L-香芹酮對(duì)灰葡萄孢的熏蒸抑菌活性及抑菌機(jī)制初探

摘要

為明確L香芹酮的熏蒸抑菌活性和其作用機(jī)制，本研究利用菌絲生長(zhǎng)速率法測(cè)定了L香芹酮對(duì)灰葡萄孢、核盤菌、齊整小核菌、禾谷鐮孢、膠孢炭疽菌5種植物病原菌的熏蒸抑制作用，采用孢子萌發(fā)法進(jìn)一步探究了L香芹酮對(duì)灰葡萄孢的作用，通過(guò)掃描電鏡和透射電鏡觀察熏蒸處理后灰葡萄孢菌絲微觀形態(tài)和亞細(xì)胞結(jié)構(gòu)的變化，利用PI染色觀察細(xì)胞膜的損傷情況，并測(cè)定L香芹酮對(duì)灰葡萄孢麥角甾醇合成、細(xì)胞膜胞外電導(dǎo)率、蛋白質(zhì)和核酸含量的影響，開(kāi)展了L香芹酮對(duì)草莓灰霉病的離體防效試驗(yàn)。結(jié)果顯示，L香芹酮對(duì)5種植物病原菌菌絲生長(zhǎng)有明顯的抑制作用，熏蒸72 h EC50在529～1869 μL/L之間。對(duì)灰葡萄孢孢子萌發(fā)的EC50為1178 μL/L;經(jīng)L香芹酮熏蒸處理后灰葡萄孢菌絲干癟，扭曲，細(xì)胞器結(jié)構(gòu)紊亂;PI染色結(jié)果表明，L香芹酮熏蒸處理嚴(yán)重影響灰葡萄孢細(xì)胞膜的完整性，EC50和EC90劑量處理組麥角甾醇含量分別降低273%和432%，胞內(nèi)物質(zhì)外泄，菌絲液的相對(duì)電導(dǎo)率上升，蛋白質(zhì)和核酸類物質(zhì)外滲程度高于對(duì)照。EC90劑量熏蒸處理對(duì)草莓灰霉病治療和保護(hù)防控效果分別為8543%和9031%。綜上，L香芹酮可通過(guò)破壞灰葡萄孢細(xì)胞膜的完整性和通透性來(lái)發(fā)揮抑菌功效，對(duì)草莓灰霉病有較好的防治效果，該結(jié)果為新型植物源熏蒸殺菌劑的開(kāi)發(fā)提供了新思路。

關(guān)鍵詞

L-香芹酮; 熏蒸抑菌活性; 灰葡萄孢; 抑菌機(jī)制

中圖分類號(hào)：

S 4822

文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼： A

DOI： 10.16688/j.zwbh.2024363

Preliminary investigation of the fumigation antifungal activity and mechanisms of Lcarvone against Botrytis cinerea

ZHI Yanan， YOU Weichen， LI Yun， LI Yujie， WANG Chunsheng， CHEN Lijun*

（Xinyang Agriculture and Forestry University， Xinyang Key Laboratory of Functional Volatiles Resources for Plant Protection， Xinyang 464000， China）

Abstract

To elucidate the fumigation antifungal activity and underlying mechanism of Lcarvone， its inhibitory effects on five plant pathogenic fungi （Botrytis cinerea， Sclerotinia sclerotiorum， Sclerotium rolfsii， Fusarium graminearum and Colletotrichum gloeosporioides） were investigated using the mycelial growth rate method. The impact on B.cinerea spore germination was assessed via spore germination assays. Morphological and ultrastructural changes in B.cinerea hyphae following Lcarvone fumigation were observed by scanning electron microscopy （SEM） and transmission electron microscopy （TEM）， while cell membrane integrity was evaluated using propidium iodide （PI） staining. Moreover， the effects of Lcarvone on ergosterol synthesis， extracellular conductivity， and leakage of proteins and nucleic acids were also examined. In vitro assays were also conducted to assess its efficacy in controlling strawberry gray mold. The results showed that Lcarvone had significant inhibitory effects on all five plant pathogens， with EC50 values ranging from 529 to 1869 μL/L 72 h after fumigation. The EC50 for B.cinerea spore germination was 1178 μL/L. B.cinerea hyphae appeared shriveled and distorted， with disorganized organelles after fumigation. PI staining confirmed significant damage to the cell membrane. Ergosterol content was reduced by 273% and 432% after treated with EC50 and EC90of Lcarvone， respectively. Cytoplasmic leakage resulted in increased relative conductivity， as well as elevated protein and nucleic acid content in the mycelial exudate. EC90 treatment of Lcarvone achieved 8543% therapeutic and 9031% protective control efficacy against strawberry gray mold. In conclusion， Lcarvone inhibits B.cinerea primarily by disrupting cell membrane integrity and permeability， offering a promising strategy for developing plantderived fumigant fungicides.

Key words

Lcarvone; fumigation antifungal activity; Botrytis cinerea; mechanism of action

生產(chǎn)上植物病害的防治仍以化學(xué)防治為主，但長(zhǎng)期過(guò)量使用農(nóng)藥會(huì)引起農(nóng)藥殘留、加重病原菌抗藥性的問(wèn)題，與農(nóng)業(yè)綠色發(fā)展不相符［12］。因此，開(kāi)發(fā)安全、環(huán)境友好的生物源殺菌劑是生產(chǎn)上的研究熱點(diǎn)之一。

大量研究表明，一些植物的揮發(fā)性物質(zhì)（volatile organic compounds，VOCs）對(duì)有害生物具有良好的活性，且易擴(kuò)散，使其可以通過(guò)熏蒸的方式防控病害［35］。因這些揮發(fā)性物質(zhì)來(lái)源于植物，易降解、與環(huán)境相容性好，符合農(nóng)業(yè)綠色發(fā)展理念。L香芹酮是薄荷Mentha canadensis、留蘭香Mentha spicata等傳統(tǒng)香料植物的主要成分，在留蘭香中的相對(duì)含量達(dá)57468%［67］。L香芹酮作為食品級(jí)添加劑被廣泛添加在口香糖、牙膏和飲料中［8］。潘旭遲等［9］發(fā)現(xiàn)L香芹酮對(duì)食源性細(xì)菌大腸桿菌Escherichia coli、腸炎沙門氏菌Salmonella enterica、金黃色葡萄球菌Staphylococcus aureus和李斯特菌Listeria monocytogenes有抑制作用。在醫(yī)藥上，香芹酮也顯示出抑菌、抗癌、消炎、抗糖尿病和許多其他藥理作用，目前已作為治療性藥物進(jìn)行研發(fā)［1012］。在農(nóng)業(yè)方面，有研究發(fā)現(xiàn)L香芹酮對(duì)柑橘木虱Diaphorina citri有良好的引誘效果［13］;能顯著降低桃實(shí)蠅Bactrocera zonata成蟲(chóng)蛹化率和羽化率，并導(dǎo)致幼蟲(chóng)卵巢發(fā)育延遲［14］;對(duì)赤擬谷盜Tribolium castaneum和玉米象Sitophilus zeamais也表現(xiàn)出較強(qiáng)的觸殺毒性和熏蒸毒性［15］。Deweer等［16］發(fā)現(xiàn)，L香芹酮對(duì)致病疫霉Phytophthora infestans有抑制作用。Razavi等［17］發(fā)現(xiàn)L香芹酮和L香芹酮PLGA復(fù)合物對(duì)煙曲霉Aspergillus fumigatus、黃曲霉Aspergillus flavus、禾谷鐮孢Fusarium graminearum和黃單胞菌Xanthomonas campestris等病原菌有抑制作用，而且能夠抑制反枝莧Amaranthus retroflexus、馬齒莧Portulaca oleracea和紫花苜蓿Medicago sativa種子的萌發(fā)及幼苗的生長(zhǎng)。

本實(shí)驗(yàn)室在前期試驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)，富含L香芹酮的留蘭香揮發(fā)油對(duì)灰葡萄孢Botrytis cinerea、禾谷鐮孢等多種植物病原真菌具有良好熏蒸活性［6］。但L香芹酮對(duì)這些病原菌的作用機(jī)制研究較少，本試驗(yàn)擬探究L香芹酮對(duì)5種病原菌的熏蒸抑制作用，并在此基礎(chǔ)上以灰葡萄孢菌為供試菌，進(jìn)一步探討L香芹酮的抑菌機(jī)制及對(duì)草莓灰霉病的防治作用，為新型熏蒸抑菌劑開(kāi)發(fā)及其機(jī)制研究提供參考。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

植物病原菌：核盤菌Sclerotinia sclerotiorum、灰葡萄孢Botrytis cinerea、齊整小核菌Sclerotium rolfsii、禾谷鐮孢Fusarium graminearum、膠孢炭疽菌Colletotrichum gloeosporioides，由信陽(yáng)農(nóng)林學(xué)院農(nóng)學(xué)院植物病理實(shí)驗(yàn)室分離保存。

試劑：L香芹酮（CAS號(hào)：6485401，純度≥99%）、碘化丙啶（PI）染液，購(gòu)自上海阿拉丁生化科技股份有限公司。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 L香芹酮熏蒸處理對(duì)植物病原真菌菌絲生長(zhǎng)的影響

采用菌絲生長(zhǎng)速率法測(cè)定L香芹酮對(duì)植物病原真菌的熏蒸抑制作用［6］。在培養(yǎng)48 h的病原菌菌落邊緣打取菌餅，接種至PDA平板（d=12 cm）中央。在培養(yǎng)皿蓋中央放置一片滅菌的濾紙片，將L香芹酮滴加在濾紙片上。根據(jù)預(yù)試驗(yàn)，不同病原菌設(shè)置不同熏蒸濃度，灰葡萄孢中L香芹酮滴加量為05、1、15、2、3 μL（相當(dāng)于每皿L香芹酮濃度分別為233、465、698、930、1395 μL/L）;核盤菌中滴加量為1、15、2、3、4 μL（相當(dāng)于每皿L香芹酮濃度分別為465、698、930、1395、1860 μL/L）;齊整小核菌和禾谷鐮孢中滴加量為15、2、3、4、6 μL（相當(dāng)于每皿L香芹酮濃度分別為698、930、1395、1860、2791 μL/L）;膠孢炭疽菌中滴加量為2、3、4、6、8 μL （相當(dāng)于每皿L香芹酮濃度分別為930、1395、1860、2791、3731 μL/L），以不滴加L香芹酮為對(duì)照。皿底皿蓋對(duì)扣，封口膜密封后倒置培養(yǎng)72 h，采用十字交叉法測(cè)量菌落直徑，計(jì)算熏蒸抑制率。每個(gè)處理重復(fù)3次。

菌絲生長(zhǎng)抑制率=（對(duì)照組菌落直徑-處理組菌落直徑）/（對(duì)照組菌落直徑-菌餅直徑）×100%。

1.2.2 L香芹酮熏蒸處理對(duì)灰葡萄孢孢子萌發(fā)的影響

采用崔凱娣等［18］的方法稍作調(diào)整。將灰葡萄孢菌餅接種于PDA平板培養(yǎng)，產(chǎn)孢后，加入無(wú)菌水沖洗、過(guò)濾，調(diào)整孢子懸浮液的濃度至106個(gè)/mL。吸取50 μL孢子懸浮液滴到凹玻片上，凹玻片置于9 cm的培養(yǎng)皿中，在培養(yǎng)皿的皿蓋上固定一濾紙片，分別滴加05、1、15、2、3 μL的L香芹酮（相當(dāng)于每皿L香芹酮濃度分別為556、1111、1667、2222、3333 μL/L），密封后黑暗培養(yǎng)，以不滴加L香芹酮為對(duì)照，每處理設(shè)置3次重復(fù)。孢子芽管長(zhǎng)度超過(guò)孢子短半徑視為萌發(fā)，當(dāng)對(duì)照組視野中的孢子萌發(fā)率超過(guò)90%時(shí)開(kāi)始統(tǒng)計(jì)結(jié)果。

孢子萌發(fā)抑制率=（對(duì)照孢子萌發(fā)率-處理孢子萌發(fā)率）/對(duì)照孢子萌發(fā)率×100%。

1.2.3 L香芹酮熏蒸處理對(duì)灰葡萄孢菌絲形態(tài)及超微結(jié)構(gòu)的影響

灰葡萄孢在PDA平板上培養(yǎng)24 h后，在培養(yǎng)皿皿蓋的濾紙片上按EC50和EC90劑量滴加L香芹酮，以不滴加L香芹酮為對(duì)照，每處理3次重復(fù)。熏蒸24 h，挑取菌絲，觀察其形態(tài)。參照康振生［19］的方法進(jìn)行掃描電鏡和透射電鏡制樣，觀察菌絲形態(tài)和細(xì)胞結(jié)構(gòu)的變化。

1.2.4 L香芹酮熏蒸處理對(duì)灰葡萄孢細(xì)胞膜完整性的影響

測(cè)定方法參照Han等［20］的方法并做修改。在PDA平板上鋪一層滅菌的玻璃紙，玻璃紙中央接種灰葡萄孢菌餅。倒置培養(yǎng)48 h后在培養(yǎng)皿蓋的濾紙片上分別滴加EC50和EC90劑量的L香芹酮，以不滴加L香芹酮為對(duì)照，每處理3次重復(fù)。繼續(xù)培養(yǎng)24 h，用小藥匙刮取玻璃紙上的灰葡萄孢菌絲，置于離心管中，PBS洗滌3次，并將菌絲體重懸于95 μL的PBS中，加入5 μL的碘化丙啶（PI）染液，在30℃暗環(huán)境下孵育。20 min后，用PBS漂洗菌絲，將漂洗過(guò)后的樣品制成玻片，置于熒光顯微鏡下觀察。

1.2.5 L香芹酮熏蒸處理對(duì)灰葡萄孢麥角甾醇含量影響

參考Tian等［21］的方法測(cè)定L香芹酮對(duì)灰葡萄孢麥角甾醇含量的影響。按照124的方法獲得EC50和EC90處理的菌絲，用無(wú)菌水洗滌2次后，稱重。將菌絲與5 mL濃度為25%（KOH質(zhì)量體積分?jǐn)?shù)）的KOH乙醇混合液混合，在85℃條件下皂化4 h。完成皂化后，冷卻至室溫，加入正庚烷渦旋15 min，室溫靜置1 h待其分層，每處理3次重復(fù)。取上層溶液，測(cè)定其在波長(zhǎng)282 nm和230 nm處的吸光度。根據(jù)公式計(jì)算麥角甾醇的含量。

麥角甾醇含量=［OD282/（290×菌絲重量）-OD230/（518×菌絲重量）］×100%。

1.2.6 L香芹酮熏蒸處理對(duì)灰葡萄孢菌絲電導(dǎo)率的影響

L香芹酮熏蒸處理后灰葡萄孢菌絲相對(duì)電導(dǎo)率的測(cè)定參考陳利軍等［22］的方法。稱取灰葡萄孢菌絲，轉(zhuǎn)移到裝有無(wú)菌水的組培瓶中，在瓶蓋上放入數(shù)個(gè)滅菌的濾紙片，濾紙上滴加L香芹酮，使對(duì)菌絲生長(zhǎng)的抑制濃度分別達(dá)到EC50和EC90，對(duì)照組不滴加L香芹酮，每處理設(shè)置3次重復(fù)。25℃、150 r/min遮光振蕩培養(yǎng)，分別在培養(yǎng)0、12、24、36、48、72 h時(shí)，取4 mL熏蒸處理后的處理液，10 000 r/min離心10 min，取上清液測(cè)其電導(dǎo)率，最后將菌絲液煮沸后冷卻至室溫，再次測(cè)定電導(dǎo)率，根據(jù)測(cè)定結(jié)果計(jì)算相對(duì)電導(dǎo)率。

相對(duì)電導(dǎo)率=（L-L0）/（L1-L0）×100%，

其中L為各時(shí)間點(diǎn)電導(dǎo)率;L0為0時(shí)的電導(dǎo)率;L1為菌絲液煮沸后的電導(dǎo)率。

1.2.7 L香芹酮熏蒸處理對(duì)灰葡萄孢菌絲蛋白質(zhì)和核酸類物質(zhì)外滲的影響

獲取菌絲培養(yǎng)液的方法同126。在熏蒸培養(yǎng)0、12、24、36、48、72 h時(shí)分別吸取4 mL菌液，10 000 r/min離心10 min，每處理3次重復(fù)。采用紫外可見(jiàn)分光光度計(jì)分別測(cè)定260 nm和280 nm處上清液的吸光度，以表征核酸類和蛋白質(zhì)類物質(zhì)的外滲情況［23］。

1.2.8 L香芹酮熏蒸處理對(duì)草莓灰霉病的治療和保護(hù)作用

選擇大小一致的草莓果實(shí)消毒后備用。治療作用：用5 mm打孔器在果實(shí)表皮打孔，在孔內(nèi)接種灰葡萄孢菌餅，菌面朝外，將草莓置于滅菌的密封盒中。25℃培養(yǎng)24 h后，盒蓋濾紙片上滴加EC50和EC90劑量的L香芹酮，以不滴加L香芹酮為對(duì)照，每處理3次重復(fù)，密封后繼續(xù)培養(yǎng)，72 h后計(jì)算防治效果。保護(hù)作用測(cè)定：先將健康的草莓置于滴加L香芹酮的密封盒中熏蒸處理24 h，再接種菌餅，其他條件同治療作用試驗(yàn)。

防治效果=（對(duì)照病斑直徑-處理病斑直徑）/對(duì)照病斑生長(zhǎng)直徑×100%。

1.3 數(shù)據(jù)處理

通過(guò)SPSS 220進(jìn)行數(shù)據(jù)處理，用Duncan’s新復(fù)極差法分析處理間的差異顯著性，使用Excel 2010制圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 L香芹酮熏蒸處理對(duì)5種植物病原真菌菌絲生長(zhǎng)的影響

通過(guò)對(duì)菌絲熏蒸處理發(fā)現(xiàn)，L香芹酮對(duì)供試病原真菌均具有不同程度的熏蒸抑制作用。毒力分析顯示，L香芹酮對(duì)5種植物病原真菌的EC50均低于19 μL/L，對(duì)灰葡萄孢菌菌絲生長(zhǎng)的EC50和EC90均為最低，分別為529 μL/L和2879 μL/L。對(duì)膠孢炭疽菌的抑制作用最弱，EC50和EC90分別為1869 μL/L和5828 μL/L（表1）。

2.2 L香芹酮熏蒸處理對(duì)灰葡萄孢孢子萌發(fā)的影響

經(jīng)不同濃度的L香芹酮熏蒸處理后，灰葡萄孢菌孢子萌發(fā)率顯著低于對(duì)照（圖1）。當(dāng)培養(yǎng)皿內(nèi)的L香芹酮濃度達(dá)到3333 μL/L時(shí)，對(duì)灰葡萄孢的孢子萌發(fā)抑制率達(dá)到了9879%。熏蒸處理后芽管長(zhǎng)度的伸長(zhǎng)也受到了一定的影響。毒力測(cè)定結(jié)果顯示，L香芹酮對(duì)灰葡萄孢孢子萌發(fā)抑制中濃度EC50為1178 μL/L，EC90為2421 μL/L（表2）?？梢?jiàn)，

L香芹酮熏蒸不僅能夠影響病原菌菌絲生長(zhǎng)，還能顯著抑制其孢子萌發(fā)及芽管伸長(zhǎng)。

2.3 L香芹酮熏蒸處理對(duì)灰葡萄孢菌絲形態(tài)及超微結(jié)構(gòu)的影響

光學(xué)顯微鏡觀察L香芹酮熏蒸處理對(duì)灰葡萄孢菌絲的影響（圖2），對(duì)照菌落正常生長(zhǎng)，菌絲形態(tài)飽滿，纖細(xì)直長(zhǎng)，表面光滑。經(jīng)L香芹酮EC50劑量熏蒸處理后的菌落生長(zhǎng)緩慢，菌絲頂端有原生質(zhì)泄露現(xiàn)象發(fā)生;EC90劑量處理后的菌落生長(zhǎng)幾乎完全被抑制，菌絲嚴(yán)重畸形，分枝增多，內(nèi)部原生質(zhì)分布不均勻，周圍密布泄漏的原生質(zhì)，菌絲細(xì)胞膜受損嚴(yán)重。

掃描電鏡觀察如圖3所示，對(duì)照菌絲粗細(xì)均勻，形態(tài)飽滿，表面光滑;L香芹酮EC50劑量處理后菌絲表面皺縮，有明顯的凹陷，局部不規(guī)則膨脹;EC90劑量處理后菌絲干癟扭曲，相互纏繞打結(jié)，局部失水畸形現(xiàn)象更加嚴(yán)重。

透射電鏡觀察如圖4所示，對(duì)照組的菌絲細(xì)胞結(jié)構(gòu)清晰，細(xì)胞器結(jié)構(gòu)完整，線粒體分布均勻，能夠明顯觀察到細(xì)胞核、核仁等，胞外無(wú)外滲物。L香芹

酮EC50劑量處理后局部結(jié)構(gòu)模糊，厚薄不均勻，細(xì)胞膜結(jié)構(gòu)模糊，有質(zhì)壁分離現(xiàn)象發(fā)生。線粒體體積增

大腫脹，細(xì)胞內(nèi)成分聚集固縮成不明團(tuán)塊;EC90劑量處理后細(xì)胞內(nèi)部的破壞程度更為嚴(yán)重，各細(xì)胞器結(jié)構(gòu)紊亂，細(xì)胞內(nèi)胞漿聚集，有較大的空腔形成，線粒體數(shù)量增多，細(xì)胞膜通透性遭到破壞。L香芹酮處理?yè)p傷了灰葡萄孢細(xì)胞器，對(duì)菌絲超微結(jié)構(gòu)產(chǎn)生了顯著影響。

2.4 L香芹酮熏蒸處理對(duì)灰葡萄孢細(xì)胞膜完整性的影響

PI染液能夠進(jìn)入已死亡細(xì)胞的細(xì)胞膜，與細(xì)胞中的細(xì)胞核結(jié)合，在熒光顯微鏡下可觀察到紅色熒光。本試驗(yàn)結(jié)果顯示（圖5）：經(jīng)過(guò)PI染色后，對(duì)照組在熒光顯微鏡下幾乎觀察不到紅色熒光，細(xì)胞膜未受到破壞，菌絲無(wú)損傷。EC50劑量處理組菌絲出現(xiàn)零星的紅色熒光，部分熒光較為黯淡;EC90處理組多數(shù)菌絲出現(xiàn)明亮的紅色熒光。表明，L香芹酮能夠破壞細(xì)胞膜的完整性，導(dǎo)致PI染液的滲入，隨著處理濃度的增加，細(xì)胞膜受損傷程度也逐漸增加，當(dāng)EC90劑量處理時(shí)細(xì)胞膜幾乎被完全破壞。

2.5 L香芹酮熏蒸處理對(duì)灰葡萄孢細(xì)胞膜麥角甾醇合成的影響

麥角甾醇是真菌細(xì)胞膜的重要組分，對(duì)維持細(xì)胞正常生命活動(dòng)意義重大。由圖6可知，經(jīng)L香芹酮熏蒸后，與對(duì)照組相比，EC50和EC90處理組麥角甾醇含量顯著下降（P＜005）。對(duì)照組麥角甾醇含量為044%，EC50和EC90處理組麥角甾醇含量分別下降273%和432%。由此可以推測(cè)，L香芹酮熏蒸處理后，影響了灰葡萄孢菌麥角甾醇的合成，起到抑菌作用。

2.6 L香芹酮熏蒸處理對(duì)灰葡萄孢菌絲胞外電導(dǎo)率的影響

在測(cè)定的時(shí)間內(nèi)，對(duì)照組相對(duì)電導(dǎo)率值保持在較低水平。L香芹酮處理后灰葡萄孢菌絲胞外相對(duì)電導(dǎo)率隨時(shí)間的推移而升高。處理組相對(duì)電導(dǎo)率均高于對(duì)照組，且處理濃度越大，相對(duì)電導(dǎo)率值越高，熏蒸72 h時(shí)，EC50劑量和EC90劑量處理組胞外相對(duì)電導(dǎo)率分別為5331%和8619%，分別為對(duì)照組的29倍和48倍（圖7）?？梢?jiàn)L香芹酮處理破壞了菌體細(xì)胞膜，細(xì)胞膜通透性增強(qiáng)，細(xì)胞內(nèi)含物外漏，起到了抑菌作用。

2.7 L香芹酮熏蒸處理對(duì)灰葡萄孢菌絲蛋白質(zhì)和核酸類物質(zhì)外滲的測(cè)定

蛋白質(zhì)、核酸等大分子物質(zhì)從細(xì)胞外滲是判斷細(xì)胞膜損傷的重要指標(biāo)。對(duì)照組蛋白質(zhì)與核酸含量變化小，但是經(jīng)過(guò)L香芹酮熏蒸處理后外滲情況明顯加重。并且隨著處理時(shí)間的延長(zhǎng)，蛋白質(zhì)和核酸向外滲透更為明顯，L香芹酮處理灰葡萄孢72 h后，EC50和EC90劑量使蛋白質(zhì)泄露量分別是對(duì)照組的22倍和40倍（圖8a）;核酸泄露量分別是對(duì)照組的39倍和72倍（圖8b）。

2.8 L香芹酮熏蒸處理對(duì)草莓灰霉病的治療和保護(hù)作用

試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)L香芹酮對(duì)番茄灰霉病具有一定的防效。在治療作用試驗(yàn)中，對(duì)照組草莓病斑幾乎擴(kuò)展至整個(gè)果實(shí)，腐爛嚴(yán)重;EC50劑量處理的草莓病斑較大，有果實(shí)變軟的現(xiàn)象出現(xiàn)，防效僅為2976%;EC90劑量處理的草莓，病斑擴(kuò)展不明顯，且果實(shí)仍然保持新鮮狀態(tài)，表現(xiàn)出良好的防效，為8543%（圖9a1～a3）。

在保護(hù)作用中，EC50劑量處理的草莓病斑直徑30 cm左右，被侵染的部位呈現(xiàn)褐色;EC90劑量處理的草莓，病斑直徑為06～07 cm，病斑僅在果實(shí)打孔處生長(zhǎng)不再向外擴(kuò)展，防效達(dá)到9031%，且草莓保持試驗(yàn)開(kāi)始時(shí)稍青的顏色，在成熟度上變化不大（圖9b1～b3）。

3 結(jié)論與討論

香芹酮一種單萜烯類化合物，具有不對(duì)稱碳結(jié)構(gòu)，以L香芹酮和D香芹酮兩種形式存在于植物揮發(fā)性物質(zhì)中，這2種物質(zhì)具有相同的物理性質(zhì)，但在活性上存在差異。研究者發(fā)現(xiàn)，與D香芹酮相比L香芹酮對(duì)指狀青霉Penicillium digitatum、可可毛色二孢Lasiodiplodia theobromae的最小抑菌濃度更低，對(duì)鱷梨采后病原真菌抑制效果更優(yōu)［2425］。而D香芹酮作為抑芽劑研究較多，如葛霞等［26］發(fā)現(xiàn)D香芹酮可通過(guò)調(diào)節(jié)馬鈴薯內(nèi)源激素水平調(diào)控馬鈴薯塊莖萌芽。一些歐洲國(guó)家已將香芹酮作為商業(yè)化的馬鈴薯抑芽劑（TalentTM）使用［27］。

本試驗(yàn)通過(guò)菌絲生長(zhǎng)速率法發(fā)現(xiàn)L香芹酮對(duì)5種常見(jiàn)植物病原菌的菌絲生長(zhǎng)均有良好的抑制作用，EC50在529～1869 μL/L之間，EC90在2879～5828 μL/L之間。在此基礎(chǔ)上選擇受抑制作用最明顯的灰葡萄孢進(jìn)一步試驗(yàn)，發(fā)現(xiàn)L香芹酮對(duì)灰葡萄孢的孢子萌發(fā)同樣具有熏蒸抑制作用。采用掃描電鏡和透射電鏡觀察L香芹酮對(duì)灰葡萄孢菌絲結(jié)構(gòu)的影響，發(fā)現(xiàn)處理后的菌絲干癟、畸形;細(xì)胞內(nèi)細(xì)胞器結(jié)構(gòu)紊亂，空腔增多。這表明熏蒸處理引起灰葡萄孢菌絲細(xì)胞膜破壞，菌絲不能維持正常的生理結(jié)構(gòu)。

大量文獻(xiàn)表明，植物揮發(fā)性物質(zhì)的主要抑菌作用部位之一為細(xì)胞膜，揮發(fā)物處理后病原真菌細(xì)胞膜上麥角甾醇的合成受到影響，甚至導(dǎo)致細(xì)胞死亡［21， 28］。PI染液能夠進(jìn)入死亡細(xì)胞，與細(xì)胞中的細(xì)胞核結(jié)合，通過(guò)熒光顯微鏡可以觀察到L香芹酮對(duì)細(xì)胞膜的影響。本試驗(yàn)中，從對(duì)灰葡萄孢的麥角甾醇含量測(cè)定和PI染色結(jié)果看，L香芹酮影響了麥角甾醇的合成，破壞了細(xì)胞膜完整性，處理組出現(xiàn)紅色熒光，且熒光強(qiáng)弱與濃度正相關(guān)。當(dāng)菌體細(xì)胞膜受損時(shí)，胞內(nèi)的電解質(zhì)外漏到細(xì)胞外的培養(yǎng)液中，導(dǎo)致胞外電導(dǎo)率增大，影響菌體的生長(zhǎng)。細(xì)胞膜受到損傷時(shí)還會(huì)導(dǎo)致細(xì)胞大分子內(nèi)含物如核酸和蛋白質(zhì)等外泄。本試驗(yàn)中，電導(dǎo)率測(cè)定、蛋白質(zhì)和核酸類物質(zhì)外滲測(cè)定結(jié)果均顯示，L香芹酮熏蒸處理對(duì)灰葡萄細(xì)胞膜造成了一定的損傷，影響了菌體正常的生命活動(dòng)，損傷程度與處理濃度有關(guān)。Zhou等［29］發(fā)現(xiàn)植物揮發(fā)物香芹酚和丁香酚能夠增強(qiáng)桃軟腐病菌Rhizopus stolonifer細(xì)胞膜的滲透性，并導(dǎo)致核酸和蛋白質(zhì)的泄漏，使用掃描電子顯微鏡和熒光顯微鏡觀察顯示：菌絲形態(tài)發(fā)生改變、細(xì)胞質(zhì)膜破裂。這些研究結(jié)果說(shuō)明，L香芹酮等揮發(fā)性物質(zhì)作用于細(xì)胞膜，通過(guò)改變細(xì)胞膜通透性來(lái)發(fā)揮抑菌作用。

植物揮發(fā)性物質(zhì)對(duì)病菌抑制作用靶點(diǎn)較多，抑菌機(jī)制復(fù)雜，Li等［30］通過(guò)轉(zhuǎn)錄組分析揮發(fā)物橙花醇對(duì)甘薯黑斑病菌Ceratocystis fimbriata的作用時(shí)發(fā)現(xiàn)，橙花醇通過(guò)降低線粒體膜電位，致使參與ATP產(chǎn)生的基因下調(diào)，并誘導(dǎo)細(xì)胞內(nèi)活性氧的積累，同時(shí)引起核染色質(zhì)凝聚和DNA的裂解而發(fā)揮抑菌作用。L香芹酮基于細(xì)胞水平和分子水平的抑菌機(jī)制有待通過(guò)轉(zhuǎn)錄組學(xué)、蛋白質(zhì)組學(xué)和代謝組學(xué)進(jìn)行分析，通過(guò)明確作用靶點(diǎn)以及在分子水平上病原菌受到調(diào)節(jié)的代謝途徑，為實(shí)際應(yīng)用提供科學(xué)依據(jù)。

本試驗(yàn)在觀察L香芹酮對(duì)病原真菌細(xì)胞膜通透性和菌絲結(jié)構(gòu)影響的同時(shí)，還進(jìn)行了L香芹酮對(duì)草莓灰霉病的短期儲(chǔ)藏防效試驗(yàn)，發(fā)現(xiàn)使用EC90劑量處理后，病斑基本不擴(kuò)展。而如何在施用后減少或掩蓋使用后的揮發(fā)性物質(zhì)的氣味，降低揮發(fā)物氣味對(duì)果實(shí)品質(zhì)和自身風(fēng)味的影響，使消費(fèi)者更易接受，是后期試驗(yàn)中需要考慮的問(wèn)題。

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（責(zé)任編輯：楊明麗）