香稻種質(zhì)資源的分子鑒定和應(yīng)用

關(guān)鍵詞香稻；香味基因；等位變異；單倍型中圖分類(lèi)號(hào)S511文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼A文章編號(hào) 0517-6611（2025）13-0075-05doi：10.3969/j.issn.0517-6611.2025.13.015開(kāi)放科學(xué)（資源服務(wù)）標(biāo)識(shí)碼（OSID）：

Molecular Identification and Utilization of Aromatic Rice Germplasm Resources

[OU Gui-lin，WANG Zhi-yan，LIN Hui-hui et al （HefeiFengle Seed Co.，Ltd.，Hefei，Anhui）

AbstractOectie]Indertofectivelygudetesientifcandatioalselectioofromaticicebeedingparentsinolelarding ofhighqualityoaticcpovebdgfcydprovdeevidecefosunghaiospenlotofd andthecntentofaromacomponents.Method」6aromaticicegeplasmresouesatomeandabroadwerecolcted.4functioalarkers corespondingthemainunctioaaplotypsofbdh2wereusedtoidentifyevarationtyesoftesearomaticicematealsandautromavarietydg.sullottdinicddeitialtl counting for 80.36% . Using these 4 functional markers，a sum of 91.07% of the aromatic rice germplasm resources could be accurately identified，andthereagatealsylongtootreportedeallcraontysofd，ootainwoagsGeplasm resourceswihdE7rbd-Eaplotandcorrspoingfunctioalakersouldeeielyappedtoefragranrieti bredingandsedpuritydetecting.Conlusion]Theresultsprovidedasientificbasisforthegeneticdiversityanalysisofromaticege plasm resources and the breeding of high-quality aromatic rice varieties.

Key wordsAromatic rice;Flavor gene;Allelic variation;Haplotype

隨著經(jīng)濟(jì)日益發(fā)展和生活水平不斷提高，人們對(duì)稻米的需求已從“吃飽”向“吃好”和\"吃得安全健康\"轉(zhuǎn)變[1-2]。香味是高品質(zhì)稻米的重要特性，具有優(yōu)良香味的稻米不僅食用價(jià)值高，還具有更高的經(jīng)濟(jì)價(jià)值[3-7]。因此，培育和生產(chǎn)推廣香型水稻品種不僅是產(chǎn)業(yè)發(fā)展和市場(chǎng)需求的方向，也是落實(shí)我國(guó)農(nóng)業(yè)結(jié)構(gòu)性調(diào)整目標(biāo)，實(shí)現(xiàn)水稻綠色、提質(zhì)、增效，改善居民食用稻米品質(zhì)的重要途徑。香型水稻種質(zhì)資源和育種材料的準(zhǔn)確鑒定是培育和生產(chǎn)推廣香型水稻品種的必要技術(shù)支撐。

隨著水稻香味性狀功能基因組學(xué)研究和DNA分子標(biāo)記技術(shù)的快速發(fā)展，已發(fā)現(xiàn)絕大多數(shù)香稻品種的香味性狀主要受位于第8染色體上的隱性基因badh2控制，由于其功能喪失，促進(jìn)了香味物質(zhì)2-乙?；?1-吡咯啉（2-acetyl-1-pyrroline，2-AP）的積累，從而使稻米產(chǎn)生香味[8-9]。有研究表明，badh2在香稻種質(zhì)資源中存在多種單倍型[10-11]，但以badh2-E7[第7外顯子 8bp 缺失，同時(shí)有3個(gè)單核苷酸多態(tài)性（SNPs）]最為常見(jiàn)，約占 80% 以上，并廣泛分布在世界各主要稻米生產(chǎn)國(guó)[10-12]，其他單倍型對(duì)應(yīng)的香稻品種數(shù)量較少，且具有較強(qiáng)的地域分布特性[10]，包括badh2-E2（第2外顯子7bp的缺失，約占香稻資源 6% 左右）和 badh2-E4-5 （第4和第5外顯子之間存在 803bp 的缺失，約占香稻資源 2% 不到）[1]，以及badh2-E12（第12外顯子 3bp 缺失）[13]、badh2-E13（第13外顯子 3bp 插入）[14]、badh2-UTR（5'UTR區(qū) 3bp 缺失）[15] 、badh2-Pro （啟動(dòng)子插入 8bp ）[16]等，其中badh2-E7單倍型往往同時(shí)存在 badh2-Pro （啟動(dòng)子插入 8bp ）變異[16]。隨著這些變異類(lèi)型功能標(biāo)記的開(kāi)發(fā)，香稻材料的篩選和香味基因badh2變異類(lèi)型的鑒定等研究工作迅速開(kāi)展，加快了香稻新品種選育[10-16] O

筆者收集了國(guó)內(nèi)外56份香稻種質(zhì)資源，根據(jù)香味基因badh2的主要功能單倍型，利用已報(bào)道的4個(gè)功能標(biāo)記，開(kāi)展香味基因badh2的變異類(lèi)型檢測(cè)，鑒定香稻材料不同類(lèi)型，并利用具有badh2-E7和badh2-E2單倍型的種質(zhì)資源和相應(yīng)功能標(biāo)記開(kāi)展香味水稻品種選育和種子純度檢測(cè)工作，為研究badh2單倍型與香味成分含量之間的關(guān)系，以及在優(yōu)質(zhì)香稻分子育種中科學(xué)合理選擇香稻育種親本以提高育種效率，改進(jìn)種子純度檢測(cè)方法提供參考。

1材料與方法

1.1供試材料香味基因分子鑒定材料為合肥豐樂(lè)種業(yè)股份有限公司收集的國(guó)內(nèi)外香稻種質(zhì)資源和香稻育種親本，共56份，包括國(guó)內(nèi)外地方品種10份（7份來(lái)源于中國(guó)水稻所國(guó)家作物種質(zhì)資源水稻中期庫(kù)）、國(guó)內(nèi)市場(chǎng)推廣品種41份，以及合肥豐樂(lè)種業(yè)股份有限公司香稻育種親本5份（恢復(fù)系1份，不育系4份），并以稻非香品種華占、9311，以及粳稻非香品種日本晴為對(duì)照（CK）（表1）。

香味育種群體供試材料是以南粳9108為供體，公司推廣品種潤(rùn)稻118為受體構(gòu)建的回交群體 BC₃F₂ 。種子純度檢測(cè)供試樣品為香味恢復(fù)系R2106的種子批。

1.2種質(zhì)資源香味基因變異類(lèi)型檢測(cè)取種子發(fā)芽7d后的幼苗，采用常規(guī)CTAB法[提取每份種質(zhì)資源的DNA，濃度調(diào)整到 20～30ng/μL ，備用。PCR擴(kuò)增采用 10μL 反應(yīng)體系： 10×PCR Buffer（含 25mmol/L MgCl₂ ） 1.0μL ， dNTPs（ 2.5mmol/L ） 0.8μL ，左右引物（ 10μmol/L 各 0.5μL ，TaqDNA聚合酶（ 5U/μL ） 0.1μL ，基因組DNA 2.0μL ddH₂0 4.2μL 其中，引物利用badh2基因已報(bào)道的4個(gè)主要等位變異（badh2-E7、badh2-E2、badh2-E4-5和 badh2–Pro ）對(duì)應(yīng)的4個(gè)功能標(biāo)記[16，18-20]。所用引物均由通用生物工程有限公司合成（表2）。PCR反應(yīng)程序?yàn)?95^°C 預(yù)變性 4min;95^°C 變性 30s，55°C 退火 30s，72°C 延伸 ^{45s，32} 個(gè)循環(huán)后， 72^°C 條件下延伸 保存。

PCR擴(kuò)增產(chǎn)物采用 6% 變性聚丙烯酰胺凝膠電泳檢測(cè)，經(jīng) 0.2% 硝酸銀染色后，于膠片觀察燈上記錄條帶信息。并用 3730XL 基因測(cè)序儀毛細(xì)管電泳驗(yàn)證片段大?。≒CR擴(kuò)增時(shí)，使用熒光引物）。

1.3育種群體香味基因型檢測(cè)采用快速法2提取單株DNA，PCR擴(kuò)增和產(chǎn)物凝膠電泳檢測(cè)方法同\"1.2”。

1.4純度樣品基因型檢測(cè)種子發(fā)芽5＼～7d后，采用快速法[21]提取192個(gè)幼苗DNA，PCR擴(kuò)增和產(chǎn)物凝膠電泳檢測(cè)方法同\"1.2”。

2 結(jié)果與分析

2.1種質(zhì)資源香味基因變異類(lèi)型檢測(cè)結(jié)果以56份香稻材料和3份非香材料（對(duì)照）的基因組DNA為模板，利用香味基因badh2已報(bào)道的4個(gè)主要等位變異（badh2-E7、badh2-E2badh2-E4-5和badh2-Pro）對(duì)應(yīng)的4個(gè)功能標(biāo)記檢測(cè)其單倍型。

結(jié)果表明（表3，圖1），在badh2-E7功能標(biāo)記位點(diǎn)，3個(gè)非香品種（華占、R9311、日本晴）擴(kuò)增出 206bp 的條帶，而KDML105、Basmati370、紫香糯等22份材料擴(kuò)增出 198bp 的條帶，說(shuō)明這22份材料為badh2第7外顯子 8bp 缺失純合變異類(lèi)型；稻花香、美香占2號(hào)和農(nóng)香39擴(kuò)增出198和206bp2 種條帶，說(shuō)明這3份材料為badh2第7外顯子8bp缺失雜合變異類(lèi)型?？傮w而言，共有25份材料具有第7外顯子 8bp 缺失變異，占總數(shù)的 44.64% 。在badh2-E2功能標(biāo)記位點(diǎn)，3個(gè)非香品種（華占、R9311、日本晴）擴(kuò)增出 104bp 的條帶，而京粳1號(hào)、南粳9108、金香玉一號(hào)等20份材料擴(kuò)增出 97bp 的條帶，說(shuō)明這20份材料為badh2第2外顯子7bp 缺失純合變異類(lèi)型，占總數(shù)的 35.71% 。在badh2-E4-5功能標(biāo)記位點(diǎn)，僅香大糯這1份材料擴(kuò)增出大小為 317bp 的條帶，說(shuō)明香大糯為badh2第4和第5外顯子之間存在803bp 的缺失變異類(lèi)型，占總數(shù)的 1.79% 。在 badh2-Pro 功能標(biāo)記位點(diǎn)，粘稻非香品種華占和R9311擴(kuò)增出 的條帶（粘型），粳稻非香品種日本晴擴(kuò)增出 196bp 的條帶（粳型），另外檢測(cè)到2種香型功能變異類(lèi)型： badh2–Pro（8） （啟動(dòng)子插入 8bp ）和 badh2-Pro（5） （啟動(dòng)子插入 5bp ）。其中，南粳5055、南粳9308、香糯、香大糯以及KDML105、Basma-ti370、紫香糯等29份材料擴(kuò)增出大小為 204bp 的條帶，說(shuō)明這29份材料為粳型 badh2-Pro（8） （啟動(dòng)子插入 8bp ）純合變異類(lèi)型。稻花香、美香占2號(hào)和農(nóng)香39擴(kuò)增出204 和 454bp 2種條帶，說(shuō)明這3份材料為 badh2–Pro（8） （啟動(dòng)子插入8bp ）雜合變異類(lèi)型?？傮w而言，共有32份材料具有badh2-Pro（8） （啟動(dòng)子插入 8bp ）等位變異，占總數(shù)的 57.14% ;而增城絲苗和一枝香2個(gè)品種擴(kuò)增出大小為201bp的條帶，說(shuō)明這2份材料為粳型 badh2-Pro（5） （啟動(dòng)子插入 5bp ）純合變異類(lèi)型，占總數(shù)的 3.57% 。然而，華夏絲苗、農(nóng)香42、Della、曼谷香稻和福香1號(hào)5個(gè)香稻種質(zhì)資源未在這4個(gè)功能標(biāo)記位點(diǎn)檢測(cè)到香型功能變異，且其單倍型與非香稻對(duì)照華占和R9311一致，占總數(shù)的 8.93% 。

因此，利用以上4個(gè)功能標(biāo)記能夠準(zhǔn)確鑒定出 91.07% 的香稻種質(zhì)資源。其中，badh2-E7和badh2-E22種單倍型是主要的功能變異，共占供試材料的 80.36% 。值得一提的是，25份badh2-E7單倍型和1份 badh2-E4-5 單倍型材料同時(shí)也存在 badh2–Pro（8） （啟動(dòng)子插入 8bp ）等位變異，而只存在 badh2-Pro（8） 和 badh2-Pro（5） 等位變異的單倍型分別有3和2份，因此， badh2-Pro 功能標(biāo)記能鑒定出30份香稻資源，占總數(shù)的 53.57% 。

2.2育種群體香味基因型檢測(cè)結(jié)果香味供體材料南粳9108為badh2-E2單倍型，利用相應(yīng)功能標(biāo)記檢測(cè)南粳9108和潤(rùn)稻118構(gòu)建的BC3F2回交群體材料的badh2基因型。結(jié)果表明，該標(biāo)記能夠準(zhǔn)確區(qū)分badh2-E2純合變異、雜合變異，以及無(wú)變異的單株（圖2），因而可有效應(yīng)用于香味水稻品種分子輔助育種，提高育種的準(zhǔn)確性和效率。

2.3純度檢測(cè)樣品香味基因型檢測(cè)結(jié)果香味恢復(fù)系R2106為badh2-E7單倍型，利用相應(yīng)功能標(biāo)記檢測(cè)R2106種子批的純度。結(jié)果表明，96個(gè)單株中有1株badh2-E2無(wú)突變，說(shuō)明該單株混雜（圖3）。由此推測(cè)badh2功能標(biāo)記可用于不同類(lèi)型香稻品種的純度檢測(cè)。

圖2BC3F2回交群體材料在badh2-E2功能標(biāo)記位點(diǎn)上的電泳圖譜

Fig.2The electrophoretic map of BC3F2 backcross population materials at badh2-E2 functional marker

3結(jié)論與討論

種質(zhì)資源是育種的基礎(chǔ)，隨著優(yōu)質(zhì)香米消費(fèi)需求的持續(xù)增長(zhǎng)和經(jīng)濟(jì)價(jià)值的提高，香味成為水稻品質(zhì)改良的重要性狀之一，因此有必要對(duì)香味種質(zhì)資源進(jìn)行遺傳解析，并提供簡(jiǎn)單準(zhǔn)確的鑒定方法，為優(yōu)質(zhì)香型水稻品種的快速選育提供物質(zhì)前提和技術(shù)保障。近年來(lái)，隨著基因測(cè)序技術(shù)迅猛發(fā)展和功能基因組學(xué)不斷突破，大量水稻品種包括香稻種質(zhì)資源，完成了測(cè)序和功能基因分析，發(fā)現(xiàn)了一系列香味基因的變異位點(diǎn)及其單倍型，并針對(duì)不同變異位點(diǎn)開(kāi)發(fā)出了可應(yīng)用于香味種質(zhì)資源篩選和品種培育的功能標(biāo)記。該研究收集了國(guó)內(nèi)外56份香稻種質(zhì)資源，利用已報(bào)道的香味基因badh2的主要功能單倍型和對(duì)應(yīng)的4個(gè)功能標(biāo)記，能夠準(zhǔn)確鑒定出91.07% 的香稻種質(zhì)資源，說(shuō)明這4個(gè)功能標(biāo)記可用于更廣泛的香稻種質(zhì)資源鑒定和品種選育。56份香稻種質(zhì)資源中，badh2-E7和 badh2-E2 2 種單倍型是主要的功能變異，共占供試材料的 80.36% ，且 badh2-E7 單倍型主要存在于燦稻品種中，而 badh2-E2 單倍型主要存在于粳稻稻品種中。有趣的是 badh2-Pro 功能標(biāo)記檢測(cè)到2種變異類(lèi)型： badh2-Pro （8）和 badh2-Pro（5） ，且badh2-E7單倍型和 badh2-E4-5單倍型材料同時(shí)也存在 badh2–Pro（8） 等位變異，但仍檢測(cè)到少量只存在 badh2–Pro（ 8） 和 badh2-Pro（5） 等位變異的單倍型。這些結(jié)果可能說(shuō)明badh2香味基因的等位變異存在粘粳分化，并持續(xù)向不同方向發(fā)生了進(jìn)化，這有待于收集更多種質(zhì)資源進(jìn)行進(jìn)一步遺傳解析。有5份材料在4個(gè)功能標(biāo)記位點(diǎn)均未檢測(cè)到等位變異，且其單倍型與非香釉稻對(duì)照華占和R9311一致，其中Della等位基因型與前人報(bào)道不同[0]，可能種質(zhì)資源收集有誤，其他材料可能屬于badh2其他已報(bào)道的或新的等位變異類(lèi)型，抑或是含有新的香味基因，這有待進(jìn)一步鑒定。另有3份材料存在等位基因型雜合現(xiàn)象，可能也是由于收集的種質(zhì)資源不夠純合所致。總之，該研究鑒定出的香稻材料不同類(lèi)型可有效指導(dǎo)優(yōu)質(zhì)香稻分子育種中科學(xué)合理選擇香稻育種親本，進(jìn)而提高育種效率。但準(zhǔn)確收集更多種質(zhì)資源，結(jié)合功能標(biāo)記分析和測(cè)序進(jìn)行遺傳解析，并研究badh2單倍型與香味成分含量之間的關(guān)系將會(huì)進(jìn)一步有效促進(jìn)優(yōu)質(zhì)香稻新品種選育，從而提高我國(guó)稻米食用和經(jīng)濟(jì)價(jià)值。

在香稻品種選育過(guò)程中，需要在育種群體中準(zhǔn)確鑒定出含有香味基因（純合和雜合）的單株，由于香味基因badh2為隱性基因，只有基因型純合單株才表現(xiàn)出香味，傳統(tǒng)基于表型鑒定的感官評(píng)價(jià)法包括咀嚼法和嗅聞法等，只能鑒定出badh2基因型純合單株，且存在主觀影響大，重復(fù)性差，準(zhǔn)確性偏低，效率不高等問(wèn)題，而基于現(xiàn)代質(zhì)譜技術(shù)的化學(xué)分析方法，仍然可以更準(zhǔn)確鑒定出香味物質(zhì)2-AP含量，但卻需要大量樣本、昂貴的設(shè)備和專(zhuān)業(yè)技術(shù)人員[22]，且需嚴(yán)格控制環(huán)境條件對(duì)香味物質(zhì)的影響等，故以上2種方法均不適用于香稻品種選育過(guò)程。相反，基于功能基因的分子標(biāo)記檢測(cè)法能夠檢測(cè)基因的顯隱性，準(zhǔn)確性高、成本低，且適用于批量快速檢測(cè)，是目前香稻品種選育過(guò)程中最為準(zhǔn)確有效的檢測(cè)方法。此外，隨著DNA技術(shù)的快速發(fā)展，分子標(biāo)記檢測(cè)技術(shù)在種子純度檢測(cè)中的應(yīng)用也越來(lái)越廣[23]，但實(shí)踐中發(fā)現(xiàn)，由于遺傳背景和不同混雜類(lèi)型的影響，同一批次種子選擇不同的分子標(biāo)記，其純度結(jié)果并非總是完全一致，因此找到品種特異性特征，應(yīng)用相對(duì)應(yīng)的分子標(biāo)記檢測(cè)純度，可能更加準(zhǔn)確。因此，該研究分別利用具有badh2-E7和badh2-E2單倍型的種質(zhì)資源和相應(yīng)功能標(biāo)記，開(kāi)展了香味品種選育和種子純度檢測(cè)的應(yīng)用實(shí)踐工作。

結(jié)果證實(shí)，該研究鑒定的香稻種質(zhì)資源和相應(yīng)功能標(biāo)記可以有效應(yīng)用于香味水稻品種分子輔助育種和純度檢測(cè)，有助于提高育種和種子質(zhì)量檢測(cè)的準(zhǔn)確性和效率。

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