不同沖泡條件對(duì)鳳慶大葉種茶樹(shù)花水提物清除DPPH能力的影響

Abstract： Using YunnanFengqing large leaf tea flowers as theraw materials and DPPH freeradical scavenging rate as the evaluation index，tea flowers were brewed according to diferent methods to studythe efectofdiferent brewing conditions on DPPH free radical scavenging ability of tea flowers.The optimal brewing conditions for tea flowers were obtained as follows： brewing time of 4 minutes， water temperature of 80^°C ，and solid-liquid ratio of 1：50 .Under these brewing conditions，the antioxidant activity of tea flowers reached its highest level. Keywords： tea flowers， tea antioxidant， brewing process， single factor，response surface method

茶樹(shù)是我國(guó)重要的經(jīng)濟(jì)作物之一，具有“結(jié)實(shí)少、開(kāi)花多、花期長(zhǎng)、壽命短”的特點(diǎn)[12]，茶樹(shù)花有“安全植物的胎盤(pán)”“茶樹(shù)上的精華”的美譽(yù)。中國(guó)是世界茶園面積最大的國(guó)家，蘊(yùn)含豐富的茶樹(shù)花資源[45]。隨著人們對(duì)健康生活方式的追求日益增長(zhǎng)，茶樹(shù)花這種富含多種有益成分的新型食品正逐漸走進(jìn)消費(fèi)者的視野。近年來(lái)的研究發(fā)現(xiàn)，茶樹(shù)花富含黃酮、茶多糖、蛋白質(zhì)和氨基酸等理化成分，這些成分具有減緩皮膚衰老、增強(qiáng)免疫力、防癌抗癌、降血糖及解毒等功效[6-8]。此外由于茶樹(shù)花粉中較低的脂肪和較高的氨基酸、蛋白質(zhì)、維生素B2含量，也被視作一種高效的蛋白質(zhì)營(yíng)養(yǎng)源[9-]。2013年，茶樹(shù)花已被收錄進(jìn)新資源食品目錄[12]。無(wú)論是作為日常飲品還是保健品，茶樹(shù)花都展現(xiàn)出了廣闊的應(yīng)用前景。同時(shí)，隨著與自由基相關(guān)的科學(xué)研究進(jìn)一步深人，發(fā)現(xiàn)如神經(jīng)疾病、免疫紊亂、心血管疾病等醫(yī)學(xué)病癥都與自由基導(dǎo)致的細(xì)胞損傷有一定的關(guān)系，因而抗氧化活性劑產(chǎn)品的開(kāi)發(fā)利用已成為當(dāng)下人們關(guān)注的熱點(diǎn)。

本研究以鳳慶大葉種茶樹(shù)花為研究對(duì)象，采用單因素試驗(yàn)方法，系統(tǒng)考察沖泡時(shí)間、沖泡溫度、料液比、沖泡水質(zhì)及沖泡泡次等關(guān)鍵參數(shù)對(duì)茶樹(shù)花水提物DPPH自由基清除能力的影響。通過(guò)DPPH自由基清除試驗(yàn)定量評(píng)價(jià)茶樹(shù)花的抗氧化活性，旨在為茶樹(shù)花的科學(xué)利用和合理沖泡提供理論依據(jù)。本研究不僅揭示了茶樹(shù)花中活性成分的提取規(guī)律，為其營(yíng)養(yǎng)價(jià)值和健康功效的充分釋放提供了工藝保障，同時(shí)也為茶樹(shù)花資源的深度開(kāi)發(fā)和產(chǎn)業(yè)化應(yīng)用奠定了科學(xué)基礎(chǔ)。研究結(jié)果對(duì)指導(dǎo)消費(fèi)者科學(xué)飲用茶樹(shù)花、提升茶樹(shù)花產(chǎn)品附加值，以及促進(jìn)茶產(chǎn)業(yè)資源綜合利用具有重要的實(shí)踐意義。

1材料與方法

1.1試驗(yàn)材料

茶樹(shù)花采摘于云南省鳳慶縣的鳳慶大葉種茶樹(shù)，采摘時(shí)間為2023年11月，采摘標(biāo)準(zhǔn)為花朵含苞待放（濕度 65%～70% ）。將采下的鮮花置于室外 （溫度 26～28^°C ）進(jìn)行攤放，自然晾干5d后保存?zhèn)溆?，茶?shù)花干茶含水率控制在 10% 左右。

1.2主要試劑

1，1－二苯基-2-苦基胖 （DPPH），購(gòu)自國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司；無(wú)水乙醇，購(gòu)自天津市致遠(yuǎn)化學(xué)試劑有限公司；純凈水和礦泉水，購(gòu)自杭州娃哈哈集團(tuán)有限公司；超純水，購(gòu)自述陽(yáng)希之夢(mèng)有限公司；自來(lái)水，實(shí)驗(yàn)室常規(guī)自來(lái)水。

1.3主要儀器

電子分析天平，購(gòu)自梅特勒-托利多公司；電熱恒溫水浴鍋，購(gòu)自上海新諾儀器集團(tuán)有限公司；紫外可見(jiàn)分光光度計(jì)，購(gòu)自山東藍(lán)景電子科技有限公司。

1.4單因素試驗(yàn)設(shè)計(jì)

以制備好的茶樹(shù)花為樣品，將沖泡時(shí)間、沖泡溫度、沖泡水質(zhì)、料液比、泡次作為試驗(yàn)因子，分析不同沖泡條件對(duì)茶樹(shù)花水提物清除DPPH自由基能力的影響。

1.4.1沖泡溫度試驗(yàn)

精確稱(chēng)取茶樹(shù)花樣品 1.0g ，取純凈水 50mL 沖泡，設(shè)置沖泡溫度為60、70、80、90、 100^°C 沖泡時(shí)間 4min ，取茶樹(shù)花水提物，分析不同沖泡溫度所制茶樹(shù)花水提物清除DPPH自由基能力的差異。

1.4.2沖泡時(shí)間試驗(yàn)

精確稱(chēng)取茶樹(shù)花樣品 1.0g ，取純凈水 50mL 沖泡，設(shè)置沖泡時(shí)間為2、4、6、8、 10min ，沖泡溫度為 80^°C ，取茶樹(shù)花水提物，分析不同沖泡時(shí)間所制茶樹(shù)花水提物清除DPPH自由基能力的差異。

1.4.3料液比試驗(yàn)

精確稱(chēng)取茶樹(shù)花 1.0g ，料液比依次設(shè)置為1：40、 1：50 、 1：60 、 1：80 、 1：100 ，沖泡溫度80^°C ，沖泡時(shí)間 4min ，取茶樹(shù)花水提物，分析不同料液比提取的茶樹(shù)花水提物清除DPPH自由基能力的差異。

1.4.4沖泡水質(zhì)試驗(yàn)

精確稱(chēng)取茶樹(shù)花樣品 1.0g ，分別選用純凈水、超純水、礦泉水、自來(lái)水各 50mL 沖泡，沖泡時(shí)間 4min ，沖泡溫度 80^°C ，取茶樹(shù)花水提物，分析不同水質(zhì)提取的茶樹(shù)花水提物清除DPPH自由基能力的差異。

1.4.5泡次試驗(yàn)

精確稱(chēng)取茶樹(shù)花樣品 1.0g ，取純凈水 50mL 沖泡，泡次依次設(shè)置為1、2、3、4、5、6次，沖泡時(shí)間 4min ，沖泡溫度 80^°C ，取茶樹(shù)花水提物，分析不同泡次提取的茶樹(shù)花水提物清除DPPH自由基能力的差異。

1.5清除DPPH自由基能力的測(cè)定

DPPH在 517nm 波長(zhǎng)處具有特征性強(qiáng)吸收峰。當(dāng)待測(cè)物質(zhì)與DPPH自由基反應(yīng)時(shí)，其吸光度降低程度與抗氧化活性呈正相關(guān)，通過(guò)檢測(cè)吸光度可定量評(píng)價(jià)樣品的自由基清除能力[13]。

具體檢測(cè)方法為：精確稱(chēng)取DPPH固體粉末，用無(wú)水乙醇配制成 2×10^-4mol/L 的溶液，避光保存（ 4^°C 備用）；取 2mL 茶樹(shù)花水提物與 2mL DPPH溶液混合，渦旋振蕩 10s ，避光靜置反應(yīng) 30min ，于 517nm 波長(zhǎng)處測(cè)定吸光度 （A_i） ；取 2mL DPPH溶液與 2mL 無(wú)水乙醇混合，同法處理并測(cè)定吸光度 （A_c） ；取 2mL 茶樹(shù)花水提物與 2mL 無(wú)水乙醇混合，同法處理并測(cè)定吸光度 （A_j） ，消除樣品自身吸光干擾。DPPH自由基清除率計(jì)算公式如下，通過(guò)3次平行試驗(yàn)，最后取得的均值為樣品的DPPH自由基清除率。

DPPH自由基清除率 /0≠[1-（A_i-A_j）/A_c]×100

1.6響應(yīng)面分析試驗(yàn)

利用軟件Design-Expert12，再根據(jù)單因素試驗(yàn)的結(jié)果用Box-Benhnken設(shè)計(jì)響應(yīng)面試驗(yàn)，在其他沖泡條件不變的前提下，根據(jù)中心組合設(shè)計(jì)原理，選取茶樹(shù)花沖泡中較為重要的沖泡時(shí)間（A）、沖泡溫度（B）、料液比（C）作為自變量，茶樹(shù)花水提物DPPH自由基清除率為響應(yīng)值，進(jìn)行響應(yīng)面分析，試驗(yàn)設(shè)計(jì)見(jiàn)表1。

1.7茶樹(shù)花感官審評(píng)

茶樹(shù)花感官審評(píng)參考《茶葉感官審評(píng)方法》（GB/T23776—2018）[4并結(jié)合生產(chǎn)實(shí)際中茶樹(shù)花評(píng)價(jià)標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行，各項(xiàng)審評(píng)因子評(píng)分占比為：外形20% 、香氣 30% 、湯色 5% 、滋味 35% 、葉底10% 。由富有審評(píng)經(jīng)驗(yàn)的5人組成審評(píng)專(zhuān)家組，進(jìn)行感官審評(píng)，以加權(quán)方式計(jì)算總分。

1.8數(shù)據(jù)處理

通過(guò)Origin2021軟件進(jìn)行繪圖并統(tǒng)計(jì)分析，利用Design-Expert12軟件中的Box-Benhnken單因素試驗(yàn)設(shè)計(jì)對(duì)響應(yīng)面試驗(yàn)結(jié)果進(jìn)行優(yōu)化。采用方差分析對(duì)差異顯著性進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。

2結(jié)果與分析

2.1茶樹(shù)花水提物清除DPPH自由基能力及感官品質(zhì)評(píng)價(jià)分析

2.1.1不同沖泡水溫對(duì)茶樹(shù)花水提物清除DPPH自由基能力及感官品質(zhì)的影響

如表2所示，茶樹(shù)花水提物對(duì)DPPH自由基的清除能力隨沖泡水溫升高呈先上升后下降的趨勢(shì)。在 80^°C 時(shí)清除率達(dá)到峰值（ 84.1% ），表明該溫度下茶樹(shù)花中抗氧化成分的溶出效率最佳。當(dāng)水溫低于 70^°C 時(shí)，可能因熱能不足導(dǎo)致多酚類(lèi)、黃酮等活性物質(zhì)溶出率較低，自由基清除能力較弱（ 60^°C 時(shí)為 74.6% ）；當(dāng)水溫超過(guò) 80^°C 后，清除率明顯下降（ 90^°C 時(shí)為 76.2% ），推測(cè)原因可能是高溫加速茶樹(shù)花組織熟化，導(dǎo)致細(xì)胞結(jié)構(gòu)致密化，阻礙了有效成分的進(jìn)一步釋放。

結(jié)合感官審評(píng)結(jié)果，為避免高溫導(dǎo)致的成分劣化及風(fēng)味損失，最終選擇70、80、 個(gè)梯度進(jìn)行響應(yīng)面優(yōu)化分析。

基于上述結(jié)論，后續(xù)試驗(yàn)將標(biāo)準(zhǔn)沖泡水溫設(shè)定為 80^°C ，以平衡活性成分溶出效率與感官品質(zhì)。

2.1.2不同沖泡時(shí)間對(duì)茶樹(shù)花水提物清除DPPH自由基能力及感官品質(zhì)的影響

如表3所示，茶樹(shù)花水提物對(duì)DPPH自由基的清除能力隨沖泡時(shí)間延長(zhǎng)呈現(xiàn)先升高后降低的趨勢(shì)。在 4min 時(shí)清除率達(dá)到峰值（ 83.1% ，表明該時(shí)間段內(nèi)茶樹(shù)花中抗氧化成分的溶出達(dá)到最佳平衡。沖泡時(shí)間在 2～4min 范圍內(nèi)，隨著時(shí)間延長(zhǎng)，多酚類(lèi)、黃酮等抗氧化物質(zhì)溶出量逐漸增加，自由基清除能力持續(xù)提升；而當(dāng)時(shí)間超過(guò) 4min 后，清除率明顯下降（ 6min 時(shí)為 73.5% ），推測(cè)原因可能是長(zhǎng)時(shí)間暴露導(dǎo)致部分抗氧化成分被氧化降解或揮發(fā)性活性物質(zhì)隨蒸汽逸散。值得注意的是，在 8min 時(shí)清除率出現(xiàn)短暫回升（ 75.2% ，可能與高溫條件下某些熱穩(wěn)定性較高的抗氧化成分開(kāi)始溶出有關(guān)。

結(jié)合感官審評(píng)結(jié)果，為平衡活性成分溶出效率與感官品質(zhì)，最終選擇2、4、 6min3 個(gè)沖泡時(shí)間進(jìn)行響應(yīng)面優(yōu)化分析。

基于上述結(jié)論，后續(xù)試驗(yàn)將標(biāo)準(zhǔn)沖泡時(shí)間設(shè)定為 4min 。

2.1.3不同料液比對(duì)茶樹(shù)花水提物清除DPPH自由基能力及感官品質(zhì)的影響

如表4所示，茶樹(shù)花水提物對(duì)DPPH自由基的清除能力隨料液比增加呈現(xiàn)先升高后降低的趨勢(shì)，在 1：50 時(shí)清除率達(dá)到峰值（ 84.9% ）。當(dāng)料液比低于 1：50 時(shí)，溶劑體積不足導(dǎo)致茶樹(shù)花浸潤(rùn)不充分，物質(zhì)擴(kuò)散受限，有效成分溶出不充分，清除率較低（ 1：40 時(shí)為 82.8% ；而當(dāng)料液比高于1：50后，因單位體積中活性成分濃度被稀釋?zhuān)瑫r(shí)可能因延長(zhǎng)加熱時(shí)間導(dǎo)致部分熱敏性成分降解，致使清除率明顯下降（ 1：60 時(shí)為 82.3% ）。

結(jié)合感官審評(píng)結(jié)果，為平衡活性成分溶出效率、提取物濃度和感官品質(zhì)，最終選擇 1：60 /1：50 、 1：40 這3個(gè)梯度進(jìn)行響應(yīng)面優(yōu)化分析，并將標(biāo)準(zhǔn)料液比設(shè)定為 1：50 。

2.1.4不同水質(zhì)對(duì)茶樹(shù)花水提物清除DPPH自由基能力及感官品質(zhì)的影響

如表5所示，純凈水和超純水制備的茶樹(shù)花水提物表現(xiàn)出較高的DPPH自由基清除率。相比之下，礦泉水中豐富的微量元素及無(wú)機(jī)鹽、自來(lái)水中可能存在的氯離子及其他礦物質(zhì)成分，可能與茶樹(shù)花中的水溶性物質(zhì)發(fā)生相互作用，從而降低了其自由基清除能力。感官評(píng)價(jià)結(jié)果顯示，純凈水沖泡的樣品在湯色、香氣、滋味表現(xiàn)上優(yōu)于自來(lái)水和礦泉水，僅在滋味、湯色方面略遜于超純水。同時(shí)，純凈水制備的水提物自由基清除率與超純水接近?？紤]到純凈水在日常生活中的易得性和實(shí)用性，最終確定純凈水為茶樹(shù)花沖泡的最佳水質(zhì)選擇。

2.1.5不同泡次對(duì)茶樹(shù)花水提物清除DPPH自由基能力及感官品質(zhì)的影響

如表6所示，茶樹(shù)花水提物的DPPH自由基清除能力隨泡次增加呈現(xiàn)明顯下降趨勢(shì)。首次沖泡樣品表現(xiàn)出最高的抗氧化活性，這主要?dú)w因于茶樹(shù)花中活性成分（如多酚類(lèi)、黃酮類(lèi)物質(zhì)）的初始高浸出率。后續(xù)沖泡過(guò)程中，由于可溶性物質(zhì)在前幾次沖泡中已大量溶出，第2至第6次水提物的自由基清除能力呈現(xiàn)階梯式下降。感官評(píng)價(jià)結(jié)果與此趨勢(shì)一致：隨著泡次增加，水提物的香氣強(qiáng)度和滋味飽滿(mǎn)度明顯降低，至第5、第6次沖泡時(shí)已接近無(wú)味?；诨钚猿煞秩艹鲂屎透泄倨焚|(zhì)的綜合考量，建議最佳泡次為第1～3次，其中首次沖泡的水提物在抗氧化活性和風(fēng)味品質(zhì)上均表現(xiàn)最優(yōu)。

2.2響應(yīng)面分析及驗(yàn)證

2.2.1響應(yīng)面試驗(yàn)結(jié)果與分析

綜合以上試驗(yàn)結(jié)果，選取茶樹(shù)花沖泡中較為重要的沖泡溫度（A）、沖泡時(shí)間（B）、料液比（C）作為自變量，水提物DPPH自由基清除率為響應(yīng)值，進(jìn)行響應(yīng)面分析，通過(guò)Box-Behnken原理，設(shè)計(jì)17個(gè)試驗(yàn)點(diǎn)。DPPH自由基清除率檢測(cè)結(jié)果如表7所示，基于此進(jìn)一步進(jìn)行了方差分析（表8）。

從表8可以看出，二次項(xiàng) A² 、 C² 和交互項(xiàng)BC對(duì)響應(yīng)面的結(jié)果影響顯著（ ?Plt;0.05? ，由此可以證明本試驗(yàn)選用的二次模型顯著，其他項(xiàng)的影響不顯著。通過(guò)Design-Expert12軟件，得到回歸方程為：茶樹(shù)花DPPH自由基清除率 1.50B+0.88C+3.25AB-1.50AC-5.25BC-7.30A2-0.55B²-6.80C² ○

2.2.2響應(yīng)面優(yōu)化和驗(yàn)證

依據(jù)回歸方程得出沖泡時(shí)間、沖泡溫度和料液比三因素構(gòu)成的3D響應(yīng)面圖和等高線圖。響應(yīng)曲面和等高線圖能客觀且直接地反映出在兩因素作用下，其對(duì)響應(yīng)值的影響程度，3D響應(yīng)面的曲面越陡，等高線越密集，說(shuō)明兩因素的交互作用越強(qiáng)[15-16]

通過(guò)對(duì)響應(yīng)面分析圖的綜合解析可以看出，不同因素及其交互作用對(duì)水提物DPPH自由基清除率的影響存在顯著差異。圖1顯示，響應(yīng)面區(qū)域等高線密集呈橢圓形分布，表明溫度與時(shí)間的交互作用對(duì)清除率具有顯著影響（ ?Plt;0.05 。從圖2看出，交互作用曲面陡峭，對(duì)應(yīng)的等高線疏密不均勻且呈橢圓形，說(shuō)明在沖泡時(shí)間和料液比之間的交互作用下，對(duì)自由基的清除率具有顯著影響。圖3則揭示了料液比與溫度的雙因素效應(yīng)，即隨著料液比和溫度的不斷增加，DPPH自由基清除率響應(yīng)值達(dá)到高峰后，開(kāi)始出現(xiàn)不同程度的下降。此時(shí)等高線呈現(xiàn)較密集，說(shuō)明在料液比和溫度的交互作用下，水提物的DPPH自由基清除率的影響顯著。這種差異化的響應(yīng)特征為后續(xù)工藝參數(shù)的優(yōu)化提供了明確的方向，即應(yīng)優(yōu)先調(diào)控溫度和時(shí)間因素以獲得最佳抗氧化活性。

綜合響應(yīng)面優(yōu)化結(jié)果可得，茶樹(shù)花的最佳沖泡條件為：時(shí)間 4.7min 、溫度 80^°C 、料液化1：46。考慮到感官品質(zhì)和實(shí)際操作便利性，實(shí)際調(diào)整為時(shí)間 4min 、溫度 80^°C 、料液化 1：50 。

3小結(jié)與討論

茶樹(shù)花是茶樹(shù)的副產(chǎn)品，長(zhǎng)期以來(lái)其利用價(jià)值未得到充分開(kāi)發(fā)。近年來(lái)，隨著科學(xué)技術(shù)的進(jìn)步，茶樹(shù)花中多種活性成分的功能特性逐漸被揭示，并在食品、保健品等領(lǐng)域展現(xiàn)出廣闊的應(yīng)用前景，為茶樹(shù)花的綜合利用提供了科學(xué)依據(jù)[17-20]。本研究以DPPH自由基清除能力為評(píng)價(jià)指標(biāo)，通過(guò)單因素試驗(yàn)和響應(yīng)面優(yōu)化試驗(yàn)優(yōu)化茶樹(shù)花沖泡工藝。結(jié)果表明，最佳沖泡條件為：時(shí)間 4min 、溫度80^°C 、料液比 1：50 ，在此條件下，茶樹(shù)花的抗氧化活性達(dá)到最高。

茶樹(shù)作為重要的經(jīng)濟(jì)作物，其花朵的開(kāi)發(fā)利用仍存在諸多挑戰(zhàn)，如茶農(nóng)重視不足、采收標(biāo)準(zhǔn)不統(tǒng)一、加工技術(shù)及沖泡規(guī)范缺失等，導(dǎo)致茶樹(shù)花利用率較低。未來(lái)，茶樹(shù)花的應(yīng)用可拓展至多個(gè)方面，例如將茶樹(shù)花與茶葉以不同的配比制成紅碎茶，拼配制作成為不同的花茶類(lèi)產(chǎn)品，作為新式茶飲添加物或開(kāi)發(fā)成菌類(lèi)茶[2]。茶樹(shù)花的深度開(kāi)發(fā)與高值化利用，仍是未來(lái)研究的重要方向，亟需建立標(biāo)準(zhǔn)化生產(chǎn)體系，以推動(dòng)其產(chǎn)業(yè)化發(fā)展。

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