海島棉R2R3-MYB基因家族的鑒定及其在黃萎病脅迫下的表達(dá)分析

中圖分類號(hào)：S562：Q786 文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)號(hào)：A 文章編號(hào)：1001-4942（2025）06-0001-14

AbstractR2R3-MYB transcription factors play crucial roles in the process of plants responding to stress. In this study，based on the genomic data of Gosspium barbadense，the members of the R2R3-MYB gene family in G .barbadense were systematically identified. Bioinformatics methods were used to analyze the phyletic evolution，structure，physicochemical properties，and cis-acting elements of the promoter of the R2R3-MYB gene family in G . barbadense. Five candidate genes for Verticillium wilt resistance were screened out using transcriptome expression profiles，and the expression patterns of each candidate gene under the induction of Verticillium wilt，salicylic acid （SA）and methyl jasmonate （MeJA） were analyzed by real-time fluorescence quantitative PCR. The results showed that there were 98 R2R3-MYB genes in the genome of G .barbadense，which distributed on 25 chromosomes.The phylogenetic tree analysis indicated that the members of the R2R3-MYB gene family in G. barbadense could be divided into three large subgroups，and they were relatively conserved in evolution.Promoter analysis revealed multiple cis-acting elements related to plant hormonesand stress responses.The expression patern analysis after Verticillium wilt stress showed that all the R2R3-MYB genes in G barbadense had different degrees of diferential expression after Verticillium wilt stress.Five candidate genes for Verticillium wilt resistance in G. barbadense （GbMYB-21，GbMYB-34，GbMYB-39， GbMYB-76，and GbMYB83）were screened out，which were all induced by Verticillum wilt stress，SA and MeJA.In conclusion，this study demonstrated that the R2R3-MYB gene family in G. barbadense played an important role in coton disease resistance，which could provide a theoretical basis for further research on the functions of R2R3-MYB genes in G. barbadense and the molecular mechanism of cotton resistance to Verticillium wilt.

KeywordsGossypium barbadense； R2R3-MYB gene family； Bioinformatics analysis； Verticillium wiltstress ； Expression analysis

棉花是我國(guó)重要的經(jīng)濟(jì)作物，在紡織、國(guó)防、醫(yī)藥和汽車等領(lǐng)域有著重要的用途。然而隨著棉花種植面積的擴(kuò)大以及連年種植，黃萎病危害越發(fā)嚴(yán)重，造成棉花產(chǎn)量的損失。由于缺乏可利用的抗性資源且棉花抗黃萎病的分子機(jī)制尚不清晰，使棉花抗黃萎病育種成為世界性難題。海島棉具有較高的黃萎病抗性，因此解析海島棉抗黃萎病的分子機(jī)制成為了一個(gè)熱門且亟需解決的問題。

轉(zhuǎn)錄因子又稱反式作用因子，通過與真核基因的順式作用元件產(chǎn)生特異性相互作用激活或抑制基因的轉(zhuǎn)錄[1]。MYB是植物中一類最大的轉(zhuǎn)錄因子家族，第一個(gè)MYB轉(zhuǎn)錄因子是從玉米中分離鑒定出來的 ZmMYBC1^[2] 。基于其N端所包含的MYB保守結(jié)構(gòu)域的數(shù)目將MYB蛋白歸于4個(gè)亞類：1R-MYB（R1/2或R3MYB）、2R-MYB（R2R3-MYB）3R-MYB（R1R2R3-MYB）和4R-MYB（R1/R2-like）[3]。每個(gè)MYB 保守結(jié)構(gòu)域均由50個(gè)左右氨基酸組成并編碼3個(gè)a螺旋，形成螺旋-轉(zhuǎn)角-螺旋結(jié)構(gòu)嵌合在DNA大溝中，而在MYB蛋白的C端通常包含1個(gè)轉(zhuǎn)錄激活域或1個(gè)發(fā)揮轉(zhuǎn)錄抑制功能的EAR結(jié)構(gòu)[4]。這4個(gè)亞類的MYB蛋白在功能上存在巨大的差異，其中1R蛋白參與次生代謝、響應(yīng)磷饑餓信號(hào)以及花與果實(shí)的發(fā)育調(diào)控[5];3R蛋白通常與細(xì)胞周期的調(diào)控緊密相關(guān)[；4R蛋白是最小的一個(gè)亞類，目前尚無功能報(bào)道;2R蛋白是成員最多的一個(gè)亞類，根據(jù)其C端保守氨基酸結(jié)構(gòu)域分為28個(gè)亞組，分別參與初生代謝和次生代謝、激素信號(hào)傳導(dǎo)、發(fā)育調(diào)控及生物逆境脅迫和非生物逆境脅迫響應(yīng)等[7-8]

R2R3-MYB轉(zhuǎn)錄因子在植物抗病過程中發(fā)揮著重要作用。有研究表明，在抗疫霉病的辣椒品種中R2R3-MYB轉(zhuǎn)錄因子的表達(dá)量顯著上調(diào)[9]。硫化氫氣體信號(hào)通過對(duì)R2R3-MYB轉(zhuǎn)錄因子CsMYB30的巰基化修飾增強(qiáng)其對(duì)靶啟動(dòng)子的結(jié)合活性，進(jìn)而促進(jìn)黃瓜病程相關(guān)蛋白PR1的基因表達(dá)，提高黃瓜對(duì)灰霉病的抗性[10]。在桑樹中R2R3-MYB轉(zhuǎn)錄因子MaMYB4在病葉中的表達(dá)量顯著高于健葉，將MaMYB4轉(zhuǎn)入煙草中后發(fā)現(xiàn)轉(zhuǎn)基因煙草能夠顯著提高對(duì)煙草花葉病毒的抗性[11]。小麥R2R3-MYB轉(zhuǎn)錄因子 TaMYB28能夠和TaCER1-1互作進(jìn)而增強(qiáng)小麥蠟質(zhì)層的厚度，影響蠟質(zhì)晶體的數(shù)量和形態(tài)，調(diào)控韌皮部防衛(wèi)反應(yīng)，提高小麥對(duì)白粉病的抗性[12] O

基因組測(cè)序在棉花中取得了顯著的成果，使系統(tǒng)鑒定和研究棉花基因家族成為可能[13-16] 。本課題組在之前的研究中通過黃萎病脅迫的轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)篩選到了一個(gè)R2R3-MYB轉(zhuǎn)錄因子作為候選基因，通過棉花病毒介導(dǎo)的基因沉默（virusinducedgenesilencing，VIGS）和超表達(dá)擬南芥發(fā)現(xiàn)其能夠通過調(diào)控木質(zhì)素合成來抵御黃萎病。基因序列決定蛋白質(zhì)氨基酸序列，進(jìn)而決定蛋白質(zhì)的空間結(jié)構(gòu)和功能，基因序列間的相似性越高，其在植物中所發(fā)揮的功能也越相近。為了篩選更多與黃萎病抗性相關(guān)的候選基因，本研究分析了海島棉 R2R2–MYB 基因家族的染色體分布、系統(tǒng)進(jìn)化關(guān)系、基因結(jié)構(gòu)、啟動(dòng)子順式作用元件和黃萎病脅迫下它們?cè)诤u棉根部的表達(dá)譜，并通過轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)、順式作用元件分析、黃萎病脅迫和外源激素誘導(dǎo)表達(dá)篩選抗黃萎病相關(guān)候選基因，以期為海島棉 R2R3-MYB 基因功能和棉花抗黃萎病分子機(jī)制研究提供理論依據(jù)。

材料與方法

1.1 材料與處理

選用海島棉品種海7124為試驗(yàn)材料，盆栽試驗(yàn)于2023年10月15日在新疆農(nóng)業(yè)大學(xué)農(nóng)業(yè)與生物技術(shù)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室棉花栽培實(shí)驗(yàn)室中進(jìn)行。將海7124種植于蛭石和消毒土壤按 1：2 混合配成的基質(zhì)中，營(yíng)養(yǎng)缽直徑為 10cm ，每個(gè)營(yíng)養(yǎng)缽裝入200g 基質(zhì)，每盆3顆種子。培養(yǎng)條件：溫度 25.0～ 28.0‰ ，以白熾燈為光源，光周期 ^16h 光照 ^′8h 黑暗，相對(duì)濕度 80% 。2023年11月5日棉株長(zhǎng)至兩葉一心時(shí)，使用撕底傷根法對(duì)棉株接種大麗輪枝菌V991，分別于接種后 0，1，3，6，12，24，48， ^72h 采集根部組織，每處理重復(fù)3次。2023年11月16日將配制好的0.05mmol/LMeJA和SA溶液分別噴施到有3＼～4片真葉的棉花植株上，直至有水珠滴下為止，分別于噴施后0、1、3、6、12、24、48，72h 對(duì)棉花真葉取樣，每處理重復(fù)3次。

1.2 海島棉 R2R3-MYB 基因的鑒定與生物信息學(xué)分析

海島棉全基因組、蛋白質(zhì)序列和GFF3文件來自于 Cottongen 網(wǎng)站（https：//www.cottongen.org/data/download/genome_tetraploid/AD2），擬南芥基因組和蛋白質(zhì)序列文件來自于TAIR網(wǎng)站（https：//www.arabidopsis. org/download/index-au-to.jsp？ dir /download_files/Genes），水稻基因組和蛋白質(zhì)序列文件來自于EnsemblPlants網(wǎng)站（https：//ftp. ebi. ac.uk/ensemblgenomes/pub/re-lease-58/plants/fasta/oryza_sativa/pep/）[17]。使用 Pfam 網(wǎng)站（http：//pfam-legacy.xfam.org/）下載MYB轉(zhuǎn)錄因子中保守的MYB結(jié)合結(jié)構(gòu)域HMM模型文件（PF00249），通過TBtools軟件中的Sim-pleHMMSearch篩選海島棉、擬南芥和水稻中的R2R3-MYB 家族基因[18]。通過 NCBI（https：//www.ncbi.nlm.nih.gov/）中保守結(jié)構(gòu)域數(shù)據(jù)庫(kù)（conserveddomaindatabase，CDD）剔除基因結(jié)構(gòu)不完整和序列過短的候選基因[19]，最終得到海島棉、擬南芥和水稻 R2R3-MYB 基因家族成員。利用ExPASy 軟件（http：//cn.expasy.org/tools）計(jì)算海島棉R2R3-MYB家族蛋白的氨基酸數(shù)量、相對(duì)分子質(zhì)量、理論等電點(diǎn)、不穩(wěn)定系數(shù)、脂肪族氨基酸指數(shù)和親疏水性平均系數(shù)[20]

1.3海島棉 R2R3-MYB 基因家族的系統(tǒng)發(fā)育

利用MEGA11軟件中的ClustalW默認(rèn)設(shè)置對(duì)擬南芥、水稻和海島棉的R2R3-MYB蛋白序列進(jìn)行多序列比對(duì)，基于序列比對(duì)的結(jié)果采用鄰近法構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹，其中Bootstrap值設(shè)定為1 000 ，利用在線工具Evolview（https：//evolgenius.info/）對(duì)系統(tǒng)發(fā)育樹進(jìn)行編輯和美化。

1.4海島棉 R2R3-MYB 基因家族的染色體位置、基因結(jié)構(gòu)、motif分析和順式作用元件分析

從海島棉基因組注釋文件中提取海島棉R2R3-MYB基因家族成員的染色體位置信息，利用Mapchart軟件繪制基因的染色體定位圖。通過MEGA11軟件構(gòu)建海島棉 R2R3-MYB 基因家族進(jìn)化樹，得到nwk 文件[21]。通過 MEME 程序進(jìn)行motif分析（設(shè)置功能域數(shù)為10）[22]。將MEME程序運(yùn)行后得到的xml文件、進(jìn)化樹的nwk文件和基因結(jié)構(gòu)的gff文件利用TBtools軟件進(jìn)行可視化處理[23]。截取海島棉 R2R3-MYB 基因上游200ObpDNA序列，利用PlantCARE數(shù)據(jù)庫(kù)（http：//bioinformatics.psb.ugent.be/webtools/plantcare/html/）預(yù)測(cè)可能存在的順式作用元件，并使用TBtools軟件進(jìn)行可視化處理[24] 。

1.5海島棉 R2R3-MYB 基因家族表達(dá)模式分析

從NCBI SAR（Sequence Read Archive）數(shù)據(jù)庫(kù)下載海7124黃萎病接菌后的轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)（基因組測(cè)序計(jì)劃編號(hào)PRJNA234454）。使用fastp軟件（版本0.23.4）進(jìn)行原始數(shù)據(jù)過濾，獲得可用于后續(xù)分析的cleanreads。以海7124的基因組（ht-tps：//www.cottongen.org/species/Gossypium__bar-badense/ZJU-AD2_v1.1）作為參考，使用HISAT2進(jìn)行 reads比對(duì)，利用StringTie工具對(duì)比對(duì)上的reads進(jìn)行定量[25]。用每千個(gè)堿基的轉(zhuǎn)錄每百萬映射讀取的碎片（FPKM）衡量基因表達(dá)量。

1.6 候選基因表達(dá)分析

根據(jù)海島棉R2R3-MYB家族基因的cDNA信息，采用PrimerPrimier5.0軟件設(shè)計(jì)特異區(qū)域引物（表1）。分別以海7124黃萎病脅迫的根組織和激素誘導(dǎo)的葉片組織cDNA為模板，利用qRT-PCR方法檢測(cè)候選基因的表達(dá)情況，每個(gè)樣本設(shè)置3次重復(fù)，內(nèi)參基因?yàn)镚bUBQ7。

qRT-PCR按照Zhao 等[26]的方法進(jìn)行?？俁NA提取試劑盒（天根，中國(guó)）。使用M-MLVRTasecDNASynthesisKit（TaKaRa，日本）進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄。在 BioRad CFX96 Real-time System，使用iTaq Universal SYBR Green Supermix（BioRad，美國(guó)）試劑盒并按其提供的方法進(jìn)行qRT-PCR擴(kuò)增，擴(kuò)增體系 （ 25μL ）： 2× Taq PCR MasterMix12.5μL ， 模板 9.5μL ，上、下游引物各 1μL ， 。反應(yīng)程序： 95^°C 預(yù)變性 30s;95°C 變性5s， 60^°C 退火30s，40個(gè)循環(huán)。用 2^-ΔΔCt 方法進(jìn)行相對(duì)定量分析[27] O

2 結(jié)果與分析

2.1 海島棉 R2R3-MYB 基因家族的鑒定

通過TBtools的SimpleHMMSearch功能篩選海島棉全基因組中的MYB家族基因，然后通過NCBI網(wǎng)站中的CDD結(jié)構(gòu)域篩選，最終確定了98個(gè)海島棉R2R3-MYB家族基因（表2）。這些基因的編碼蛋白氨基酸數(shù)目在 147～496 aa 之間，相對(duì)分子質(zhì)量在 之間，理論等電點(diǎn)（pI）在 5.12～9.28 之間，不穩(wěn)定系數(shù)在37.33～77.44 之間，脂肪族氨基酸指數(shù)在 50.04～ 83.93之間，所有成員的親疏水性平均系數(shù)均小于0，為親水性蛋白，

98個(gè)GbMYB基因分布在海島棉的25條染色體上（A01、A03—A13、D01—D13），其中 A亞組中含有47個(gè)基因，D亞組中含有51個(gè)基因。在A02染色體上不存在R2R3-MYB家族基因，而在D02 染色體上存在一個(gè)基因；A03和 A04號(hào)染色體上分別存在2個(gè)基因，而D03和D04號(hào)染色體上各只有1個(gè)基因；D05染色體上含有5個(gè)基因，而A05號(hào)染色體上只有3個(gè)基因；D09號(hào)染色體上含有2個(gè)基因，而A09號(hào)染色體上只有1個(gè)基因；D亞組上有兩個(gè)基因GbMYB-97和Gb-MYB-98在 super-scaffold_610_D13上，在A亞組上則不存在這樣的基因。這些說明海島棉 R2R3- MYB基因家族在進(jìn)化過程中可能發(fā)生了基因的丟失與復(fù)制，但是從整體上來看A亞組基因和D亞組基因之間仍然存在著很強(qiáng)的對(duì)應(yīng)關(guān)系，這也與棉花的進(jìn)化關(guān)系相符合，

2.2 海島棉R2R3-MYB家族基因的進(jìn)化分析

為了更好地理解海島棉R2R3-MYB家族基因的進(jìn)化關(guān)系，基于海島棉的98個(gè)、擬南芥的50個(gè)和水稻的44個(gè)R2R3-MYB蛋白序列的全長(zhǎng)構(gòu)建了系統(tǒng)進(jìn)化樹。結(jié)果（圖2）顯示，海島棉R2R3-MYB家族基因可以分A、B、C三個(gè)亞組，其中A亞組中含有33個(gè)海島棉R2R3-MYB家族基因，B亞組中含有31個(gè)，C亞組中含有34個(gè)。A亞組中含有10個(gè)擬南芥和29個(gè)水稻R2R3-MYB基因；B亞組中含有29個(gè)擬南芥和13個(gè)水稻 R2R3- MYB基因；在C亞組中擬南芥和水稻R2R3基因數(shù)量最少，分別只有11個(gè)和2個(gè)

Gb：海島棉；At：擬南芥；Os：水稻。

2.3 海島棉R2R3-MYB家族基因的進(jìn)化樹、基因結(jié)構(gòu)和motif分析

根據(jù)海島棉R2R3-MYB家族基因的全長(zhǎng)、CDS和蛋白質(zhì)序列進(jìn)行進(jìn)化樹、基因結(jié)構(gòu)和motif分析。結(jié)果如圖3所示，絕大部分基因包含3個(gè)外顯子和2個(gè)內(nèi)含子，3個(gè)外顯子中第1個(gè)和第 2個(gè)外顯子較短，第3個(gè)外顯子要遠(yuǎn)長(zhǎng)于第1個(gè)和第2個(gè)外顯子。所有基因中都含有motif1、2、3、4、5、7，除GbMYB-93外都含有motif8，大部分基因含有motif6和motif9。說明這些基序在進(jìn)化過程中較為保守，同一家族可能存在功能相似性。根據(jù)進(jìn)化樹結(jié)果將海島棉R2R3-MYB家族基因分為3個(gè)亞組，A亞組中大部分基因含有motif10；B亞組中大部分基因含有多個(gè)motif9，還發(fā)現(xiàn)了一個(gè)特殊的基因GbMYB-78，其他基因中motif1、2、3、4、5、7位于基因的起始位置，而GbMYB-78中這些motif基序則位于基因的中間；C亞組中所有的基因中都含有motif6，而A亞組和B亞組的部分基因中不含有motif6。motif是蛋白質(zhì)分子中具有特定空間構(gòu)象和功能的結(jié)構(gòu)組分，是結(jié)構(gòu)域的亞單位，與基因特定的功能聯(lián)系在一起。這

3個(gè)亞組之間motif分布存在著差異，說明它們可能在進(jìn)化過程中出現(xiàn)了基因結(jié)構(gòu)和功能的變化。

2.4 海島棉R2R3-MYB家族基因啟動(dòng)子順式作用元件分析

通過PlantCARE數(shù)據(jù)庫(kù)分析了海島棉R2R3-MYB家族基因上游 2000bp 的啟動(dòng)子區(qū)。如圖4所示，在海島棉R2R3-MYB家族基因啟動(dòng)子中發(fā)現(xiàn)了數(shù)量眾多的與植物激素反應(yīng)和生物脅迫相關(guān)的順式作用元件，主要包括參與類黃酮生物合成調(diào)控的順式作用元件以及參與MeJA、水楊酸、防御和應(yīng)激反應(yīng)的順式作用元件。其中65個(gè) R2R3-MYB 基因啟動(dòng)子含有參與SA反應(yīng)的順式作用元件，47個(gè)基因含有參與MeJA反應(yīng)的順式作用元件，5個(gè)基因含有參與類黃酮反應(yīng)的順式作用元件，38個(gè)基因含有參與應(yīng)激與防御反應(yīng)的順式作用元件，32個(gè)基因同時(shí)含有參與SA和MeJA反應(yīng)的順式作用元件。這些順式作用元件都與抗病密切相關(guān)，說明海島棉 R2R3-MYB 基因家族中可能存在許多抗病相關(guān)基因，其中GbMYB-85基因同時(shí)存在上述4個(gè)抗病相關(guān)的順勢(shì)作用元件，表明其可能在棉花抗病過程中發(fā)揮著重要作用。而且不同基因啟動(dòng)子中順式作用元件的種類和數(shù)量不同，表明它們可能通過不同的信號(hào)通路在生物脅迫反應(yīng)中發(fā)揮作用。

2.5 海島棉R2R3-MYB家族基因在黃萎病脅迫下的表達(dá)模式分析

為了明確海島棉R2R3-MYB家族基因在黃萎病脅迫處理下的表達(dá)模式，利用轉(zhuǎn)錄組測(cè)序數(shù)據(jù)對(duì)接種大麗輪枝菌后不同時(shí)間的棉花根部R2R3-MYB家族基因的表達(dá)模式進(jìn)行分析。結(jié)果（圖5）表明，大部分基因在黃萎病脅迫后表達(dá)量升高，其中，11個(gè)基因 Φ_GbMYB-OI，O2，O3，2O， （2026、27、33、48、50、74 和 79）在脅迫后 6h 表達(dá)量量急劇上升，隨后逐漸下降；14個(gè)基因（GbMYB-05、13、14、15、39、40、42、43、51、53、84、89、91 和92）在脅迫后 12h 表達(dá)量快速上升，隨后逐漸降低； GbMYB-37 在脅迫后 24h 表達(dá)量大幅上升，隨后開始下降；4個(gè)基因 （GbMYB-52，55，81 和85）在脅迫后 ^72h 表達(dá)量才開始上升；另外還有11個(gè)基因 （GbMYB-O8，22，30，3I，36，4I，46，70， （2080、81和90）在 0h 時(shí)處于高表達(dá)，在黃萎病脅迫后表達(dá)水平開始急劇下降。表明海島棉R2R3-

MYB家族基因在黃萎病脅迫后的表達(dá)量變化存在著差異，這些基因可能在海島棉響應(yīng)黃萎病脅迫中起重要作用

2.6 候選基因在黃萎病脅迫以及SA和MeJA誘導(dǎo)下的表達(dá)模式分析

結(jié)合海島棉R2R3-MYB家族基因在黃萎病脅迫處理下的表達(dá)模式及基因順式作用元件分析結(jié)果，篩選出5個(gè)在黃萎病脅迫后差異表達(dá)且啟動(dòng)子區(qū)含有參與SA和MeJA反應(yīng)順式作用元件的基因，分別為 GbMYB-2I，34，39，76，83 。qRT-PCR分析發(fā)現(xiàn)，黃萎病脅迫后各候選基因都被誘導(dǎo)表達(dá)，其中GbMYB-21和GbMYB-34在脅迫后^48h 表達(dá)量最高， GbMYB-2I 表達(dá)量達(dá) 0h 時(shí)的16.8倍; GbMYB-39 和 GbMYB-76 在黃萎病脅迫后 12h 表達(dá)量達(dá)到最高；而GbMYB-83被誘導(dǎo)表達(dá)的速度最快，在脅迫后 6h 表達(dá)量就達(dá)到頂峰（圖6）。

外源SA噴施后5個(gè)候選基因表達(dá)量均上升，其中 GbMYB-34，GbMYB-76 和GbMYB-83均在誘導(dǎo)后 6h 達(dá)到頂峰，GbMYB-34表達(dá)量達(dá)到0h 時(shí)的7.2倍； GbMYB-2I 響應(yīng)較為遲緩，在SA誘導(dǎo)后 12h 表達(dá)量水平才達(dá)到頂峰；而GbMYB-39能夠迅速響應(yīng)SA的誘導(dǎo)，在誘導(dǎo)后 ¹h 表達(dá)量急劇上升并達(dá)到頂峰（圖7）。

外源噴施MeJA后5個(gè)候選基因也被誘導(dǎo)，表達(dá)量顯著上升。其中 均在誘導(dǎo)后 24h 表達(dá)量達(dá)到頂峰，GbMYB-21表達(dá)量增幅較大，達(dá)到了 ^0h 時(shí)的14.9倍，相較于SA誘導(dǎo)， GbMYB-76 響應(yīng)MeJA誘導(dǎo)的速度更為緩慢； GbMYB-34 和 GbMYB-83 均在誘導(dǎo)后 ³h 表達(dá)量達(dá)到頂峰，與SA誘導(dǎo)相比，它們對(duì)MeJA誘導(dǎo)的響應(yīng)速度更快。 GbMYB-34 在MeJA誘導(dǎo)³h 后表達(dá)量就急劇上升達(dá)到頂峰，同SA誘導(dǎo)類似，GbMYB-39是5個(gè)基因中最快響應(yīng)MeJA誘導(dǎo)表達(dá)的基因（圖8）。

3討論與結(jié)論

本研究從海島棉中鑒定到98個(gè)R2R3-MYB家族基因，分布在25條染色體上，A亞組和D亞組上的基因數(shù)量基本一致，但部分染色體上的基因數(shù)量存在差異，這表明海島棉R2R3-MYB家族基因與進(jìn)化關(guān)系相符合，但在進(jìn)化過程中仍發(fā)生了基因的丟失與復(fù)制。將海島棉、擬南芥以及水稻R2R3-MYB基因家族構(gòu)建進(jìn)化樹，可以將98個(gè)海島棉R2R3-MYB家族基因分為三個(gè)亞組，各亞組中基因數(shù)量相近，但A亞組中水稻R2R3-MYB家族基因的數(shù)量是B亞組的近3倍，是C亞組的近15倍，而B亞組中的擬南芥R2R3-MYB家族基因數(shù)量分別是A亞組和C亞組的近3倍

SA、MeJA和乙烯（ET）被認(rèn)為是參與調(diào)節(jié)植物對(duì)病原菌防御反應(yīng)的三種主要的植物激素。擬南芥轉(zhuǎn)錄因子AtWRKY75通過激活SA抗病途徑提高擬南芥對(duì)核盤菌的抗性[28]；過表達(dá)煙草轉(zhuǎn)錄因子NtWRKY50能夠使煙草中SA含量迅速增加，激活下游PR基因的表達(dá)，從而使煙草能夠抵御青枯病菌的入侵[29]，茉莉酸（JA）能夠在維管束和空氣中進(jìn)行遠(yuǎn)距離運(yùn)輸，將病原體入侵信號(hào)從感染部位傳遞到整個(gè)植株，使植株產(chǎn)生系統(tǒng)性抗性，還能夠在病原體入侵后誘導(dǎo)植物大量合成木質(zhì)素、類黃酮和萜類等物質(zhì)，提高植株的抗病性。植物體內(nèi)JA含量上升后還能夠加速植物表皮毛的生長(zhǎng)及次生壁的加厚，導(dǎo)致病原體難以入侵和定植[30-32]。本研究從海島棉R2R3-MYB家族基因的啟動(dòng)子區(qū)鑒定到65個(gè)基因中含有參與SA反應(yīng)的順式作用元件，47個(gè)基因中含有參與MeJA反應(yīng)的順式作用元件，32個(gè)基因同時(shí)含有參與SA反應(yīng)和MeJA反應(yīng)的順式作用元件。這些基因可能通過SA和MeJA的誘導(dǎo)激活表達(dá)來參與海島棉對(duì)黃萎病的抗性。

R2R3-MYB轉(zhuǎn)錄因子在植物中的作用多種多樣，其中許多因子與植物抗病性密切相關(guān)。例如，在棉花和擬南芥中過表達(dá)陸地棉R2R3-MYB家族基因GhMYB36能夠提高棉花和擬南芥對(duì)黃萎病的抗性，將GhMYB36沉默后棉花對(duì)黃萎病抗性顯著降低，且GhMYB36能與病程相關(guān)蛋白基因PRI的啟動(dòng)子結(jié)合，通過激活PR1的表達(dá)來提高棉花對(duì)黃萎病的抗性[33]。在葡萄中，VqMYB14和 VqMYB15 轉(zhuǎn)錄因子可增強(qiáng)苯丙氨酸代謝途徑上游基因PAL及STSs的表達(dá)，提高具有抗菌功能的5類黃芪類物質(zhì)的含量，進(jìn)而提高葡萄對(duì)白粉病的抗性。在葡萄和擬南芥中過表達(dá)VqMYB15基因，可正向調(diào)控SA途徑中抗病基因的表達(dá)，提高葡萄和擬南芥中活性氧的含量，誘導(dǎo)植物細(xì)胞產(chǎn)生超敏反應(yīng)，增加胼抵質(zhì)的含量，激活JA/ET途徑相關(guān)基因的表達(dá)，從而提高葡萄和擬南芥對(duì)白粉病的抗性[34]。GhMYB4 是棉花中一個(gè)負(fù)調(diào)控木質(zhì)素合成的R2R3-MYB轉(zhuǎn)錄因子，研究發(fā)現(xiàn)

GhMYB4抑制棉花中木質(zhì)素的積累但增強(qiáng)棉花抗病性，進(jìn)一步的研究表明，GhMYB4通過降低棉花次生壁中木質(zhì)素含量破壞細(xì)胞壁完整性，導(dǎo)致細(xì)胞壁發(fā)生破裂，從而釋放更多的損傷相關(guān)的分子模式（damage associated molecular pattern，DAMP）分子，激活JA生物合成及信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑及下游防御基因的表達(dá)，提高棉花對(duì)黃萎病的抗性[35]。本研究通過對(duì)海7124接種黃萎病病菌（大麗輪枝菌V991）后不同時(shí)間點(diǎn)根部組織的轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)分析和海島棉R2R3-MYB家族基因順式作用元件分析，從海島棉中篩選出5個(gè)黃萎病抗性候選基因，分別為 GbMYB-2I，GbMYB-34，GbMYB-39，Gb- （204號(hào)MYB-76和GbMYB-83。表達(dá)模式分析結(jié)果表明，5個(gè)候選基因均能響應(yīng)黃萎病脅迫及SA和

MeJA的誘導(dǎo)，表達(dá)量也顯著上升，表明這些基因 可能被SA和MeJA誘導(dǎo)激活表達(dá)，進(jìn)而激活下游 防御基因的表達(dá)，從而增強(qiáng)海島棉對(duì)黃萎病的抗 性。

綜上，本研究在海島棉中鑒定到98個(gè)R2R3-MYB家族基因，進(jìn)化分析顯示可分為3個(gè)亞組?；蚪Y(jié)構(gòu)分析表明絕大部分基因都包含3個(gè)外顯子和2個(gè)內(nèi)含子。啟動(dòng)子分析發(fā)現(xiàn)這些基因含有較多與抗病相關(guān)的順式作用元件。通過黃萎病脅迫及SA和MeJA誘導(dǎo)表達(dá)篩選到5個(gè)黃萎病抗性候選基因（GbMYB-21、GbMYB-34、GbMYB-39、GbMYB-76和GbMYB-83）。本研究結(jié)果可為進(jìn)一步研究 R2R3-MYB 基因在海島棉抗病中的作用及分子機(jī)制奠定基礎(chǔ)。

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