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    內(nèi)皮抑素30肽基因真核表達(dá)載體的構(gòu)建及實(shí)驗(yàn)研究

    2010-02-16 14:55:36袁麗杰劉遠(yuǎn)莉趙恒宇劉興漢
    中國比較醫(yī)學(xué)雜志 2010年2期
    關(guān)鍵詞:抑素內(nèi)皮質(zhì)粒

    袁麗杰,劉遠(yuǎn)莉,趙恒宇,劉興漢

    (1.哈爾濱醫(yī)科大學(xué)大慶校區(qū),大慶 163319;2.大慶油田總醫(yī)院;大慶 1633001;3.哈爾濱醫(yī)科大學(xué);哈爾濱 150081)

    內(nèi)皮抑素(endostatin)通過抑制血管生成間接限制腫瘤細(xì)胞生長[1]。內(nèi)皮抑素治療腫瘤具有廣譜、低毒、不產(chǎn)生耐藥性等優(yōu)點(diǎn)[2]。用內(nèi)皮抑素治療腫瘤只是限制腫瘤細(xì)胞生長,并沒有消滅腫瘤細(xì)胞,停藥后腫瘤會(huì)復(fù)發(fā)。因此需要長期用藥,反復(fù)注射。國內(nèi)外都有研究者試圖采用基因療法,在體內(nèi)直接持續(xù)表達(dá)內(nèi)皮抑素以避免反復(fù)注射給病人帶來的痛苦。由于表達(dá)水平等多種原因,結(jié)果并不令人滿意。

    2004年,本課題組運(yùn)用定點(diǎn)誘變技術(shù)將人內(nèi)皮抑素中的RGI RGAD改為RGDRGD,獲得更強(qiáng)抗腫瘤活性的重組內(nèi)皮抑素[3]。2005年,Tjin Tham Sjin等[4]發(fā)現(xiàn)內(nèi)皮抑素抗腫瘤活性區(qū)主要在N端的1~27個(gè)氨基酸。隨后,本課題組在保留內(nèi)皮抑素的N端抗腫瘤活性區(qū)的基礎(chǔ)上,引入RGD串聯(lián)序列,組成30肽[5]。實(shí)驗(yàn)表明,此30肽在細(xì)胞體外培養(yǎng)實(shí)驗(yàn)中對(duì)臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞生長抑制活性是內(nèi)皮抑素的4倍,對(duì)胃癌細(xì)胞生長抑制活性是內(nèi)皮抑素的5倍。對(duì)小鼠體內(nèi)肝癌的抑瘤率幾乎比內(nèi)皮抑素翻了一番,由于提高了抗腫瘤活性,推測將此30肽基因轉(zhuǎn)入動(dòng)物體內(nèi),即使表達(dá)水平稍低一些,也有可能產(chǎn)生較好的治療作用。本文采用被FDA批準(zhǔn)可進(jìn)行人體實(shí)驗(yàn)的質(zhì)粒pVAX1,構(gòu)建表達(dá)分泌型內(nèi)皮抑素的重組載體pVAX1-30E,探討體內(nèi)直接注射該重組載體對(duì)小鼠體內(nèi)肝癌生長的影響。

    1 材料和方法

    1.1 試劑和質(zhì)粒

    限制性內(nèi)切酶EcoRI、BamHI、BstXI,T4-DNA連接酶,質(zhì)粒pVAX1購自Invitrogen公司;內(nèi)皮抑素ELISA檢測試劑盒購自O(shè)ncogene公司;質(zhì)粒小量抽提試劑盒、DNA膠回收試劑盒購自上海生工生物工程公司;含有人內(nèi)皮抑素30肽的質(zhì)粒pTYB-30E由本室構(gòu)建并保存;通用型二步法免疫組化PictureTM試劑盒,一抗:CD34(1:100),PCNA(1:200)購自北京中山生物技術(shù)有限公司;HE染色試劑為Bio-Rad公司產(chǎn)品。

    1.2 細(xì)胞和動(dòng)物

    小鼠H22肝癌細(xì)胞由哈爾濱醫(yī)科大學(xué)免疫教研室李殿俊教授惠贈(zèng),5~6周齡BALB/C鼠購自哈爾濱醫(yī)科大學(xué)動(dòng)物中心,合格證號(hào):SCXK黑20020002。

    1.3 引物合成

    根據(jù)內(nèi)皮抑素30肽基因序列設(shè)計(jì)引物,P1引物5′端為BamHI酶切位點(diǎn)和兩個(gè)保護(hù)堿基,隨后是膠原蛋白XVIII信號(hào)肽編碼序列,內(nèi)皮抑素氨基端6個(gè)氨基酸殘基的編碼序列,具體序列如下:5′-ACGGATCCATGGCTCCGTACCCATGTGGCTGCCAC ATCCTGCTGCTGCTCTTCTGCTGCCTGGCGGCTGCCA GA GCGCACAGCCACCGTGACTTC-3′.P2引物5’端加入EcoRI酶切位點(diǎn)及保護(hù)堿基,終止密碼,具體序列如下:5′-CGGAATTCTTAGTCACCACGG TCACC-3′。上述引物由上海博亞生物工程公司合成。

    1.4 重組真核表達(dá)載體的構(gòu)建

    以本課題組構(gòu)建的內(nèi)皮抑素30肽原核表達(dá)載體pTYB-30E質(zhì)粒為模板,P1、P2為引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增內(nèi)皮抑素30肽基因。擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)電泳鑒定,用BamHI和EcoRI雙酶切。質(zhì)粒pVAX1亦用BamHI和EcoRI雙酶切,電泳回收大片段,與酶切后的目的基因重組,轉(zhuǎn)化JM109,篩選出的重組質(zhì)粒分別用EcoRI和BstXI單酶切鑒定并送上海博亞生物工程公司進(jìn)行序列測定。具體的實(shí)驗(yàn)方法參見分子克隆實(shí)驗(yàn)指南和相關(guān)的產(chǎn)品說明書。

    1.5 質(zhì)粒的提取及鑒定

    按試劑盒說明書大規(guī)模提取pVAX1和pVAX1-30E質(zhì)粒,測A260值推算質(zhì)粒濃度,A260/A280評(píng)價(jià)質(zhì)粒純度。

    1.6 H22肝癌小鼠動(dòng)物模型的建立及體內(nèi)抑瘤實(shí)驗(yàn)

    將凍存的小鼠H22肝癌細(xì)胞置于37℃水浴,快速融化后取0.2mL注入一只小鼠的腹腔。10d后,待小鼠腹腔長滿腹水后,將其處死取腹水,用生理鹽水調(diào)整細(xì)胞濃度為3×107個(gè)/mL。每只Ba lB/c小鼠右前肢腋窩皮下注射0.15mL上述濃度的腹水,制造肝癌動(dòng)物模型。7d后將成瘤小鼠隨機(jī)分為3組:生理鹽水組、空質(zhì)粒組、pVAX1-30E組。pVAX1-30E組每次向瘤內(nèi)注射pVAX1-30E質(zhì)粒20μg,每周2次,共注射4次。空質(zhì)粒組注射等量的pVAX1質(zhì)粒。生理鹽水組注射等體積生理鹽水。末次注射后4d,處死動(dòng)物稱鼠重,瘤重,測腫瘤長短徑,計(jì)算體積V=0.52×長×寬2,用SPSS13.0進(jìn)行多個(gè)樣本均數(shù)比較的單因素方差分析。

    1.7 腫瘤局部內(nèi)皮抑素30肽濃度的檢測

    對(duì)照組、pVAX1組及pVAX1-30E組各取等量新鮮腫瘤組織,加入PBS緩沖液研磨,超聲破碎,5 000g離心取上清液,用EL ISA法檢測內(nèi)皮抑素30肽濃度,純化的重組內(nèi)皮抑素30肽為陽性對(duì)照,成骨生長肽為陰性對(duì)照。具體操作見試劑盒說明書。

    1.8 蘇-伊染色及免疫組化研究

    將上述處死小鼠的腫瘤切成組織塊,經(jīng)甲醛固定,石蠟包埋,組織病理學(xué)切片后HE染色,顯微鏡下觀察分析。

    免疫組化采用SP法,具體按照說明書操作。微血管密度(MVD)采用CD34為一抗,排除腫瘤出血及邊緣反應(yīng)區(qū),低倍鏡下(×10)觀察確定血管密度最高的區(qū)域,然后高倍鏡(×40)計(jì)數(shù)10個(gè)視野中腫瘤內(nèi)微血管數(shù),以平均每高培鏡(×40)視野血管數(shù)表示MVD[4]。增殖細(xì)胞核抗原(PCNA)染色方法同前。PCNA以細(xì)胞核內(nèi)出現(xiàn)棕黃色顆粒為陽性細(xì)胞。高倍鏡下計(jì)數(shù)10個(gè)視野,以陽性細(xì)胞占總細(xì)胞數(shù)的百分率表示PCNA指數(shù)。

    2 實(shí)驗(yàn)結(jié)果

    2.1 真核表達(dá)載體構(gòu)建

    PCR產(chǎn)物在瓊脂糖電泳中只有一條DNA條帶,堿基數(shù)與設(shè)計(jì)的相同,結(jié)果見圖1。重組質(zhì)粒在重組過程中丟失了BstXI酶識(shí)別序列,只能被EcoRI酶切,不被BstXI酶切,酶切樣品電泳結(jié)果見圖2。DNA序列測定結(jié)果與設(shè)計(jì)完全吻合。

    2.2 質(zhì)粒濃度和純度測定

    提取的質(zhì)粒用紫外分光光度計(jì)測A260和A280,pVAX1的A260為1.820,A280為1.006,A260/A280為1.809。pVAX1-E30質(zhì)粒的A260為1.836,A280為0.964,A260/A280為1.9。

    2.3 小鼠肝癌動(dòng)物模型體內(nèi)抑瘤試驗(yàn)

    小鼠肝癌動(dòng)物模型瘤體內(nèi)直接注射pVAX1-30E,抑瘤效果見表1。

    pVAX1-30E組的抑瘤率=(1-1.3123/1.8275)×100%=28.19%

    1.分子量標(biāo)準(zhǔn)2,3.PCR產(chǎn)物圖1 E30肽基因PCR產(chǎn)物電泳結(jié)果1.pVAX1-E30;2.pVAX1-E30//EcoR I;3.pVAX1-E30/BstX IFig.1 The PCR produsts of E-30 peptide

    1.pVAX1-E30質(zhì)粒;2.pVAX1-E30質(zhì)粒/EcoR I;3.pVAX1-E30質(zhì)粒/BstX I圖2 pVAX1-E30質(zhì)粒酶切鑒定1.marker;2,3.PCR productFig.2 Identification of the recombinantplasmids pVAX1-E30

    2.4 pVAX1-30E介導(dǎo)的內(nèi)皮抑素30肽在腫瘤組織局部的表達(dá)

    表1 pVAX1-30E對(duì)小鼠H22腹水型轉(zhuǎn)移型肝癌實(shí)體瘤大小的影響Tab.1 Effect of pVAX1-E30 on mouse transplanted hepatocellular carcinoma

    在pVAX1-30E組腫瘤局部組織中,內(nèi)皮抑素30肽特異表達(dá),抗體作1 000倍稀釋時(shí)A值為0.724。陽性對(duì)照組為0.948,陰性對(duì)照組為0.436,pVAX1組為0.408。pVAX1-30E組內(nèi)皮抑素30肽表達(dá)量明顯高于pVAX1組。EL ISA結(jié)果見圖3。

    圖3 EL ISA法檢測內(nèi)皮抑素30肽在腫瘤中的表達(dá)Fig.3 Expression of E-30 peptide in the tumor tissue

    2.5 蘇-伊染色及免疫組化研究

    HE染色可見,pVAX1組腫瘤細(xì)胞生長良好,壞死區(qū)少見,血管豐富,形態(tài)正常無塌陷。pVAX1-30E組可見腫瘤組織壞死灶,血管少見,管壁塌陷、閉塞,見圖4。

    CD34免疫組化顯示,pVAX1對(duì)照組有大量的呈棕黃色的微血管,部分血管無明顯管腔,呈條索狀,而pVAX1-30E組的棕黃色著色減少,提示微血管新生受到抑制,見圖5A。腫瘤增殖抗原Ki-67值經(jīng)方差分析,pVAX1組pVAX1-30E組比較差異顯著(p<0.05),結(jié)果見圖5B(圖4,5見彩插3)。

    3 討論

    內(nèi)皮抑素通過抑制腫瘤組織的血管新生,斷絕腫瘤細(xì)胞的血液供應(yīng),間接地限制腫瘤細(xì)胞的生長。用內(nèi)皮抑素治療腫瘤,可以使腫瘤細(xì)胞退回到原初狀態(tài)潛伏下來,但停止用藥后腫瘤細(xì)胞又迅速生長。所以用內(nèi)皮抑素治療腫瘤必須堅(jiān)持大劑量、長期用藥。為解決內(nèi)皮抑素必須長期用藥的困擾,有人構(gòu)建內(nèi)皮抑素真核表達(dá)載體,轉(zhuǎn)入荷瘤小鼠,觀察到治療組腫瘤體積小于生理鹽水對(duì)照組和空載體對(duì)照組。腫瘤組織HE染色顯示治療組腫瘤細(xì)胞有壞死,而生理鹽水組和空載體組腫瘤細(xì)胞生長旺盛,證明重組內(nèi)皮抑素基因瘤內(nèi)注射對(duì)腫瘤的生長具有一定的抑制作用。

    本課題組曾將內(nèi)皮抑素24-30位的氨基酸殘基改為RGDRGD序列,將這種改構(gòu)的內(nèi)皮抑素30肽基因與質(zhì)粒pTYB2重組,轉(zhuǎn)化大腸桿菌BL21(DE3)。在細(xì)胞實(shí)驗(yàn)中,重組30肽對(duì)內(nèi)皮細(xì)胞的半數(shù)抑制量只有內(nèi)皮抑素的1/4,對(duì)腫瘤細(xì)胞的半數(shù)抑制量只有內(nèi)皮抑素的1/5。在對(duì)肝癌模型小鼠的治療實(shí)驗(yàn)中,重組30肽的抑瘤率幾乎是內(nèi)皮抑素的1倍。重組30肽不僅增強(qiáng)了內(nèi)皮抑素的抗血管生成活性,而且能直接抑制腫瘤細(xì)胞的生長和轉(zhuǎn)移。相信將內(nèi)皮抑素30肽基因注入腫瘤組織會(huì)產(chǎn)生比內(nèi)皮抑素更有效的治療作用。

    本課題選擇美國FDA批準(zhǔn)可在人體內(nèi)使用的質(zhì)粒pVAX1為載體,與改構(gòu)的內(nèi)皮抑素30肽基因重組,30肽基因的5′端加入膠原蛋白ⅩⅧ信號(hào)肽編碼序列。重組質(zhì)粒直接注入腫瘤組織后,在腫瘤組織中檢測到內(nèi)皮抑素30肽,證實(shí)注射到腫瘤組織中的重組質(zhì)粒能夠進(jìn)入腫瘤細(xì)胞,在腫瘤細(xì)胞中表達(dá)的內(nèi)皮抑素30肽可以借助信號(hào)肽分泌到腫瘤組織中。20μg重組質(zhì)粒腫瘤組織內(nèi)注射,每周2次,共注射4次。末次注射后4d處死動(dòng)物檢測抑瘤率,重組30肽的抑瘤率為28.19%。HE染色治療組腫瘤組織出現(xiàn)明顯的壞死,空質(zhì)粒組腫瘤細(xì)胞生長良好。治療組腫瘤組織微血管數(shù)明顯減少,增殖細(xì)胞核抗原減少?;蛑委煯a(chǎn)生確切的治療效果。

    雖然本研究證實(shí)pVAX1-30E可以轉(zhuǎn)染小鼠的腫瘤細(xì)胞并在其中得到表達(dá),產(chǎn)生一定的抗腫瘤作用,但研究中所采用的注射劑量是否最佳,這種治療作用能夠維持多長時(shí)間,如何進(jìn)一步提高質(zhì)粒轉(zhuǎn)染及表達(dá)效率,會(huì)否產(chǎn)生毒、副作用等問題,還需經(jīng)過進(jìn)一步的研究才能得出結(jié)論。

    [1]O′Reilly MS,Boehm T,Shing Y,et al.Endostatin:An endogenous inhibitor of angiogenesis and tumor growth[J].Cell,1997,88:277-285.

    [2]Boem T,F(xiàn)olkman J,Browder T,et al.Antiangiogenic therapy of experimental cancer does not induce acquired drug resistance[J].Nature,1997,390:404-407.

    [3]任明華,王淑靜,林雪松,等.重組人內(nèi)皮抑素的結(jié)構(gòu)改造及抗腫瘤活性變化[J].中國生物化學(xué)與分子生物學(xué)報(bào),2005,21:45-52.

    [4]Tjinthamsjin RM,Satchi-fainaro R,Birsner AE,et al.A 27-amino-acid synthetic peptide corresponding to the NH2-terminal zinc-binding domain of endostatin is responsible for its antitumor activity[J].Cancer Res,2005,65:3656-3663.

    [5]李丹,劉興漢,趙煒明,等.人內(nèi)皮抑素腫瘤相關(guān)肽基因的克隆表達(dá)及活性研究[J].醫(yī)學(xué)分子生物學(xué)雜志,2007,4:475-479.

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