生物炭負(fù)載貝萊斯芽孢桿菌對(duì)熱帶油茶促生及抗病效果研究

摘" 要：油茶（Camellia oleifera）是中國(guó)重要的木本油料作物，但由于栽培管理不當(dāng)，土壤肥力下降，病害頻發(fā)，其中炭疽病是影響油茶產(chǎn)量的主要病害之一。為探索綠色可持續(xù)的防治策略，本研究利用生物炭作為載體，負(fù)載貝萊斯芽孢桿菌（Bacillus velezensis SK1-5-2），評(píng)估其對(duì)油茶生長(zhǎng)促進(jìn)作用及對(duì)炭疽病的抑制效果。通過(guò)盆栽試驗(yàn)驗(yàn)證，生物炭負(fù)載貝萊斯芽孢桿菌（SK1-5-2-GFP）在促進(jìn)油茶生長(zhǎng)、改善土壤理化性質(zhì)及提高抗病性方面表現(xiàn)出顯著協(xié)同效應(yīng)。與對(duì)照（CK）相比，生物炭負(fù)載SK1-5-2（BB）的植株高度、葉面積、地徑、葉綠素含量及鮮質(zhì)量均顯著提高，其中BB的地徑增幅明顯高于單獨(dú)接種菌液處理組（BV）。菌株定殖試驗(yàn)結(jié)果顯示，SK1-5-2-GFP能夠在生物炭多孔結(jié)構(gòu)內(nèi)穩(wěn)定附著，并在油茶根際細(xì)胞間隙實(shí)現(xiàn)高效定殖，且其存活率及功能性未受GFP標(biāo)記影響。在土壤理化性質(zhì)方面，BB的全氮、速效磷和有機(jī)質(zhì)含量較CK分別提高55.2%、334.0%和181.0%；生物炭單獨(dú)處理組（BC）速效鉀含量較CK增加63.1%。在土壤酶活性方面，BB組的過(guò)氧化氫酶、蔗糖酶、脲酶及酸性磷酸酶活性分別較CK增加28.0%、44.4%、57.9%和338.6%，均達(dá)到顯著水平。根際微生物群落分析表明，BB處理顯著提升有益菌的相對(duì)豐度，Bacillus屬和Priestia屬成為優(yōu)勢(shì)菌群，同時(shí)真菌群落中藍(lán)狀菌屬（Talaromyces）豐度升高，致病性鐮刀菌屬（Fusarium）豐度則明顯降低。在病害防控方面，BB油茶炭疽病的發(fā)病率降至55.6%，顯著優(yōu)于BV（60.1%）和BC（77.8%）。綜上所述，生物炭負(fù)載貝萊斯芽孢桿菌通過(guò)優(yōu)化根際微環(huán)境、調(diào)控微生物群落結(jié)構(gòu)及抑制病原菌，實(shí)現(xiàn)了促進(jìn)油茶生長(zhǎng)與病害防控的雙重效益。本研究為油茶可持續(xù)種植提供新的微生物調(diào)控策略，也為農(nóng)業(yè)微生物應(yīng)用與土壤改良技術(shù)的發(fā)展提供科學(xué)依據(jù)。

關(guān)鍵詞：生物炭；貝萊斯芽孢桿菌；油茶；生長(zhǎng)促進(jìn)；炭疽??；生物防控中圖分類(lèi)號(hào)：S794.4；S476 """""文獻(xiàn)標(biāo)志碼：A

Growth-promoting and Disease-resistant Effects of Biochar-loaded Bacillus velezensis on Camellia oleifera

ZHANG Jiangfan^1，3， WU Wenqiang^1，3， HUANG Dongyi^2，3， LAI Hanggui^2，3， HU Haiyan^2，3， DING Yuanhao^2，3， LIU Jinping^2，3， WANG Jian^2，3， HUANG Xiaolong^1，3*

1. School of Life and Health Sciences， Hainan University， Haikou， Hainan 570228， China; 2. School of Southern Tropical Agriculture， Hainan University， Sanya， Hainan 572025， China; 3. Tropical Oil-tea Engineering Research Center of Hainan Province， Haikou， Hainan 570228， China

Abstract： Camellia oleifera， a vital woody oil crop in China， has been increasingly threatened by declining soil fertility and frequent disease outbreaks due to improper cultivation practices. Among these， anthracnose is one of the primary diseases limiting yield. To explore environmentally friendly and sustainable control strategies， this study employed biochar as a carrier to deliver Bacillus velezensis SK1-5-2， aiming to evaluate its plant growth-promoting potential and its efficacy in suppressing anthracnose. Pot experiments demonstrated that biochar-loaded SK1-5-2-GFP significantly enhanced C. oleifera growth， improved soil physicochemical properties， and increased disease resistance， indicating a strong synergistic effect. Compared to CK， the biochar-loaded bacterial treatment （BB） significantly improved plant height， leaf area， basal stem diameter， chlorophyll content， and fresh weight. Notably， stem diameter in the BB group increased more substantially than that in the group treated with bacterial suspension alone （BV）. Colonization assays revealed that strain SK1-5-2-GFP stably adhered within the porous structure of biochar and efficiently colonized the intercellular spaces in the rhizosphere of C. oleifera， with its viability and functionality unaffected by GFP labeling. Soil properties， total nitrogen， available phosphorus， and organic matter contents in the BB group increased by 55.2%， 334.0%， and 181.0%， respectively， compared to CK. Additionally， available potassium in the biochar-only group （BC） increased by 63.1%. Regarding soil enzyme activities， the BB group exhibited significant increases in catalase （28.0%）， sucrase （44.4%）， urease （57.9%）， and acid phosphatase （338.6%） activities compared to CK. Rhizosphere microbial community analysis showed that BB treatment significantly elevated the relative abundance of beneficial microbes， with Bacillus and Priestia emerging as dominant genera. Among fungal communities， the abundance of Talaromyces increased， whereas the pathogenic Fusarium genus obviously declined. The anthracnose incidence in the BB group dropped to 55.6%， markedly lower than that in the BV （60.1%） and BC （77.8%） groups. In conclusion， biochar-loaded B. velezensis enhanced plant growth and disease resistance in C. oleifera by optimizing the rhizosphere microenvironment， modulating microbial community composition， and suppressing phytopathogens. This study would provide a novel microbial regulation strategy for the sustainable cultivation of C. oleifera， offering valuable insights for future applications of agricultural microorganisms and soil improvement technologies.

Keywords： biochar; Bacillus velezensis; Camellia oleifera; growth promotion; anthracnose; biological control

DOI： 10.3969/j.issn.1000-2561.2025.08.018

油茶（Camellia oleifera）原產(chǎn)于中國(guó)，屬于山茶科（Theaceae）山茶屬（Camellia）的常綠小喬木，是世界四大木本油料樹(shù)種之一^[1]。目前廣泛栽培于我國(guó)湖南、江西、廣西、湖北、重慶、福建、貴州、海南等15個(gè)南方?。▍^(qū)、市）^[2]。油茶籽榨取的茶油富含大量不飽和脂肪酸，同時(shí)含有豐富的生育酚、角鯊烯、植物甾醇、黃酮、多酚等生物活性物質(zhì)，是一種多功能的優(yōu)質(zhì)食用油^[3]。

油茶多在土壤貧瘠的丘陵山區(qū)造林，撫育過(guò)程中常因缺乏科學(xué)管理而大量施用化肥和農(nóng)藥，導(dǎo)致土壤肥力下降，病蟲(chóng)害頻發(fā)。其中，油茶炭疽病是當(dāng)前影響油茶生長(zhǎng)的最嚴(yán)重病害之一^[4]，在油茶主產(chǎn)區(qū)普遍發(fā)生，可引起果實(shí)大量脫落、花芽枯萎、枝梢干枯，甚至整株衰敗死亡，嚴(yán)重影響油茶產(chǎn)量^[5]。盡管化學(xué)防治在一定程度上可遏制病害發(fā)生，但長(zhǎng)期濫用化學(xué)農(nóng)藥不僅促使病原菌抗藥性增強(qiáng)，對(duì)植物產(chǎn)生毒害^[6]，還帶來(lái)顯著的環(huán)境污染和生態(tài)風(fēng)險(xiǎn)^[7-9]。因此，開(kāi)發(fā)兼具促生與抗病功能的綠色生物技術(shù)手段，對(duì)于實(shí)現(xiàn)油茶產(chǎn)業(yè)的可持續(xù)發(fā)展具有重要的現(xiàn)實(shí)意義。

貝萊斯芽孢桿菌（Bacillus velezensis）屬于芽孢桿菌屬，是一種能夠產(chǎn)生多種生物酶和次級(jí)代謝產(chǎn)物的有益菌，具有良好的促生與廣譜抗菌能力，在農(nóng)業(yè)病害生物防控中應(yīng)用廣泛^[10]。作為外源有益微生物菌劑，芽孢桿菌能夠在作物根際定殖，提升土壤養(yǎng)分利用率，改善作物根際微生態(tài)環(huán)境，并增強(qiáng)作物抗病性^[11]。然而，在新環(huán)境中，外源微生物需同時(shí)應(yīng)對(duì)微型動(dòng)物的捕食和土著微生物的資源競(jìng)爭(zhēng)，常面臨定殖率低、功能不穩(wěn)定等問(wèn)題^[12]。為提高其定殖效率和功能穩(wěn)定性，常需借助載體材料共同引入，如泥炭苔、玉米芯粉、膨潤(rùn)土、珍珠巖、蛭石、聚丙烯酰胺、生物炭及藻酸鹽微球等^[13-14]。這些載體不僅能保護(hù)微生物活性，還有助于提升其在土壤中的定殖能力與功能表達(dá)。然而，當(dāng)前有關(guān)載體與微生物之間相容性及其在載體中生存規(guī)律的研究仍較匱乏，制約了微生物功能的進(jìn)一步發(fā)揮。

生物炭是由生物質(zhì)在缺氧條件下經(jīng)熱解生成的一種富碳固態(tài)物質(zhì)，具有獨(dú)特的物理和化學(xué)性質(zhì)，在可持續(xù)農(nóng)業(yè)中展現(xiàn)出廣泛的應(yīng)用潛力^[15-16]。其可改善土壤結(jié)構(gòu)，增強(qiáng)土壤穩(wěn)定性和保水能力，降低土壤容重，為植物根系提供更適宜的生長(zhǎng)環(huán)境^[17]。此外，生物炭富含多種養(yǎng)分，具有良好的保肥能力，能夠提升土壤肥力，促進(jìn)植物對(duì)養(yǎng)分的吸收^[18-22]生物炭還可為土壤微生物提供理想的棲息環(huán)境與營(yíng)養(yǎng)來(lái)源，有助于提高微生物多樣性與群落豐度，增強(qiáng)土壤生態(tài)系統(tǒng)穩(wěn)定性^[23]。其豐富的孔隙結(jié)構(gòu)與優(yōu)良的吸附性能，使其成為理想的微生物載體材料^[24]。已有研究表明，生物炭與木霉菌聯(lián)合使用，可有效抑制病原菌生長(zhǎng)，并增強(qiáng)其定殖能力與功能發(fā)揮。DE MEDEIROS等^[25]研究表明，生物炭與木霉菌的協(xié)同策略在防控土傳病原菌方面展現(xiàn)出巨大潛力。

綜上，生物炭作為一種功能性載體，能在提升外源有益微生物定殖效率、增強(qiáng)植物抗病性和促生作用等方面提供重要支持。已有研究表明，B. velezensis對(duì)油茶具有顯著的促生作用，并能增強(qiáng)其對(duì)炭疽病的抗性，在油茶產(chǎn)業(yè)中具有良好的應(yīng)用前景^[26]。然而，關(guān)于該菌在熱帶地區(qū)油茶中的應(yīng)用研究尚屬空白。

本研究前期從海南火龍果根際分離獲得一株具廣譜抗菌活性與促生能力的貝萊斯芽孢桿菌SK1-5-2。以該菌株為基礎(chǔ)，采用椰殼生物炭作為載體，構(gòu)建適用于熱帶地區(qū)的“生物炭–貝萊斯芽孢桿菌”復(fù)合體系，系統(tǒng)評(píng)估其在提升微生物定殖效率、促進(jìn)油茶生長(zhǎng)與抗病性以及改善土壤理化性質(zhì)方面的效果。研究旨在突破熱帶地區(qū)微生物定殖的技術(shù)瓶頸，為海南地區(qū)油茶產(chǎn)業(yè)提供兼具抗病、增產(chǎn)和土壤修復(fù)功能的一體化綠色解決方案。

1" 材料與方法

1.1 "材料

供試菌株貝萊斯芽孢桿菌SK1-5-2由本實(shí)驗(yàn)室前期從火龍果根際土壤中分離獲得。供試油茶炭疽病病原菌TJ1-6（Colletotrichum siamense）則從患病油茶葉片中分離純化獲得。油茶種子來(lái)源于海南省儋州市海南大學(xué)儋州基地，品種為海大2號(hào)。綠色熒光蛋白標(biāo)記質(zhì)粒pGFP-4412購(gòu)自上海欽誠(chéng)生物科技有限公司。生物炭購(gòu)自鄭州昊森環(huán)?？萍加邢薰?，以椰殼為原料制備而成，主要理化性質(zhì)如下：有機(jī)質(zhì)含量為79.1%，灰分為3.4%，總氮為0.5%，水分為2.9%，NPK總養(yǎng)分為7.2%，重金屬含量為0.0%，比表面積為417.1"m²/g，制備溫度為580"℃，粒徑范圍為18～ 30"mm，pH 6.8。

1.2" 方法

1.2.1 "貝萊斯芽孢桿菌SK1-5-2綠色熒光蛋白標(biāo)記" 參考IDRIS等^[27]的方法，接種菌株SK1-5-2于液體LB培養(yǎng)基中，33"℃、170 r/min下振蕩過(guò)夜培養(yǎng)。取適量培養(yǎng)液于GCHE培養(yǎng)基中，調(diào)整OD₆₀₀值至約0.3；在33"℃、200 r/min下振蕩培養(yǎng)，直至OD₆₀₀值達(dá)到約1.4。隨后加入等體積的GC培養(yǎng)基，繼續(xù)培養(yǎng)約1.5 h。將培養(yǎng)液等分為2份，5000 r/min離心5 min（室溫）。取200 μL上清液重懸沉淀，加入2"mL轉(zhuǎn)化緩沖液和1 μg pGFP-4412質(zhì)粒，輕輕混勻后置于33"℃培養(yǎng)箱中孵育1 h，期間每10～15 min輕輕顛倒混勻1次。加入含亞致死濃度的卡那霉素的LB培養(yǎng)液，33"℃、170"r/min培養(yǎng)2～3"h，8000"r/min離心5"min，取400"μL上清液重懸沉淀后均勻涂布于含卡那霉素的LB平板上，次日觀察有無(wú)抗性菌落出現(xiàn)，并進(jìn)行PCR擴(kuò)增，引物為F：5?-TCGTT AGAACGCGGCTACAATTAAT-3?；R：5?-ATAA AGTAAGAAAAAATGAGTCCGT-3）。擴(kuò)增體系總體積為50 μL，其中模板DNA 1 μL，引物各2 μL，PCR Mix 25 μL，ddH₂O 20 μL；擴(kuò)增程序?yàn)?4"℃預(yù)變性5 min，94"℃變性30 s，55"℃退火30 s，72"℃延伸1 min，30個(gè)循環(huán)，72"℃最后延伸10"min。將PCR擴(kuò)增陽(yáng)性的菌液制片，采用共聚焦熒光顯微鏡觀察菌體是否有綠色熒光信號(hào)。

1.2.2" 貝萊斯芽孢桿菌SK1-5-2-GFP生物炭復(fù)合材料制備 "參考JIA等^[28]的方法，將GFP標(biāo)記的貝萊斯芽孢桿菌SK1-5-2接種于液體LB培養(yǎng)基中，于30"℃、180 r/min條件下振蕩培養(yǎng)12 h，獲得菌種預(yù)培養(yǎng)液。按1%（V/V）接種量再次接入新鮮LB培養(yǎng)基中，在相同條件下繼續(xù)培養(yǎng)48"h，培養(yǎng)結(jié)束后將菌液濃度調(diào)節(jié)至1× 10⁸ CFU/mL。隨后，按生物炭與菌懸液質(zhì)量∶體積比為1∶5進(jìn)行混合，于30"℃、170"r/min下培養(yǎng)24 h。培養(yǎng)完成后，過(guò)濾除去游離菌體，并用去離子水沖洗3次，以去除殘余浮游細(xì)胞。所得樣品置于20"℃烘箱中低溫風(fēng)干，獲得負(fù)載菌株SK1-5-2的生物炭復(fù)合體，并于4"℃下保存?zhèn)溆?。為觀察菌株在生物炭表面的附著狀態(tài)，取少量復(fù)合樣品在經(jīng)液氮預(yù)冷的異戊烷中進(jìn)行快速冷凍處理，隨后采用環(huán)境掃描電子顯微鏡（ESEM）進(jìn)行微觀結(jié)構(gòu)成像。此外，利用共聚焦激光掃描顯微鏡（CLSM）檢測(cè)SK1-5-2-GFP在生物炭表面的綠色熒光表達(dá)，以評(píng)價(jià)其附著與分布情況。

1.2.3" 盆栽試驗(yàn)" 油茶盆栽試驗(yàn)于2024年5月在海南大學(xué)海甸校區(qū)進(jìn)行。試驗(yàn)設(shè)4個(gè)處理組：對(duì)照（CK）、貝萊斯芽孢桿菌SK1-5-2-GFP處理（BV）、生物炭處理（BC）以及生物炭負(fù)載貝萊斯芽孢桿菌處理（BB），每個(gè)處理設(shè)40盆，采用隨機(jī)排列設(shè)計(jì)。試驗(yàn)用土壤經(jīng)自然風(fēng)干后過(guò)2 mm篩。根據(jù)試驗(yàn)設(shè)置，分別將BC和BB按照土壤質(zhì)量的2%（m/m）比例充分混勻后裝入營(yíng)養(yǎng)缽（110"mm×170 mm），每盆添加1.50"kg土壤。CK和BV則直接裝入相同質(zhì)量的未經(jīng)處理的土壤。油茶種子事先在沙床中催芽，待長(zhǎng)出2片真葉后，選取生長(zhǎng)一致的幼苗移栽至各處理組的營(yíng)養(yǎng)缽中，每盆定植1株。BV處理組在移栽后7 d內(nèi)進(jìn)行根際灌菌處理，使用1×10⁶ CFU/mL的SK1-5- 2-GFP菌液進(jìn)行灌根，共灌根5次，每次間隔3 d。

1.2.4" 標(biāo)記菌株在油茶側(cè)根定殖觀察" 在油茶種植15 d后，采集油茶的側(cè)根放入清水中，輕輕搖動(dòng)，去除表面泥土和其他雜質(zhì)。使用無(wú)菌吸水紙輕輕按壓樣品，吸干表面的水分，確保側(cè)根干凈無(wú)水跡。采用解剖刀片小心地將油茶的側(cè)根切成厚度均勻的薄片。將處理好的切片樣品置于載玻片上，滴加適量的封片劑，蓋好蓋玻片，置于共聚焦熒光顯微鏡上進(jìn)行顯微觀察和成像。

1.2.5 "油茶生長(zhǎng)指標(biāo)測(cè)定" 盆栽種植30 d后對(duì)油茶生長(zhǎng)指標(biāo)進(jìn)行測(cè)定。葉綠素含量測(cè)定：分別取4個(gè)處理組油茶各40株長(zhǎng)勢(shì)一致的植株，在植株中上部健康向陽(yáng)葉片，利用便攜式葉綠素含量測(cè)量?jī)xCCM-300（Opti-Sciences， USA）在同一位置測(cè)量每株植物葉片葉綠素3次，取其平均值；用自來(lái)水將地上部和根系沖洗干凈，用吸水紙將根系和地上部所有水分擦干。鮮質(zhì)量：分別取4個(gè)處理組油茶各20株油茶根部清洗干凈后，稱(chēng)取鮮質(zhì)量取平均值；株高：分別取4個(gè)處理組油茶使用軟尺測(cè)量20株油茶株高，取平均值；葉面積：4個(gè)處理組油茶，各組隨機(jī)挑選20株，選取真葉用游標(biāo)卡尺測(cè)量葉片最長(zhǎng)處和最寬處，計(jì)算葉面積。

1.2.6" 土壤理化指標(biāo)測(cè)定" 參照常規(guī)測(cè)定方法^[29-30]測(cè)定5個(gè)土壤理化性質(zhì)：有效磷、有效鉀、全氮、土壤pH、土壤有機(jī)質(zhì)。采用土壤蔗糖酶（SC）檢測(cè)試劑盒、土壤脲酶（UE）活性檢測(cè)試劑盒、土壤酸性磷酸酶（ACP）活性檢測(cè)試劑盒和土壤過(guò)氧化氫酶（CAT）活性檢測(cè)試劑盒測(cè)定不同處理油茶根際土壤4種酶活（蔗糖酶、脲酶、酸性磷酸酶、過(guò)氧化氫酶），具體方法參照試劑盒說(shuō)明書(shū)。各理化性質(zhì)與酶活值均設(shè)置3個(gè)重復(fù)。

1.2.7" 炭疽病感染" 病原菌在PDA培養(yǎng)基上培養(yǎng)復(fù)蘇，然后挑取少量菌絲放入SNA液體培養(yǎng)基^[31]于28"℃恒溫震蕩培養(yǎng)7"d后，無(wú)菌水稀釋至1.5×10⁷ CFU/mL 孢子懸浮液，上述經(jīng)處理的油茶，每個(gè)處理組隨機(jī)取20株。采用刺傷法進(jìn)行接種，用無(wú)菌注射器針頭刺穿葉片2處，滴加油茶炭疽病孢子懸浮液，只接無(wú)菌水為對(duì)照，每個(gè)處理20株，15 d后觀察并記錄植株生長(zhǎng)和發(fā)病情況。病情指數(shù)=∑（各級(jí)病株數(shù)×相應(yīng)病級(jí)）/（調(diào)查總株數(shù)×最高病級(jí)）×100；病害防效=（病菌對(duì)照病情指數(shù)-處理病情指數(shù)）/對(duì)照病情指數(shù)×100%。病情分級(jí)為0級(jí)：無(wú)病斑；1級(jí)：病斑面積占整個(gè)葉面積的1%以下；3級(jí)：病斑面積占整個(gè)葉面積的2%～5%；5級(jí)：病斑面積占整個(gè)葉面積的6%～20%；7級(jí)：病斑面積占整個(gè)葉面積的21%～35%；9級(jí)：病斑面積占整個(gè)葉面積的36%以上。

1.2.8" 樣品總DNA的提取及微生物多樣性分析" 采用E.Z.N.A.^? Soil DNA Kit（Omega Bio-tek）DNA抽提試劑盒，抽提根際土壤樣本DNA。采用NEXTflexTM Rapid DNA Seq Kit （Bioo Scientific）構(gòu)建DNA測(cè)序庫(kù)。細(xì)菌16S rRNA V1～V9區(qū)全長(zhǎng)引物序列為27F（5?-AGRGTTTGATYNT GGCTCAG-3?）；1492R（5?-TASGGHTACCTTG TTASGACTT-3?）。真菌ITS rRNA全長(zhǎng)引物序列為ITS1（5?-CTTGGTCATTTAGAGGAAGTAA- 3?）；ITS4（5?-TCCTCCGCTTATTGATATGC-3?）。采用上海美吉生物醫(yī)藥科技有限公司的MiSeq PE300測(cè)序平臺(tái)獲得原始數(shù)據(jù)。

1.3 "數(shù)據(jù)處理

采用Excel 2019軟件整理統(tǒng)計(jì)數(shù)據(jù)；采用Graphpad Pism 9.5軟件進(jìn)行單因素方差分析和鄧肯多重比較，以Plt;0.05為差異顯著水平，并繪圖。采用Chao1指數(shù)評(píng)估菌群豐富度，采用Shannon指數(shù)、Simpson指數(shù)評(píng)估菌群多樣性，利用R語(yǔ)言繪制物種群落組成Bar圖并進(jìn)行主成分分析。

2" 結(jié)果與分析

2.1 "貝萊斯芽孢桿菌綠色熒光標(biāo)記及遺傳穩(wěn)定性檢測(cè)

將pGFP-4412質(zhì)粒成功導(dǎo)入貝萊斯芽孢桿菌SK1-5-2后，獲得了能夠在抗性平板上生長(zhǎng)的標(biāo)記菌株SK1-5-2-GFP。以SK1-5-2-GFP的基因組DNA為模板，使用GFP基因特異性引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增，擴(kuò)增產(chǎn)物大小約為1000 bp，與設(shè)計(jì)片段長(zhǎng)度一致（圖1A）。此外，在共聚焦激光掃描顯微鏡下觀察到SK1-5-2-GFP能夠激發(fā)出明顯的綠色熒光（圖1B），表明pGFP-4412質(zhì)粒已成功轉(zhuǎn)入菌株體內(nèi)并能正常表達(dá)。進(jìn)一步對(duì)標(biāo)記菌株進(jìn)行遺傳穩(wěn)定性檢測(cè)，將SK1-5-2-GFP傳代至第10代（圖1C）和第20代（圖1D）后，依然可在抗性平板上正常生長(zhǎng)，單菌落在共聚焦顯微鏡下仍能激發(fā)綠色熒光。結(jié)果表明，pGFP-4412質(zhì)粒在SK1-5-2菌株中具有良好的遺傳穩(wěn)定性。

2.2 "標(biāo)記菌株SK1-5-2-GFP對(duì)油茶炭疽病的抑制作用

在平板對(duì)峙試驗(yàn)中比較了原始菌株（圖2A）與標(biāo)記菌株（圖2B）對(duì)油茶炭疽病病原菌的抑制能力。結(jié)果表明，GFP標(biāo)記菌株抑菌率為87%，原始型菌株抑菌率為84%，二者在抑制病原菌生長(zhǎng)的能力上無(wú)顯著差異。表明GFP標(biāo)記對(duì)貝萊斯芽孢桿菌的拮抗功能未造成明顯影響。

2.3" 菌株SK1-5-2-GFP在生物炭上的固定與存活

通過(guò)環(huán)境掃描電子顯微鏡（ESEM）和共聚焦激光掃描顯微鏡（CLSM）成像，證實(shí)了貝萊斯芽孢桿菌SK1-5-2-GFP在生物炭表面的成功附著與定殖。ESEM圖像顯示，SK1-5-2-GFP菌株主要分布于生物炭的管狀結(jié)構(gòu)和側(cè)向褶皺內(nèi)部（圖3A，圖3B），表明這些微結(jié)構(gòu)為菌體提供了良好的附著位點(diǎn)與保護(hù)環(huán)境。進(jìn)一步，CLSM圖像清晰觀察到表達(dá)綠色熒光蛋白的活菌在生物炭表面的分布（圖3C，圖3D，圖3E），驗(yàn)證了SK1-5-2-GFP細(xì)胞的活性及穩(wěn)定定殖效果。

2.4 "標(biāo)記菌株SK1-5-2-GFP在油茶根系的定殖

熒光共聚焦顯微鏡（CLSM）圖像顯示，標(biāo)記菌株SK1-5-2-GFP能夠在油茶側(cè)根部成功定殖（圖4）。菌株主要分布于側(cè)根細(xì)胞壁及細(xì)胞間隙區(qū)域（圖4A）。明場(chǎng)圖像展示了油茶側(cè)根的細(xì)胞結(jié)構(gòu)，為貝萊斯芽孢桿菌的定殖定位提供結(jié)構(gòu)參考（圖4B）。熒光圖與明場(chǎng)圖疊加后顯示，菌株主要分布在根表面及部分細(xì)胞間隙區(qū)域（圖4C）。綜合觀察結(jié)果推測(cè)，貝萊斯芽孢桿菌可能通過(guò)細(xì)胞間隙擴(kuò)散的方式在根際形成菌群聚集，實(shí)現(xiàn)有效定殖。

2.5" 生物炭負(fù)載貝萊斯芽孢桿菌SK1-5-2-GFP對(duì)油茶生長(zhǎng)的影響

不同處理對(duì)油茶生長(zhǎng)的影響如圖5所示。與CK相比，BV、BC和BB處理均顯著促進(jìn)油茶的生長(zhǎng)發(fā)育，在株高、葉面積、莖基直徑、葉綠素含量及鮮質(zhì)量等指標(biāo)上均明顯高于CK。此外，這3組處理的油茶根系發(fā)達(dá)，根毛數(shù)量明顯增多，尤其是BV和BB，根毛分布更為豐富。在BV與BB處理間，株高、葉面積、葉綠素含量及鮮質(zhì)量差異不顯著，但BB的地徑顯著高于BV。與BC相比，BV和BB在所有生長(zhǎng)指標(biāo)上均表現(xiàn)出顯著優(yōu)勢(shì)。綜上，BB在促進(jìn)油茶生長(zhǎng)方面的效果最為顯著，優(yōu)于BV或BC，顯示出良好的協(xié)同增效作用。

2.6 "生物碳負(fù)載貝萊斯芽孢桿菌SK1-5-2-GFP對(duì)土壤理化性質(zhì)的影響

研究表明，生物炭處理顯著改善了土壤的理化性質(zhì)（表1）。在全氮含量方面，BB和BC均顯著高于CK，提升幅度為48.3%～55.2%。速效磷含量在BB和BC中也顯著提高，分別較CK提升334.0%和288.0%；相反，BV的速效磷含量較CK下降68.1%。速效鉀含量呈現(xiàn)出BCgt;CKgt;BBgt;BV的變化趨勢(shì)，其中BC較CK提高63.1%。在有機(jī)質(zhì)含量方面，BC和BB均為CK的2.8倍，而B(niǎo)V與CK之間無(wú)顯著差異。土壤pH在各處理間無(wú)顯著差異。綜合分析結(jié)果顯示，BC在提升速效鉀、有機(jī)質(zhì)和全氮含量方面表現(xiàn)最佳，而B(niǎo)B在速效磷和全氮含量的提升上具有更明顯優(yōu)勢(shì)。相比之下，BV對(duì)大多數(shù)土壤養(yǎng)分指標(biāo)產(chǎn)生了抑制效應(yīng)，進(jìn)一步凸顯生物炭基質(zhì)在土壤改良中的顯著作用，優(yōu)于菌劑單獨(dú)施用。

2.7" 生物碳負(fù)載貝萊斯芽孢桿菌SK1-5-2-GFP對(duì)土壤酶活力的影響

研究顯示，相較于CK，BB、BV、BC對(duì)土壤酶活性具有顯著調(diào)控作用（圖6）。其中，BB和BV表現(xiàn)尤為突出：過(guò)氧化氫酶（CAT）活性分別提升28.0%和24.4%，蔗糖酶（SC）活性分別提高44.4%和65.4%，脲酶（UE）活性增幅分別達(dá)57.9%和68.6%，且酸性磷酸酶（ACP）活性在BB中激增338.6%，顯著優(yōu)于CK。BC雖使脲酶和過(guò)氧化氫酶活性分別提升21.7%和11.4%，但其蔗糖酶和酸性磷酸酶活性與CK無(wú)顯著差異。所有處理組中，CK的酶活性均處于最低水平，表明處理組BB和BV能系統(tǒng)性?xún)?yōu)化土壤酶活性，強(qiáng)化土壤生化功能。

2.8" 生物碳負(fù)載貝萊斯芽孢桿菌SK1-5-2- GFP對(duì)油茶抗病性的影響

不同處理對(duì)油茶抗病性的影響如圖7所示。CK與BC的病情指數(shù)均為77.8%，表明單獨(dú)施用生物炭對(duì)油茶炭疽病的抑制效果有限。BV的病情指數(shù)為60.1%，而B(niǎo)B顯著下降至55.6%（圖7A）。結(jié)果顯示，含有貝萊斯芽孢桿菌的BV和BB均能顯著降低病情指數(shù)，其中BB的抗病效果優(yōu)于BV（圖7B）。貝萊斯芽孢桿菌在提高油茶抗病性方面具有顯著作用，且與生物炭聯(lián)用可進(jìn)一步增強(qiáng)其防控效果。

2.9" 生物炭負(fù)載貝萊斯芽孢桿菌對(duì)根際微生物多樣性和群落結(jié)構(gòu)的影響

2.9.1" α和?多樣性分析 "選取ACE、Chao1、Shannon和Simpson 4個(gè)α多樣性指數(shù)，在97% OTU相似度水平下對(duì)細(xì)菌和真菌群落進(jìn)行分析，相關(guān)結(jié)果見(jiàn)表2和表3。根際細(xì)菌群落的ACE指數(shù)、Chao1指數(shù)、Shannon指數(shù)及Simpson指數(shù)顯示，與CK相比，BV、BC和BB的物種豐富度和多樣性均有所提高，但差異均未達(dá)到顯著水平（表2）。

在真菌群落方面，ACE指數(shù)分析結(jié)果表明，CK顯著高于其他3個(gè)處理組；Chao1指數(shù)中，CK顯著高于BV，但與BC和BB差異不顯著。

Shannon指數(shù)與Simpson指數(shù)分析顯示，各處理組間無(wú)顯著性差異（表3）?？傮w來(lái)看，與CK相比，各處理在提高根際細(xì)菌物種豐富度和多樣性方面具有一定優(yōu)勢(shì)，而真菌物種豐富度則呈下降趨勢(shì)，真菌多樣性略有提高，但差異均不顯著。

細(xì)菌主成分分析（PCA）結(jié)果見(jiàn)圖8A，BC樣本明顯與其他處理組分離，表明生物炭的施用顯著改變了根際細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)。BV與CK未表現(xiàn)出明顯分離，說(shuō)明單獨(dú)施用貝萊斯芽孢桿菌對(duì)細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)影響有限。BB則與其他各組分離明顯，顯示生物炭負(fù)載貝萊斯芽孢桿菌的處理對(duì)根際細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)的影響既區(qū)別于單獨(dú)的生物炭處理，也不同于單獨(dú)施用菌劑，具有一定的獨(dú)特性。

真菌主成分分析結(jié)果如圖8B所示，各處理組間差異明顯，表明各處理方式對(duì)根際真菌群落結(jié)構(gòu)均產(chǎn)生了顯著影響。

2.9.2" 細(xì)菌門(mén)分類(lèi)水平和屬分類(lèi)水平群落組成分析" 不同處理組油茶根際的細(xì)菌門(mén)水平和屬水平的優(yōu)勢(shì)微生物豐度百分比堆疊柱狀圖（相對(duì)豐度gt;1%）如圖9和圖10所示?；谙鄬?duì)豐度gt;1%定義優(yōu)勢(shì)細(xì)菌門(mén)和優(yōu)勢(shì)細(xì)菌屬，各處理組的優(yōu)勢(shì)細(xì)菌門(mén)為12個(gè)。分別為假單胞菌門(mén)（Pseudomona-dota）、芽孢桿菌門(mén)（Bacillota）、酸桿細(xì)菌門(mén)（Acidobacteriota）、疣微菌門(mén)（Verrucomic-robiota）、放線(xiàn)菌門(mén)（Actinomycetota）、擬桿菌門(mén)（Bacteroidota）、熱硫還原菌門(mén)（Thermomicro-biota）、浮霉菌門(mén)（Planctomycetota）、綠彎菌門(mén)（Chloroflexota）、芽單胞菌門(mén)（Gemmatim-onadota）、硝化螺旋菌門(mén)（Nitrospirota）、熱脫硫桿菌門(mén)（Thermodesulfobacteriota）。CK中假單胞菌門(mén)與芽孢桿菌門(mén)占主導(dǎo)地位，酸桿菌門(mén)次之。BV酸桿菌門(mén)和放線(xiàn)菌門(mén)比例有所增加。BC假單胞菌門(mén)和放線(xiàn)菌門(mén)比例增加，芽孢桿菌門(mén)比例降低。BB芽孢桿菌門(mén)比例明顯增加，但假單胞菌門(mén)和酸桿菌門(mén)比例降低。

各處理組細(xì)菌群落均以芽孢桿菌屬（Bacillus）為主，其在土壤中占優(yōu)勢(shì)地位，其他屬的變化差異明顯。與CK相比，BV中的芽孢桿菌屬的豐度下降明顯，而博爾克氏菌屬（Burkholderia）和暫定酸桿菌屬（Candidatus Koribacter）的豐度均明顯上升；在BC中，硫細(xì)菌屬（Thiobacter）增長(zhǎng)1100.0%，鞘氨醇單胞菌（Sphingomonas）增加了400%；BB中芽孢桿菌屬和斯特氏菌屬（Priestia）明顯高于BC和BV，斯特氏菌屬相較于CK增加400%，并且相較于其

他處理組各菌屬比例較為均勻。這種微生物群落的變化可能反映了生物炭負(fù)載貝萊斯芽孢桿菌在微生態(tài)系統(tǒng)中的獨(dú)特作用，增加了土壤微生物群落穩(wěn)定性，進(jìn)而影響土壤健康和作物生長(zhǎng)。

2.9.3" 真菌門(mén)分類(lèi)水平和屬分類(lèi)水平群落結(jié)構(gòu)分析" 不同處理組油茶根際的真菌門(mén)水平和屬水平的優(yōu)勢(shì)微生物豐度百分比堆疊柱狀圖（相對(duì)豐度gt;1%）如圖11和圖12所示?；谙鄬?duì)豐度gt;1%定義優(yōu)勢(shì)真菌門(mén)和優(yōu)勢(shì)真菌屬，在門(mén)水平上，各處理組的優(yōu)勢(shì)真菌門(mén)均為7個(gè)。分別為子囊菌門(mén)（Ascomycota）、擔(dān)子菌門(mén)（Basidiomycota）、未定分類(lèi)真菌（unclassified_k__Fungi）、壺菌門(mén)（Chytridiomycota）、羅澤爾菌門(mén)（Rozell-omycota）、球囊菌門(mén)（Glomeromycota）、未定分類(lèi)真菌門(mén)（Fungi_phy_Incertae_sedis），其中子囊菌門(mén)和擔(dān)子菌門(mén)豐度占比最大。與CK相比，BV中子囊菌門(mén)比例上升；BC中擔(dān)子菌門(mén)比例下降明顯，但羅澤爾菌門(mén)和壺菌門(mén)真菌比例增加；BB中未定分類(lèi)真菌和和羅澤爾菌門(mén)比例上升而擔(dān)子菌門(mén)略有下降。

真菌屬水平上，各處理組的優(yōu)勢(shì)真菌屬為藍(lán)狀菌屬（Talaromyces），屬的變化差異明顯。研究發(fā)現(xiàn)：相比于CK，BV土壤中木霉屬（Tric-hoderma）相對(duì)豐度升高，腐質(zhì)霉屬（Humicola）上升；BC中木霉相對(duì)豐度上升，未明確歸類(lèi)壺菌（unclassified-p-Chytridiomycota）和黑盤(pán)孢屬（Melanconiella）相對(duì)豐度也上升明顯；BB中藍(lán)狀菌屬比例上升，未知真菌（Unclassified_k_ Fungi）相對(duì)豐度上升顯著，而鐮刀菌屬豐度明顯下降。

3" 討論

本研究結(jié)果表明，生物炭負(fù)載貝萊斯芽孢桿菌SK1-5-2能夠顯著促進(jìn)油茶的生長(zhǎng)，改善土壤養(yǎng)分狀況，并優(yōu)化根際土壤微生物群落結(jié)構(gòu)。具體而言，生物炭作為載體，提高了SK1-5-2在土壤中的存活率和定殖能力，增強(qiáng)了其促生與生防功能，使其能夠在土壤中長(zhǎng)期發(fā)揮作用。此外，該處理顯著提高了土壤酶活性，增強(qiáng)了土壤微生物多樣性，并有效降低了油茶炭疽病的病情指數(shù)。進(jìn)一步分析發(fā)現(xiàn)，SK1-5-2在生物炭的支持下，不僅自身存活能力增強(qiáng)，還通過(guò)分泌吲哚乙酸、細(xì)胞分裂素等植物生長(zhǎng)促進(jìn)物質(zhì)，促進(jìn)植物根系發(fā)育，并招募多種有益微生物菌群，如斯特氏菌屬、博爾克氏菌屬、藍(lán)狀菌屬、木霉屬等，從而間接改善了土壤生態(tài)系統(tǒng)的穩(wěn)定性和健康狀況。

與現(xiàn)有研究相比，本研究進(jìn)一步證實(shí)了生物炭作為微生物載體在農(nóng)業(yè)和土壤生態(tài)修復(fù)中的潛在價(jià)值。已有研究表明，生物炭由于富含有機(jī)碳、孔隙率高、持水能力強(qiáng)等特性，為土壤微生物提供了理想的棲息環(huán)境，增強(qiáng)了有益微生物的存活能力和功能發(fā)揮^{[12， 32]}。例如，枯草芽孢桿菌負(fù)載于生物炭后，其在土壤中的存活期顯著延長(zhǎng)，并對(duì)病原菌產(chǎn)生更強(qiáng)的拮抗作用^[33]。此外，JIANG等^[34]的研究發(fā)現(xiàn)，載有N33菌株的生物炭能夠富集芽孢桿菌門(mén)、綠彎菌門(mén)及芽孢桿菌科等功能微生物，提高土壤酶活性，并改善土壤氮磷鉀等養(yǎng)分，最終促進(jìn)山核桃生長(zhǎng)。本研究結(jié)果與這些研究一致，進(jìn)一步驗(yàn)證了生物炭負(fù)載B. velezensis在提高土壤養(yǎng)分、優(yōu)化微生物群落結(jié)構(gòu)及增強(qiáng)植物抗病性方面的協(xié)同作用。值得注意的是，本研究不僅證實(shí)了生物炭負(fù)載B. velezensis促進(jìn)植物生長(zhǎng)的直接效應(yīng)，還揭示了其在提升土壤微生態(tài)穩(wěn)定性和病害防控能力方面的積極作用。

生物炭-微生物復(fù)合體系的作用機(jī)制可能涉及多個(gè)方面。首先，生物炭的孔隙結(jié)構(gòu)為B. velezensis提供了物理保護(hù)，使其免受土壤中捕食者的威脅，同時(shí)緩解了養(yǎng)分匱乏對(duì)微生物存活的不利影響。這種結(jié)構(gòu)性支持增強(qiáng)了B. velezensis在土壤中的定殖能力，從而延長(zhǎng)其促生和拮抗作用的持續(xù)時(shí)間。其次，B. velezensis通過(guò)分泌吲哚乙酸、細(xì)胞分裂素等植物生長(zhǎng)調(diào)節(jié)物質(zhì)，促進(jìn)植物根系發(fā)育，提高植物對(duì)土壤養(yǎng)分的吸收能力，并通過(guò)固氮、溶磷、解鉀等功能提高土壤養(yǎng)分的有效性^[35-37]。此外，B. velezensis還能夠分泌鐵載體等次級(jí)代謝產(chǎn)物，進(jìn)一步增強(qiáng)土壤微生態(tài)的活力，并促進(jìn)有益微生物的富集。例如，本研究發(fā)現(xiàn)，B. velezensis的引入使根際土壤中慢生根瘤菌屬、博爾克氏菌屬、藍(lán)狀菌屬、木霉屬等微生物的豐度顯著增加。這些微生物能夠通過(guò)多種機(jī)制促進(jìn)植物健康，如固氮、分解有機(jī)質(zhì)釋放養(yǎng)分、改善土壤結(jié)構(gòu)及通過(guò)產(chǎn)生植物激素直接影響植物生長(zhǎng)等^[38]。土壤微生物群落的多樣性在提高土壤生態(tài)穩(wěn)定性和增強(qiáng)植物抗病能力方面具有重要作用^[39-40]。研究表明，微生物多樣性越高，土壤對(duì)外界干擾的抵抗力越強(qiáng)，從而降低植物病害的發(fā)生率^[41]。在本研究中，生物炭負(fù)載B. velezensis處理組中的芽孢桿菌屬、藍(lán)狀菌屬的相對(duì)豐度均明顯提高，這些菌群在土壤病原菌的生物防治方面具有重要作用。例如，芽孢桿菌能夠分泌多種抗生素，如枯草芽孢菌素和抗真菌物質(zhì)，能夠有效抑制炭疽病病原菌的生長(zhǎng)^[42]。此外，木霉菌在共生微生物群落中能夠通過(guò)競(jìng)爭(zhēng)作用抑制病原微生物，限制病害的傳播^[43-44]。已有研究表明，生物炭作為根際有益微生物的載體，可以顯著提高其在土壤和植物根系中的持久性、存活率和定殖效果，從而提高植物的抗病能力^[45]。例如，生物炭與鏈霉菌聯(lián)合使用，能夠顯著提升對(duì)馬鈴薯晚疫霉的抑制效果，并顯著降低晚疫病的病情指數(shù)^[46]。同樣，本研究結(jié)果也表明，將B. velezensis負(fù)載于生物炭上，不僅增強(qiáng)了其生物防治能力，還顯著降低了油茶炭疽病的病情指數(shù)，其效果優(yōu)于單獨(dú)施用生物炭或單獨(dú)施用B. velezensis的處理組。

綜合來(lái)看，本研究結(jié)果不僅深化了對(duì)生物炭負(fù)載有益微生物的作用機(jī)制的理解，也為農(nóng)業(yè)可持續(xù)發(fā)展提供新的思路。生物炭最初被用于土壤改良，以增強(qiáng)碳封存能力，但近年來(lái)的研究表明，其功能遠(yuǎn)不止于此^[19]。本研究進(jìn)一步驗(yàn)證了生物炭作為生物載體的應(yīng)用價(jià)值，表明其在促進(jìn)植物健康、提高土壤養(yǎng)分供應(yīng)能力、優(yōu)化土壤微生物群落、增強(qiáng)植物抗病性等方面具有顯著的生態(tài)效益。未來(lái)的研究可進(jìn)一步探討不同類(lèi)型的生物炭對(duì)B. velezensis及其他生防菌的載體效果，并評(píng)估其在不同土壤環(huán)境和作物系統(tǒng)中的適用性。此外，可利用宏基因組學(xué)、代謝組學(xué)等多組學(xué)技術(shù)解析生物炭-微生物復(fù)合體系在根際環(huán)境中的作用機(jī)制，以更精準(zhǔn)地調(diào)控根際微生物群落，提升農(nóng)業(yè)生態(tài)系統(tǒng)的可持續(xù)性。綜上，生物炭負(fù)載B. velezensis作為一種綠色、可持續(xù)的生物防治策略，不僅顯著提升油茶的生長(zhǎng)表現(xiàn)和抗病能力，也為生態(tài)農(nóng)業(yè)的發(fā)展提供重要的理論依據(jù)和實(shí)踐指導(dǎo)。

4" 結(jié)論

本研究通過(guò)系統(tǒng)分析生物炭負(fù)載貝萊斯芽孢桿菌SK1-5-2對(duì)油茶生長(zhǎng)抗病及根際微生態(tài)的影響，揭示了該復(fù)合體系在農(nóng)業(yè)應(yīng)用中的多重增效機(jī)制。結(jié)果表明，生物炭作為功能性載體顯著提升了B. velezensis的定殖能力，通過(guò)物理保護(hù)效應(yīng)和微環(huán)境調(diào)控延長(zhǎng)了其促生與生防功能的持續(xù)時(shí)間。該體系通過(guò)分泌植物激素促進(jìn)油茶根系發(fā)育，并激活土壤酶活性，提高氮磷鉀等養(yǎng)分有效性，同時(shí)通過(guò)定向富集籃狀菌屬、木霉屬等有益微生物，構(gòu)建了抗病性更強(qiáng)的根際微生物網(wǎng)絡(luò)，使油茶炭疽病病情指數(shù)顯著降低。與單一施用生物炭或菌劑相比，生物炭-微生物復(fù)合體系展現(xiàn)出顯著的協(xié)同效應(yīng)，證實(shí)其作為綠色生防策略在提升土壤生態(tài)功能、增強(qiáng)植物抗逆性方面的獨(dú)特優(yōu)勢(shì)。

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