西南地區(qū)主栽雜交稻對(duì)‘宜香優(yōu)2115’致病性稻瘟菌的抗性

摘要

由Magnaporthe oryzae引起的稻瘟病是威脅西南乃至全國水稻生產(chǎn)最重要的病害之一，選育和利用抗性品種是控制稻瘟病最經(jīng)濟(jì)有效且對(duì)環(huán)境友好的措施，但抗性品種因病菌群體毒性發(fā)生變化而喪失抗性，已成為抗性品種選育和利用中的瓶頸問題。為篩選西南地區(qū)當(dāng)前大面積推廣品種‘宜香優(yōu)2115’感染稻瘟病后的接班品種，本研究于2022年-2023年利用其致病菌在病圃對(duì)24個(gè)抗病基因供體和西南地區(qū)100個(gè)雜交稻品種進(jìn)行了抗性篩選。結(jié)果表明在兩年間24個(gè)抗瘟單基因系均不能穩(wěn)定表現(xiàn)抗性，57個(gè)雜交稻品種和含有Pigm基因的‘谷梅4號(hào)’穩(wěn)定表現(xiàn)抗病。對(duì)42個(gè)抗性表現(xiàn)不一的雜交稻所含抗性基因進(jìn)行了檢測，結(jié)果表明，抗性基因的數(shù)目越多，品種抗性程度和穩(wěn)定性越好，含有Pigm或Pi9的基因組合的雜交稻能夠穩(wěn)定抗病，含有Pikh/Pita/Pib的‘華浙優(yōu)261’‘國泰香優(yōu)2號(hào)’和‘成優(yōu)4001’也穩(wěn)定表現(xiàn)抗病。

關(guān)鍵詞

水稻; 西南地區(qū); 抗稻瘟病基因; 分子標(biāo)記

中圖分類號(hào)：

S 435.111.41

文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼： A

DOI： 10.16688/j.zwbh.2024514

Resistance of major hybrid rice cultivars in Southwest China to the rice blast pathogen isolated from‘Yixiangyou 2115’

CAO Yue1，2， WU Hanlin1， HUANG Yanyan3， ZHANG Mei4， PENG Yunliang1，5，JI Hongli1， LEI Shufan2*， CAO Buwei1*

（1. Key Laboratory of Integrated Management of Pests on Crops in Southwest China， Ministry of Agriculture and

Rural Affairs， Institute of Plant Protection， Sichuan Academy of Agricultural Sciences， Chengdu 610066， China;

2. Chongqing Three Gorges College， Chongqing Three Gorges Academy of Agricultural Sciences， Chongqing 404020，

China; 3. State Key Laboratory of Crop Gene Exploration and Utilization in Southwest China， Sichuan Agricultural

University， Chengdu 611130， China; 4. Plant Protection Station， Sichuan Provincial Department of Agriculture and

Rural Affairs， Chengdu 610041， China; 5. China National Rice Research Institute， Hangzhou 311401， China）

Abstract

Rice blast， caused by Magnaporthe oryzae， is one of the most destructive diseases threatening rice production in both Southwest China and the entire country. Breeding and deploying resistant cultivars are the most costeffective and environmentally friendly strategies for controlling rice blast. However， the loss of resistance due to evolving virulence in pathogen populations has become a major bottleneck in resistance breeding and utilization. To identify suitable replacement cultivars for ‘Yixiangyou 2115’， which has recently become susceptible to blast disease in the field， 100 hybrid rice cultivars from Southwest China， the resistant variety ‘Gumei 4’ carrying Pigm and 24 IRBLs containing single blast resistance genes were evaluated in disease nurseries during 2022-2023 using a pathogen strain isolated from ‘Yixiangyou 2115’. The results showed that 57 hybrid rice cultivars and ‘Gumei 4’ consistently exhibited resistance over two years， whereas none of the 24 IRBLs showed stable resistance. PCR analysis of 42 cultivars with varying resistance levels revealed that cultivars with multiple resistance genes generally demonstrated stronger and more stable resistance. Hybrids carrying gene combinations such as Pigm or Pi9 maintained consistent resistance， while cultivars carrying Pikh/Pita/Pib combination， such as ‘Huazheyou 261’ ‘Guotaixiangyou 2’ and ‘Chengyou 4001’， also exhibited stable resistance.

Key words

rice; Southwest China; rice blast resistance gene; molecular marker

水稻是我國和世界最重要的糧食作物，全球有近一半人口食用水稻。由Magnaporthe oryzae引起的稻瘟病在世界范圍內(nèi)廣泛發(fā)生，一般流行程度造成年產(chǎn)量損失10%～30%，嚴(yán)重時(shí)甚至?xí)?dǎo)致絕收。據(jù)統(tǒng)計(jì)，稻瘟病每年在南亞和東南亞造成的經(jīng)濟(jì)損失高達(dá)6 000萬美元［12］。2012年-2021年，我國每年受稻瘟病危害的水稻面積約為381.5萬hm2，每年水稻產(chǎn)量損失約為36.8萬t［3］。選育和利用抗性品種，是控制稻瘟病最經(jīng)濟(jì)、有效和對(duì)環(huán)境友好的手段。但由于病菌毒性變異頻繁，新毒性類型在群體中出現(xiàn)和頻率上升導(dǎo)致新品種大面積推廣3～5年后在田間喪失抗性，已成為稻瘟病防控中的瓶頸問題。在四川，自雜交稻推廣以來分別在1984年-1985年、1993年-1994年、2003年-2005年出現(xiàn)3次稻瘟病流行高峰，高峰期最大發(fā)生面積分別超過72.9萬、49.2萬hm2和35.5萬hm2，年損失糧食5萬t以上［45］。在2006年以后，盡管稻瘟病菌毒性仍然在發(fā)生變化［56］，四川省卻再未發(fā)生新的大流行，‘宜香優(yōu)2115’‘川優(yōu)6023’等主栽品種使用壽命均在10年以上。作為西南地區(qū)當(dāng)年推廣面積最大的雜交稻品種，‘宜香優(yōu)2115’在推廣之初曾在貴州興義市嚴(yán)重感病，2021年又在四川省崇州市開始出現(xiàn)連片發(fā)病，為了解該品種發(fā)病后西南地區(qū)水稻主栽品種的抗性表現(xiàn)，本研究利用對(duì)‘宜香優(yōu)2115’具有效病性的稻瘟病菌，在病圃內(nèi)對(duì)西南地區(qū)市售水稻品種進(jìn)行了抗性篩選，并對(duì)代表性品種所含的抗性基因進(jìn)行了檢測和分析，以期為病害流行預(yù)測和新抗性品種選育提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 供試材料

24份稻瘟病抗性單基因系水稻材料及感病品種‘麗江新團(tuán)黑谷’（‘LTH’）由廣東省農(nóng)業(yè)科學(xué)院朱小源研究員提供，在四川省農(nóng)業(yè)科學(xué)院植物保護(hù)研究所保存并繁殖;100份雜交水稻主栽品種均為市售樣品，于2022年春季收集自四川省成都、南充、綿陽以及貴州省興義等地種子市場并于4℃冷庫保存，‘谷梅4號(hào)’由四川省農(nóng)業(yè)科學(xué)院植物保護(hù)研究所選育并保存繁殖。‘成優(yōu)4001’和‘川優(yōu)6203’F2代種子為2023年采集自病圃中表現(xiàn)為抗病的1個(gè)單株分穗保存。

1.2 病圃設(shè)置與田間管理

稻瘟病圃設(shè)立于稻瘟病常發(fā)區(qū)的四川省邛崍市老林口（103°08′E，30°13′N），海拔635 m，平均年降水量約1 400 mm，年平均相對(duì)濕度86.8%。每年4月上旬整地，整地前每667 m2施15 kg復(fù)合肥（NP2O5K2O 151515）、5 kg尿素做底肥，翻耕后起1.5 m寬秧廂，廂間留0.5 m寬廂溝。播種前將秧廂縱分為兩幅，中間間隔10 cm。將各品種直接或催芽后播種50～100粒于事先劃好的直線上，行長50 cm，間距25 cm，距秧廂邊緣20 cm。試驗(yàn)設(shè)置3個(gè)重復(fù)。秧廂兩端以及每隔10份參試材料播一行誘發(fā)行，誘發(fā)行為‘宜香優(yōu)2115’和‘LTH’按9∶1比例混合種子。播種后將種子抹壓入泥漿，架拱覆蓋薄膜，薄膜中央每2 m劃20 cm長透氣孔以防高溫?zé)?，出苗前秧廂保持廂面濕潤但無積水，出苗3～4 d后撤去薄膜灌淺水，二葉一心期每667 m2撒施5 kg尿素，并將溫室內(nèi)發(fā)病秧苗移栽至誘發(fā)行內(nèi)。溫室誘發(fā)苗播種同誘發(fā)行，播種期較田間早30 d，2022年接種菌源為2021年貴州興義市、四川崇州市‘宜香優(yōu)2115’自然發(fā)病田采集的穗頸瘟標(biāo)本各200根，為保證病圃病菌群體致病性的連續(xù)性，還混入了2021年邛崍病圃隨機(jī)采集的穗頸瘟標(biāo)本400根，2023年接種菌源為2022年邛崍病圃中隨機(jī)收集的穗頸瘟標(biāo)本400根。穗頸瘟標(biāo)本干燥保存后在溫室秧苗三葉期按吳晗霖等［6］的方法進(jìn)行產(chǎn)孢、接種于溫室內(nèi)誘發(fā)苗，待誘發(fā)苗均勻發(fā)病后將帶病斑的病苗移栽至田間誘發(fā)行內(nèi)，各誘發(fā)行移栽2～3株苗。病圃第2、3次追肥分別在分蘗盛期和劍葉抽出后進(jìn)行，每667 m2施7.5 kg尿素。按常規(guī)管理進(jìn)行除草和蟲害防治，整個(gè)生育期不施用任何殺菌劑。

1.3 病害調(diào)查

參照中華人民共和國農(nóng)業(yè)行業(yè)標(biāo)準(zhǔn)NY/T 26462014《水稻品種試驗(yàn)稻瘟病抗性鑒定與評(píng)價(jià)技術(shù)規(guī)程》［7］中0～9級(jí)水稻葉瘟調(diào)查分級(jí)和穗頸瘟鑒定標(biāo)準(zhǔn)，于分蘗末期對(duì)田間試驗(yàn)材料進(jìn)行葉瘟抗性鑒定：抗性類型0級(jí)為高抗（HR）、1～2級(jí)為抗（R）、3級(jí)為中抗（MR）、4～5級(jí)為中感（MS）、6～7級(jí)為感（S）、8～9級(jí)為高感（HS）;黃熟初期調(diào)查穗瘟發(fā)病情況，穗頸瘟病穗率≤10%為抗性（R）。

1.4 水稻抗稻瘟病基因分子檢測

將2022年-2023年24個(gè)連續(xù)表現(xiàn)抗病、6個(gè)連續(xù)表現(xiàn)感病及12個(gè)抗性表現(xiàn)不穩(wěn)定的品種的葉片樣品磨碎后采用CTAB法提取DNA［8］，并將濃度調(diào)整為約100 ng/μL，保存于-20℃。利用抗瘟基因Pita、Pi9、Pi2、Pizt、Pigm、Pib、Pik、Pikm、Pikp、Pikps、Pikh和Pil的特異性引物（表1）進(jìn)行PCR擴(kuò)增。PCR反應(yīng)體系為：2×Rapid Taq Master Mix（南京諾唯贊生物科技股份有限公司）10 μL，水稻基因組DNA 2 μL，正、反向引物（10 μmol/L）各1 μL，6 μL ddH2O。PCR反應(yīng)程序：95℃預(yù)變性5 min;95℃變性15 s，退火溫度見表1，72℃延伸15～30 s（由擴(kuò)增產(chǎn)物的長度決定），30個(gè)循環(huán);72℃ 延伸10 min。所有擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳檢測，并測序比對(duì)序列。引物合成、序列測定均由北京擎科生物科技股份有限公司完成?！让?號(hào)’為Pigm陽性對(duì)照，其他抗瘟基因陽性對(duì)照為相應(yīng)的IRBL單基因系，陰性對(duì)照為‘LTH’。

1.5 雜交稻F2代單株抗性評(píng)價(jià)和抗性基因檢測

2024年春，將雜交稻‘成優(yōu)4001’和‘川優(yōu)6203’單株采集的F1代種子按單穗在邛崍病圃進(jìn)行播種，每個(gè)品種分別播種3穗，對(duì)照為‘宜香優(yōu)2115’。出苗后于三葉一心期參考吳晗霖等［6］的方法接種上年病圃隨機(jī)采集的穗頸瘟標(biāo)本，并在2個(gè)雜交組合的F2群體中隨機(jī)挑選30株編號(hào);待‘宜香優(yōu)2115’單株發(fā)病率達(dá)到100%后，調(diào)查各群體編號(hào)的30株F2的葉瘟級(jí)別，采集葉片檢測其F2代所含的抗性基因。病圃管理、病害調(diào)查和基因檢測方法同上。

2 結(jié)果與分析

2.1 水稻抗瘟單基因系在病圃中的葉瘟級(jí)別

2022年和2023年24個(gè)單基因系、‘谷梅4號(hào)’及感病對(duì)照‘LTH’在邛崍病圃中的葉瘟級(jí)別如表2所示。2022、2023年試驗(yàn)中分別有36、35行誘發(fā)行，其中‘LTH’在葉瘟調(diào)查時(shí)均已死苗，兩年間各誘發(fā)行中‘宜香優(yōu)2115’的葉瘟級(jí)別均在7和9之間，表明田間發(fā)病充分。2年中‘LTH’葉瘟級(jí)別均為9級(jí)，24個(gè)抗瘟單基因系中除含Pi9的‘IRBL9W’在2022年葉瘟為5級(jí)、2023年為0級(jí)外，其余23個(gè)抗瘟單基因系連續(xù)兩年葉瘟最高級(jí)別均在4級(jí)以上，表現(xiàn)感病，‘谷梅4號(hào)’連續(xù)兩年葉瘟均為0級(jí)，表現(xiàn)抗病。

2.2 水稻主栽品種抗瘟性表現(xiàn)

將西南地區(qū)各地種子市場收集的100個(gè)生產(chǎn)品種，于2022年-2023年在邛崍病圃進(jìn)行種植并調(diào)查其最高葉瘟級(jí)別和平均穗頸瘟率（表3），發(fā)現(xiàn)‘川優(yōu)6023’等57個(gè)品種連續(xù)2年最高葉瘟級(jí)別均在3級(jí)以下，平均穗頸瘟率均≤10.0%而穩(wěn)定表現(xiàn)抗病，占參試品種的57%;‘宜香優(yōu)2115’等12個(gè)品種連續(xù)2年或最高葉瘟在4級(jí)以上或平均穗頸瘟率超過10%而穩(wěn)定表現(xiàn)感病，占參試品種12%;‘內(nèi)香8156’等31個(gè)品種在2年間抗性表現(xiàn)不穩(wěn)定，占參試品種的31%。

2.3 水稻主栽品種抗稻瘟病基因檢測

將2022年-2023年間24個(gè)連續(xù)表現(xiàn)抗病、6個(gè)連續(xù)表現(xiàn)感病及12個(gè)抗性表現(xiàn)不穩(wěn)定的品種采集劍葉進(jìn)行抗瘟基因檢測，各品種中均未檢出Pikp和Pik基因，其余Pi2、Pik、Pita和Pib 4個(gè)位點(diǎn)10個(gè)等位基因的檢測結(jié)果見表4。在所有參試品種中，除感病對(duì)照品種‘LTH’外，均至少檢測出1個(gè)已知抗性基因，Pita和Pib在供試品種中的分布頻率分別高達(dá)76.19%和69.05%，而Pi2、Pizt、Pigm、Pikm、Pikps、Pi1、Pikh和Pi9的檢出頻率依次為23.81%、16.67%、11.90%、9.52%、9.52%、9.52%、7.14%和4.76%。

在42個(gè)品種中，含有Pigm基因的5個(gè)品種（‘千鄉(xiāng)優(yōu)604’‘龍香優(yōu)123’‘千鄉(xiāng)優(yōu)956’‘川優(yōu)542’和‘中9優(yōu)591’）、含Pi9的基因組合（Pi9/Pita/Pib和Pi9/Pi1）的2個(gè)品種（‘宜香107’和‘揚(yáng)優(yōu)香占’）和含有Pikh/Pita/Pib的3個(gè)品種（‘華浙優(yōu)261’‘國泰香優(yōu)2號(hào)’和‘成優(yōu)4001’）于2022年-2023年葉瘟和穗頸瘟連續(xù)表現(xiàn)抗病;僅含有Pib的3個(gè)品種（‘宜香4245’‘宜香2084’和‘渝香813A/R4553’）以及感病對(duì)照‘LTH’均連續(xù)表現(xiàn)感病。其余在一個(gè)以上品種中重復(fù)出現(xiàn)的抗瘟基因組合，包括Pikm/Pita/Pib（‘川優(yōu)6203’和‘宜香優(yōu)45’）、

Pi2/Pita/Pib（‘徽兩優(yōu)280’‘晶兩優(yōu)1212’‘晶兩優(yōu)絲苗’‘品香優(yōu)五山絲苗’‘宜香優(yōu)4118’‘華航新選10’和‘花香7號(hào)’）、Pita/Pib（‘宜香2239’‘又香優(yōu)龍絲苗’‘雅7優(yōu)2117’‘宜香707’‘廣8優(yōu)165’‘更香優(yōu)703’和‘昌兩優(yōu)絲苗’）、Pikps（‘旌優(yōu)348’和‘桃湘優(yōu)莉晶’）、Pita（‘兩優(yōu)2186’‘清兩優(yōu)183’和‘悅香優(yōu)銀占’）的抗性表現(xiàn)則不一致。在僅出現(xiàn)一個(gè)代表品種的抗瘟基因組合中，2年間穩(wěn)定表現(xiàn)抗病的有Pi2/Pikps/Pib（‘旌1優(yōu)華珍’）、Pikps/Pita/Pib（‘泰優(yōu)2608’）和Pi2/Pita（‘深兩優(yōu)332’）;2年間穩(wěn)定表現(xiàn)感病的有Pizt/Pikm（‘川作優(yōu)8178’）、Pizt/Pib（‘文富7號(hào)’）和Pi2/Pib（‘宜優(yōu)1787’），2年間抗性不穩(wěn)定的抗瘟基因組合有Pi1/Pita（‘內(nèi)香8156’）、Pikm/Pita（‘品香優(yōu)9205’）。

從參試的42個(gè)西南地區(qū)水稻品種中可以看出，隨著所攜帶的抗性基因數(shù)量增加，穩(wěn)定表現(xiàn)抗性的品種比例也有所上升（表5）。檢測出1個(gè)抗病基因的水稻品種有8個(gè)，其中穩(wěn)定表現(xiàn)抗病的品種僅占25.00%，攜帶2、3、4個(gè)抗病基因的品種分別有14、16個(gè)和4個(gè)，在2年間穩(wěn)定表現(xiàn)抗病的比例分別為50.00%、68.75%和100%。

2.4 雜交組合F2代單株抗性表現(xiàn)和抗性基因檢測

將雜交稻‘成優(yōu)4001’和‘川優(yōu)6203’進(jìn)行收種，收獲的雜交稻F1代種子于2024年播種在邛崍病圃，各雜交組合均隨機(jī)選擇30個(gè)F2單株進(jìn)行了葉瘟鑒定和抗性基因檢測，發(fā)現(xiàn)在‘成優(yōu)4001’（F1）的3個(gè)單穗的30個(gè)F2單株中，有4株攜帶與F1相同的基因（Pita/Pib/Pikh），其田間葉瘟抗性表現(xiàn)全部為抗，與F1代田間抗性表現(xiàn)一致（表6），但不同時(shí)含有Pita/Pib/Pikh 3個(gè)基因的F2單株也有部分表現(xiàn)抗病。在來自‘川優(yōu)6203’（F1）的3個(gè)單穗的30個(gè)F2單株中，有16株攜帶與F1相同的基因（Pikm/Pita/Pib），田間葉瘟抗性表現(xiàn)全部為高抗或者抗，也與其F1代田間葉瘟抗性表現(xiàn)一致（表7），但不同時(shí)含有Pikm/Pita/Pib 3個(gè)基因的F2單株也有部分表現(xiàn)抗病。

3 結(jié)論與討論

選育和利用抗性品種，是控制稻瘟病最經(jīng)濟(jì)、有效且對(duì)環(huán)境友好的手段。但由于稻瘟病菌群體結(jié)構(gòu)組成復(fù)雜且易變，在新的抗病品種投入使用后，病菌群體中產(chǎn)生對(duì)其具有致病能力的新毒性類型；在品種選擇壓力下，這類新毒性類型的頻率會(huì)逐漸上升并超過臨界閾值，往往導(dǎo)致抗性品種在大面積推廣3～5年后即喪失抗性［14］，這已成為抗稻瘟病品種利用中的瓶頸問題?！讼銉?yōu)2115’自2013年起在四川等西南地區(qū)大面積推廣，是目前西南地區(qū)種植面積最大的雜交稻品種。該品種在貴州省興義市、四川省崇州市分別出現(xiàn)了連續(xù)10年和3年多田塊連片發(fā)病的現(xiàn)象。本研究在四川邛崍病圃中加入興義、崇州市‘宜香優(yōu)2115’發(fā)病田的病穗頸作為菌源，從100個(gè)西南地區(qū)水稻主栽品種中篩選出57個(gè)對(duì)葉瘟、穗頸瘟連續(xù)2年均表現(xiàn)抗性的雜交稻品種，并且在24個(gè)抗性穩(wěn)定品種中共檢出12種抗性基因組合。這說明即使‘宜香優(yōu)2115’ 在西南地區(qū)大面積喪失抗性，但接班品種較多且基因型多樣，稻瘟病持續(xù)大面積流行的風(fēng)險(xiǎn)較小。

另一方面，本研究參試的24個(gè)單基因系在邛崍病圃均不能穩(wěn)定表現(xiàn)抗病，已知廣譜抗稻瘟病基因僅Pigm（供體為‘谷梅4號(hào)’）連續(xù)穩(wěn)定表現(xiàn)抗病，而筆者已在福建、浙江等地病圃和大田獲得能使‘谷梅4號(hào)’表現(xiàn)感病的稻瘟病菌株（未發(fā)表資料），可見抗稻瘟病育種開始面臨無新廣譜抗病基因可用的局面?？剐曰蚓酆媳徽J(rèn)為是培育持久抗病品種的有效途徑之一［1519］。在本研究中，盡管還有其他未檢測的抗瘟基因可能發(fā)揮作用，但含有Pikh/Pita/Pib的‘華浙優(yōu)261’‘國泰香優(yōu)2號(hào)’‘成優(yōu)4001’以及‘成優(yōu)4001’的4個(gè)F２單株均表現(xiàn)抗病，表明即使單個(gè)基因喪失抗性，特定的基因聚合在抗稻瘟病育種中仍有利用價(jià)值。而本研究中攜帶另外一個(gè)多基因聚合組合“Pikm/Pita/Pib”的雜交稻品種抗性不穩(wěn)定，除了可能因表現(xiàn)穩(wěn)定抗性的品種中含有其他未檢測抗瘟基因起作用外，也可能與‘川優(yōu)6203’連續(xù)大面積推廣造成的選擇壓力有關(guān)。通過研究雜交稻F1、F2代以及單基因系復(fù)合雜交后不同抗性基因聚合組合的抗性穩(wěn)定性，將有助于推進(jìn)抗稻瘟病基因聚合育種。

目前尚無Pigm在四川及西南地區(qū)喪失抗性的報(bào)道，本研究中凡帶有Pigm的雜交稻組合均穩(wěn)定表現(xiàn)抗病，如果在育種過程中將Pigm與其他穩(wěn)定抗病的基因或基因組合加以聚合培育更廣譜抗病的品種，同時(shí)配合大面積種植抗性品種、田園清潔、種子處理等壓低乃至鏟除稻瘟病菌菌源的措施，將有利于西南地區(qū)稻瘟病的持續(xù)控制。

參考文獻(xiàn)

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