘤發(fā)生發(fā)展中的作用。

    1 材料和方法

    1.1 實驗材料

    脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染試劑、DMEM培養(yǎng)基、TR IZOL均購自Invitrogen。反轉(zhuǎn)錄試劑盒、回收試劑盒均購自Qiagen。限制性內(nèi)切酶、TaqE、dNTP、連接試劑盒、小量質(zhì)粒提取試劑盒均購自TaKaRa。小牛血清購自天津灝洋。兔抗人STK15多克隆抗體購自AbD Serotec。HRP標記的山羊抗兔的二抗購自中山公司。S-P試劑盒購自福州邁新生物技術(shù)公司。MTT購自華美公司。重組人基底膜購自BD公司。

    1.2 實驗方法

    1.2.1 構(gòu)建質(zhì)粒pcDNA3.1-STK15:提取人胚肺細胞總RNA,RT-PCR方法擴增STK15cDNA全長,克隆到pTZ57R/T載體,測序。BamH1和XbaI雙酶切pcDNA3.1和T-STK15連接產(chǎn)物,回收、連接、轉(zhuǎn)化、鑒定,構(gòu)建pcDNA3.1-STK15質(zhì)粒。

    1.2.2 細胞轉(zhuǎn)染:將對數(shù)生長期細胞(PcDNA3.1、PcDNA3.1-STK15轉(zhuǎn)染NIH3T3細胞)接種于6孔板,轉(zhuǎn)染后培養(yǎng)48h。

    1.2.3 RT-PCR:提取細胞RNA,RT-PCR試劑盒檢測STK15的表達,擴增片段的長度為498bp。

    1.2.4 Western印跡分析:PBS洗2次,裂解液冰上孵育30min,12 000r/min,4℃離心30min,上清液即細胞蛋白。然后加樣、電泳、轉(zhuǎn)膜、封閉,加入1∶500的兔抗人的STK15多克隆抗體,室溫震蕩2h,洗膜3次,加入1∶2 000的山羊抗兔的二抗,室溫震蕩1h,洗膜3次,顯色。

    1.2.5 免疫細胞化學:將轉(zhuǎn)染后的細胞傳代于有載玻片的六孔板中,次日取出玻片,固定30min。加過氧化物酶阻斷液,室溫下孵育10min,PBS洗3次。封閉,室溫下孵育10min,甩去血清。加一抗(兔抗人STK15抗體1:500稀釋)4℃、過夜,PBS洗3次。加生物素標記的第二抗體,室溫下孵育10min,PBS洗3次。加鏈霉素—過氧化物酶溶液(D),室溫下孵育10min,PBS洗3次。加DAB顯色,自來水沖洗,蘇木素復染30s,返藍,50%甘油封片。

    1.2.6 MTT方法:每孔3 000個細胞(NIH3T3細胞、pcDNA3.1轉(zhuǎn)染的NIH3T3細胞、pcDNA3.1-STK15轉(zhuǎn)染的NIH3T3細胞)接種于96孔板,在24、48、72h加入MTT(終濃度5mg/mL),37℃、孵育4h,棄上清,加入DMSO 150μL,低速震蕩10min,分光光度計490nm讀取A值。每組設8個復孔,共重復3次。

    1.2.7 Transwell小室法:人工基底膜膠冰浴過夜融化,用預冷的無血清的DMEM培養(yǎng)液1:5稀釋,吸取100μL包被于Trans well小室濾膜上,置5%CO2、37℃、培養(yǎng)24h。上室接種轉(zhuǎn)染的NIH3T3細胞(約2.5×104個細胞)100μL,下室加入10%FBS的DMEM 600μL作為趨化因子,置5%CO2、37℃、培養(yǎng)24h。取出Transwell小室,濾膜用多聚甲醛固定15min,蘇木素染核,200倍顯微鏡下計數(shù)上下左右中5個視野的侵襲細胞數(shù),計算平均值。上述實驗重復3次。

    2 結(jié)果

    2.1 RT-PCR

    轉(zhuǎn)染后48h,pcDNA3.1-STK15轉(zhuǎn)染組擴增出498bp目的基因片段,而pcDNA3.1轉(zhuǎn)染組未能擴增出片段(圖1)。

    2.2 STK15的蛋白表達

    與轉(zhuǎn)染空載體組相比,STK15轉(zhuǎn)染組在48h后可檢測到STK15蛋白表達的上調(diào)。(圖2)

    2.3 免疫細胞化學

    藍色為蘇木素染色的細胞核,棕紅色為DAB標記的STK15蛋白表達陽性區(qū),表明STK15質(zhì)粒轉(zhuǎn)染組(圖3.3)大部分STK15蛋白表達陽性,pcDNA3.1轉(zhuǎn)染組(圖3.2)和普通NIH3T3細胞(3.1)中,沒有STK15蛋白表達(圖3見彩插2)。

    2.4 MTT檢測

    轉(zhuǎn)染STK15質(zhì)粒的NIH3T3細胞的生長增殖在48、72h顯著高于對照組(P<0.05)。(圖4)

    2.5 Transwell結(jié)果

    用平均穿膜細胞數(shù)標化成相對數(shù)后進行統(tǒng)計作圖(圖5)。STK15轉(zhuǎn)染組的細胞穿膜細胞數(shù)為258.45±4.95,而NIH3T3細胞和pcDNA3.1轉(zhuǎn)染組的細胞分別為20.50±4.65和21.00±5.56,,差異均有統(tǒng)計學意義(t分別 =276.00、38.47,P<0.05)。

    M:DL2000;1:陰性對照;2:N IH3T3細胞中STK15mRNA的表達;3:pcDNA3.1轉(zhuǎn)染組STK15mRNA的表達;4:pcDNA3.1-STK15轉(zhuǎn)染組 STK15mRNA的表達;5:陽性對照。圖1 STK15mRNA在轉(zhuǎn)染NIH3T3細胞中的表達M:DNA markerDL2000;1:Negative control;2:Product of STK15 in NIH3T3 cells;3:Product of STK15 transfected by pcDNA3.1;4:Product of STK15 in the cells transfected by pcDNA3.1-STK15;5:Positive control.Fig.1 Expression of STK15 mRNA in the pcDNA3.1-STK15-transfectN IH3T3 cells

    1:NIH3T3細胞STK15蛋白的表達;2:pcDNA3.1轉(zhuǎn)染組STK15蛋白的表達;3:pcDNA3.1-STK15轉(zhuǎn)染組STK15蛋白的表達圖2 Western blot檢測STK15蛋白表達1:Product of STK15 of N IH3T3 cells;2:Product of STK15 of cells transfected by pcDNA3.1;3:Product of STK15 of cells transfected by pcDNA3.1-STK15;1:Product ofβ-actin ofN IH3T3 cells;2:Product ofβ-actin of cells transfected by pcDNA3.1;3:Product oβf-actin of cells transfected by pcDNA3.1-STK15Fig.2 The results of STK15 protein expression assayed byWestern blot

    圖4 兩組細胞不同時間點的MTT檢測情況Fig.4 MTT test results of the cells from two groups measured at different times

    圖5 體外跨室趨化運動實驗中,質(zhì)粒pcDNA3.1-STK15轉(zhuǎn)染組與pcDNA3.1轉(zhuǎn)染組及NI H3T3細胞比較Fig.5 Comparason of the results of Transwell test of the pcDNA3.1plas mid-transfected cellsandpcDNA3.1-STK15 plasmid transfected cells,and N I H3T3 cells.

    3 討論

    近年來腫瘤研究發(fā)現(xiàn),腫瘤與基因異常密切相關(guān)。STK15基因是有絲分裂器的基本調(diào)控蛋白,在中心體調(diào)節(jié)、紡錘體形成、染色體分離、胞質(zhì)分裂,即有絲分裂的正常進行中發(fā)揮至關(guān)重要的作用。它的過表達可引起中心體擴增,染色體不穩(wěn)定,非整倍體的形成而導致腫瘤的發(fā)生[4]。

    本實驗表明,體外轉(zhuǎn)染pcDNA3.1-STK15質(zhì)粒可以有效地使STK15在NIH3T3細胞中高表達,說明細胞轉(zhuǎn)染成功,MTT結(jié)果表明轉(zhuǎn)染pcDNA3.1-STK15質(zhì)粒組的細胞增殖速率明顯高于對照組(p<0.05)說明STK15基因可以使細胞的生長速度加快,進而形成細胞的惡性增殖,誘發(fā)腫瘤;Katayama等[5]發(fā)現(xiàn)抑制STK15的表達可致細胞分裂停滯于G2/M交界點附近,認為STK15可磷酸化p53蛋白,促進了Mdm2介導的p53蛋白泛素化及降解,減弱了p53介導的細胞有絲分裂監(jiān)視點機制,促進細胞周期進程,使細胞的生長增殖加快;還有人發(fā)現(xiàn)在細胞G2/M轉(zhuǎn)換與STK15磷酸化另一下游抑癌基因產(chǎn)物-BRCA1蛋白有關(guān),認為對細胞G2/M轉(zhuǎn)換同樣是必需的[6];以上結(jié)論最終說明STK15基因的過表達使細胞增殖速度加快。

    本實驗采用Trans well小室檢測STK15對細胞體外侵襲力的影響,癌細胞要穿透人工基底膜和直徑只有8μm的聚碳酸酯微孔濾膜,需要降解Matrigel成分。而且穿透Matrigel膜涉及細胞的粘附、基質(zhì)降解和移動3個過程,這與在人體內(nèi)的浸潤繼而轉(zhuǎn)移過程完全相似。實驗結(jié)果表明,轉(zhuǎn)染pcDNA3.1-STK15質(zhì)粒組的細胞穿透Matrigel基底膜的細胞數(shù)明顯高于對照組(P<0.05),而且質(zhì)粒轉(zhuǎn)染組表現(xiàn)出比對照組高20倍以上的跨膜運動能力,充分表現(xiàn)出了STK15的高表達可以提高NIH3T3細胞的轉(zhuǎn)化能力和腫瘤化能力。綜合以上兩點,我們認為將STK15基因轉(zhuǎn)染NIH3T3細胞提高了NIH3T3細胞的增殖速度和體外侵襲能力,這可能是形成腫瘤發(fā)病機制之一。

    鑒于STK15基因與惡性腫瘤的關(guān)系如此密切,不少研究者已經(jīng)將STK15基因作為研制抗腫瘤新藥的靶子。各種能抑制STK15基因的擴增、表達及其生物學活性的物質(zhì)已成為大家研究的焦點。Tong等[7]人將特異性抑制STK15基因表達的外源性siRNA體外瞬時轉(zhuǎn)染人的食管癌細胞系,結(jié)果發(fā)現(xiàn),在轉(zhuǎn)染后48h和72h轉(zhuǎn)染siRNA的人食管癌細胞的侵襲能力明顯低于未轉(zhuǎn)染的人食管癌細胞的侵襲能力。Hamada等[8]用STK15基因和STK15反義基因轉(zhuǎn)染B細胞淋巴瘤細胞系,發(fā)現(xiàn)STK15反義基因轉(zhuǎn)染的細胞系增殖率更低,并且停頓于G1期的細胞明顯增多,此外抑制細胞增殖的程度與反義寡核苷酸的濃度成正比。隨著研究的深入,STK15基因必將為惡性腫瘤的治療提供新的有效手段,對今后癌癥的早期診斷和早期治療均具有重要的臨床意義。

    [1]ReichardtW,Jung V,Brunner C,et al.The putative serine/threoninekinasegeneSTK15onchromosome 20q13.2 is amplified in human gliomas[J].Oncol Rep,2003,10:1275-1279.

    [2]Jeng Y M,Peng SY,Lin CY,et al.Overexpression and amplification of Aurora-A in hepatocellular carcinoma.[J].Clin Cancer Res,2004;15,10(6):2065-2071.

    [3]Miyoshi Y,Iwao K,Egawa C,et al.Association of centrosomal kinaseSTK15/BTAK mRNA expressionwith chromosomal instability in human breast cancers[J].Int J Cancer,2001,92:370-373.

    [4]葉燕,李福才,王淑云.喉癌中STK15基因擴增及表達的研究[J].中華醫(yī)學遺傳學雜志,2006,23(3):326-329.

    [5]Katayama H,Sasai K,Kawai H,et al.Phosphorylation by aurora kinase A induces Mdm22mediated destabilization and inhibition of p53.Nat Genet,2004,36:55-262.

    [6]Hannak E,Kirkham M,Hyman A,et al.Aurora A kinase is required for centrosome maturation in Caenorhabditis elegans[J].J CellBiol,2001,155:1109-21116.

    [7]Tong T,Zhong Y,Kong J,et al.Overexpression of aurora-A contributes to malignant development of human esophageal squamous cell carcinoma[J]Clin Cancer Res,2004,10(21):7304-7310.

    [8]Hamada M,Yakushijin Y,Ohisuka M,et al.Aurora/BTAK/STK15 is involved in cell cycle check point and cell survival of aggressive non-Hodgkin lymphoma[J].Br J Haematol,2003,121(3):439-447.

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