伊犁馬初乳與常乳時(shí)期乳成分與血漿代謝組比較分析

中圖分類號(hào)：S821 文獻(xiàn)標(biāo)志碼：A 文章編號(hào)：1001-4330（2025）04-1002-12

0 引言

【研究意義】乳制品富含蛋白質(zhì)、脂肪、乳糖、生物活性肽和微量營養(yǎng)素等多種營養(yǎng)成分[1]。牛奶由于其產(chǎn)量高、生產(chǎn)技術(shù)成熟等優(yōu)勢(shì)占據(jù)主要市場(chǎng)，而隨著特種乳業(yè)的迅速發(fā)展，馬乳也逐漸得到重視而快速發(fā)展。馬乳是一種由蛋白質(zhì)、脂肪、乳糖及礦物質(zhì)等營養(yǎng)物質(zhì)組成的極具營養(yǎng)價(jià)值的飲品?！厩叭搜芯窟M(jìn)展】與其它畜乳相比，馬乳與人乳乳成分更為相似，具有低脂肪、低蛋白和低礦物質(zhì)的特點(diǎn)，易被消化吸收[2]。馬乳也富含乳糖、不飽和脂肪酸、無機(jī)鹽及維生素[3]，是一種極具特色的高營養(yǎng)價(jià)值乳品。馬乳作為我國的特種乳，對(duì)其泌乳的機(jī)制解析體系尚未完善。血液中的一些激素、游離氨基酸等物質(zhì)以及小分子物質(zhì)對(duì)乳畜的生產(chǎn)性能影響是多方面的。其中分子量低于1000的小分子代謝物是一些生物學(xué)過程的標(biāo)記物。代謝物是細(xì)胞內(nèi)部（基因組）和細(xì)胞或有機(jī)體外部（環(huán)境）發(fā)生的復(fù)雜相互作用的最終產(chǎn)物，代謝組學(xué)是采用先進(jìn)的分析化學(xué)技術(shù)全面檢測(cè)細(xì)胞、組織和生物流體中的全部小分子代謝物[4]血液代謝組學(xué)分析可用于解析或鑒定畜禽的經(jīng)濟(jì)特征[5-6]。乳成分中的部分代謝物直接來自于血液，同時(shí)血液代謝物也可調(diào)節(jié)乳腺細(xì)胞的生物學(xué)功能[7-9]。【本研究切入點(diǎn)】在奶牛血清中的馬尿酸、煙酰胺和壬酸可作為乳蛋白水平的生物標(biāo)志物[10]。血清代謝組學(xué)作為發(fā)現(xiàn)和預(yù)測(cè)家畜經(jīng)濟(jì)性狀的有效途徑之一，在多個(gè)物種的多種經(jīng)濟(jì)性狀研究中得到了廣泛的應(yīng)用[11-12]。然而，通過血液代謝組學(xué)發(fā)現(xiàn)乳畜產(chǎn)奶性狀差異機(jī)制研究較少?！緮M解決的關(guān)鍵問題】通過對(duì)伊犁馬初乳時(shí)期和常乳時(shí)期的乳成分和血漿代謝組比較分析，解析2個(gè)時(shí)期之間乳成分差異的調(diào)控機(jī)制，為伊犁馬初乳與常乳的分泌機(jī)制解析、改良乳畜泌乳性狀提供參考。

材料與方法

1.1 材料

1. 1.1 馬匹

試驗(yàn)動(dòng)物選取12＼～14歲、胎次、預(yù)產(chǎn)期相近，在新疆伊犁哈薩克自治州昭蘇縣昭蘇馬場(chǎng)闊斯托別草場(chǎng)統(tǒng)一放牧飼養(yǎng)的伊犁馬8匹采集乳樣與血液。

乙腈（Merck，1499230-935）乙酸銨（Sigma，70221）、甲醇、氨水和超純水。

1. 1.2 儀器與設(shè)備

AB Triple TOF 6600 質(zhì)譜儀（AB SCIEX）、Ag-ilent1290InfinityLC超高壓液相色譜儀（Agi-lent）、低溫高速離心機(jī)（Eppendorf5430R）、色譜柱：Waters，ACQUITY UPLC BEH Amide 1.7μm 。

1. 1.3 樣品采集

樣品均在分娩后第 0d 的 0～2h 內(nèi)和分娩后30d10：00～12：00 采集，乳樣均為手工擠乳，擠乳時(shí)先棄去前一小部分乳樣，再開始采集試驗(yàn)樣本，采集后乳樣使用 100mL 乳樣瓶分裝，并立即放置于保溫箱低溫保存， 2h 內(nèi)帶回實(shí)驗(yàn)室放置-20% 冰箱保存待測(cè)。

血液采集時(shí)將試驗(yàn)動(dòng)物分別固定，使用添加肝素鈉的真空采血管從試驗(yàn)動(dòng)物頸靜脈中采集5mL血液樣本，立即將每組樣本在 3 000Ωr/min 、4^°C 下離心 15min 獲得相應(yīng)血漿，血漿樣品立刻液氮速凍后放置于 -80% 保存待測(cè)。

1.2 方法

1. 2.1 乳成分檢測(cè)

將試驗(yàn)樣本使用乳成分分析儀（LactoScopeFTIRAdvanced）進(jìn)行奶樣常規(guī)成分檢測(cè)，檢測(cè)指標(biāo)包括脂肪、蛋白質(zhì)、酪蛋白、乳糖、固形物和非乳脂固形物含量。

1.2.2 LC-MS分析

1. 2.2.1 樣品預(yù)處理

樣本在 4^°C 環(huán)境下緩慢解凍后，取適量樣本加入預(yù)冷甲醇/乙腈/水溶液 （2：2：1，v/v） ，渦旋混合，低溫超聲 30min ， -20c 靜置 10min ，14000g4^°C 離心 20min ，取上清真空干燥，質(zhì)譜分析時(shí)加入 100μL 乙腈水溶液（乙腈：水 σ=1：1 ，v/v ）復(fù)溶，渦旋， 14000g4^°C 離心 15min ，取上清液進(jìn)樣分析。

1. 2. 2. 2 色譜－質(zhì)譜分析

色譜條件：樣品采用Agilent1290InfinityLC超高效液相色譜系統(tǒng)（UHPLC）HILIC色譜柱進(jìn)行分離;柱溫 25°C ；流速 0.5mL/min ;進(jìn)樣量 2μL 0流動(dòng)相條件：A相為水 +25mM 乙酸銨 氨水，B相為乙腈。表1

TOF質(zhì)譜條件：采用ABTripleTOF6600質(zhì)譜儀進(jìn)行樣本一級(jí)、二級(jí)譜圖的采集。ESI源的參數(shù)設(shè)置如下：霧化氣壓力 60psi ;輔助干燥氣壓力 60psi ；氣簾氣壓力 ;離子源溫度 600^°C ：離子噴霧電壓浮動(dòng) （正負(fù)兩種模式）。TOFMS掃描 m/z 范圍： 60～1000Da ，產(chǎn)物離子掃描 m/z 范圍： 25～1000Da ，TOFMS掃描累積時(shí)間0.20，產(chǎn)物離子掃描累積時(shí)間 0.05s/spec tra。二級(jí)質(zhì)譜采用數(shù)據(jù)依賴性（intelligentdataac-quisition，IDA）數(shù)據(jù)采集方法，并采用高靈敏度模式，除塵潛力（DP）： ±60 V（正負(fù)2種模式），碰撞能量： 35±15eV ，IDA設(shè)置：排除 4Da 以內(nèi)的同位素，每個(gè)周期監(jiān)測(cè)的候選離子：10。

1.3 數(shù)據(jù)處理

1.3.1 乳成分

乳成分試驗(yàn)數(shù)據(jù)用Excel2016進(jìn)行初步整理分析，利用SPSS19.0（IBMSPSSStatistics19.0）軟件進(jìn)行單因素方差分析（ANOVA），以 Plt; 0.05為差異顯著，結(jié)果以平均值 ± 標(biāo)準(zhǔn)差（MEAN±SEM 表示。

1.3.2 代謝物

質(zhì)譜分析后的原始數(shù)據(jù)首先使用ProteoWiz-ard軟件轉(zhuǎn)成mzML格式，使用XCMS軟件（ver-sion3.2）進(jìn)行保留時(shí)間矯正、色譜峰的提取、識(shí)別、積分和對(duì)齊等工作。如果在一組樣本中檢測(cè)出該物質(zhì)的樣本數(shù) ?50% ，則對(duì)該物質(zhì)進(jìn)行過濾。隨后對(duì)每個(gè)樣本數(shù)據(jù)進(jìn)行內(nèi)標(biāo)歸一。用數(shù)據(jù)集中最小值的一半替換缺失值。使用OSI-SMMSv1.0軟件通過對(duì)比質(zhì)譜數(shù)據(jù)庫進(jìn)行峰注釋。采用R語言包（http：//www.r-pro-ject.org/）進(jìn)行主成分分析（Principalcomponent a-nalysis，PCA）、偏最小二乘法判別分析（Partialleast squares discriminant analysis，PLS-DA）和正交化PLS-DA（Orthogonnal PLS-DA，OPLS-DA）等多元統(tǒng)計(jì)分析。利用構(gòu)建的OPLS-DA模型的VIP值結(jié)合單變量統(tǒng)計(jì)分析 T 檢驗(yàn) P 值來篩選不同比較組間的顯著差異代謝物，將 VIPgt;1 ，Plt;0.05，F(xiàn)Cgt;2 或 FClt;0.5 作為篩選差異代謝物的閾值。

1.3.3 生物信息學(xué)

將篩選的差異代謝物通過R軟件中Com-plexHeatmap包（Ver.1.2.1）對(duì)樣品和差異代謝物同時(shí)進(jìn)行層次聚類分析，結(jié)果以熱圖形式展現(xiàn)；進(jìn)行KEGG通路富集分析，結(jié)果以KEGG氣泡圖展現(xiàn)。通過結(jié)合KEGG通路分析結(jié)果和篩選的差異代謝物，綜合分析初乳與常乳時(shí)期血漿代謝物的差異。

2 結(jié)果與分析

2.1 伊犁馬初乳與常乳乳常規(guī)成分差異

研究表明，初乳中的乳脂、乳蛋白、總固形物、非乳脂固形物均顯著高于常乳（ Plt;0.05 ）；初乳中的乳糖率顯著低于常乳（ ）。表2

表2 伊犁馬初乳與常乳的乳成分對(duì)比

2.2 多元統(tǒng)計(jì)

研究表明，在正離子模式下， PC₁=19.30% ！PC₂=10.40% ;在負(fù)離子模式下， PC₁=19.60% ！PC₂=9.50% 。XZ與XC兩組樣品分離良好，同一組中的樣品聚合良好。

在正離子模式下 R²X=0.354 ， R²Y=0.976 ，Q2=0.866（R²Y 為模型對(duì) Y 變量的解釋性; Q2 為模型的可預(yù)測(cè)性）；在負(fù)離子模式下 R²X=0.409 R²Y=0.989 ， Q2=0.930 。正、負(fù)離子模式下模型參數(shù) R²Y 和 Q2 值均 gt;0.5 ，且 R² 接近于1，模型穩(wěn)定性高。圖1

注：左：正離子模式；右：負(fù)離子模式，下同 Notes：Left ∵ positiveionmode；Right：negativeionmode，the sameasbelow

Fig.1PCA Score Plot of Plasma metabolites during colostrum and regular lactatic

2.3 差異代謝物鑒定

研究表明，共篩選出差異代謝物363種。在正離子模式下，共篩選出160種差異代謝物，其中96種代謝物在初乳時(shí)期的血漿中較常乳時(shí)期上調(diào)，64種代謝物下調(diào)；在負(fù)離子模式下，共篩選出

203種差異代謝物，其中109種代謝物在初乳時(shí)期的血漿中較常乳時(shí)期上調(diào)，94種代謝物下調(diào)。根據(jù)FC值的大小篩選出了初乳時(shí)期與常乳時(shí)期血漿中的前40種優(yōu)勢(shì)代謝物。表3＼～4，圖2＼～3

2.4 差異代謝物的通路富集

研究表明，縱坐標(biāo)為Pathway，橫坐標(biāo)為富集因子。顯著富集通路（ Plt;0.05） 有5條，分別為戊糖和葡萄糖醛酸的相互轉(zhuǎn)化（Pentoseandglu-curonateinterconversions）、不飽和脂肪酸的生物合成（Biosynthesis ofunsaturated fattyacids）ABC 轉(zhuǎn)運(yùn)體（ABCtransporters）、脂肪酸的生物合成（Fattyacidbiosynthesis）、逆行內(nèi)源性大麻素信號(hào)傳導(dǎo)（Retrogradeendocannabinoid signaling）。表5，圖4

續(xù)表4 常乳時(shí)期血漿中前40種優(yōu)勢(shì)代謝物

Tab.5Enrichment pathwaysand associated differential metabolitesbetween

3討論

3.1 脂代謝

乳腺發(fā)育具有復(fù)雜調(diào)控機(jī)制，乳脂合成的主要途徑包括脂肪酸（FA）的從頭合成、血液中飽和長(zhǎng)鏈脂肪酸（LCFA）的吸收[13]。對(duì)于泌乳期第一個(gè)月的奶牛，從血液中攝取飽和長(zhǎng)鏈脂肪酸是最主要的[14]。因此，血漿脂肪酸組成變化對(duì)乳腺組織攝取用于乳脂的合成具有重要影響。試驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)，飽和長(zhǎng)鏈脂肪酸（棕櫚酸、硬脂酸）在初乳時(shí)期血漿中富集，與前人研究一致。此外，外源性補(bǔ)充脂肪酸后，泌乳期母馬的乳腺能夠攝取血液中長(zhǎng)鏈脂肪酸及部分C16脂肪酸合成新的甘油三酯，再進(jìn)一步聚合為乳脂小滴，最終分泌到乳中[15]，進(jìn)而改善馬乳中脂肪或脂肪酸的含量[16]]Lauridsen等[17]和Mcfadden等[18]研究表明，在泌乳期母豬飼糧中添加富含長(zhǎng)鏈脂肪酸的脂肪或油脂能夠提高乳脂率，并且對(duì)乳中脂肪酸含量的提高也有作用。Noble等[19研究表明，動(dòng)物從日糧中攝取的亞油酸和 ∝ -亞麻酸分泌到乳汁中的含量通常在 30%～60% 。金曙光等[20]研究表明，奶牛乳脂中近一半的軟脂酸和全部更長(zhǎng)碳鏈的脂肪酸由血液中攝入，通過對(duì)奶牛泌乳中期的日糧中添加 4.5% 富含 ∝- 亞麻酸的添加劑可顯著提高產(chǎn)奶量、乳脂率及乳蛋白率。試驗(yàn)中，初乳中乳脂含量高于常乳，初乳時(shí)期血漿中 α- 亞麻酸、肉豆蔻酸、月桂酸、花生四烯酸等中長(zhǎng)鏈脂肪酸較常乳時(shí)期血漿中含量上調(diào)，也證明了血漿中高濃度的脂肪酸對(duì)乳脂合成有積極作用。在顯著富集的通路中有2條參與機(jī)體脂質(zhì)代謝的通路，分別是不飽和脂肪酸的生物合成和脂肪酸的生物合成，其中富集的差異代謝物多為初乳時(shí)期血槳的優(yōu)勢(shì)代謝物，2條通路在乳腺泌乳啟動(dòng)時(shí)起重要作用，通路中的棕櫚酸、 α_.∝ -亞麻酸、硬脂酸等優(yōu)勢(shì)代謝物也可能是初乳中乳脂含量高的標(biāo)志代謝物。

3.2 糖代謝

乳糖是大多數(shù)物種乳汁中的主要糖，是由葡萄糖和半乳糖合成的二糖，其中葡萄糖作為乳糖合成的主要前體物質(zhì)，在泌乳期間需求較大。研究表明，哺乳動(dòng)物血液中 60%～85% 的葡萄糖被乳腺上皮細(xì)胞攝取用于合成乳糖[21]。泌乳所需的葡萄糖主要來源于小腸吸收或肝臟糖異生，糖異生是機(jī)體將非糖物質(zhì)轉(zhuǎn)變成葡萄糖的過程，是保障乳腺葡萄糖供應(yīng)、產(chǎn)奶量及乳品質(zhì)的主要途徑。使用一定量甘油（生糖物質(zhì)）代替飼糧中的玉米，或者補(bǔ)飼生物素和煙酰胺均可顯著促進(jìn)奶牛肝臟糖異生作用[22]。Wei等[23]研究發(fā)現(xiàn)，在奶牛日糧中添加生物素可以提高奶牛的血糖水平，降低血清NEFA含量。試驗(yàn)中，生物素、甘油等差異代謝物均有顯著變化，也證明了生物素、甘油可以促進(jìn)肝臟糖異生、從而維持血漿中的葡萄糖水平。

蘇糖醇是木糖代謝的終產(chǎn)物，也通過葡萄糖醛酸途徑與戊糖磷酸途徑相關(guān)。戊糖磷酸途徑在大鼠乳腺和脂肪組織中最活躍[24]。蘇糖醇的糖代謝物相對(duì)濃度越高，可能表明乳腺中葡萄糖氧化提高產(chǎn)奶量和乳糖的能量供應(yīng)越多[25]。試驗(yàn)中，D-蘇糖醇在常乳時(shí)期血漿中顯著上調(diào)，與前人研究結(jié)果一致。同時(shí)葡萄糖還是碳水化合物代謝的中間產(chǎn)物，反映機(jī)體能量及糖代謝狀況，試驗(yàn)富集的代謝通路中也包含碳水化合物代謝中的戊糖和葡萄糖醛酸的相互轉(zhuǎn)化，富集到該途徑中。D-葡萄糖醛酸、D-木糖、雙半乳糖醛酸、甘油、木糖醇在常乳時(shí)期的血漿中較初乳時(shí)期上調(diào)，都表明常乳時(shí)期母體的葡萄糖代謝水平、用于合成乳糖的能力水平提升，與常乳中乳糖含量高于初乳的結(jié)果一致。

3.3 0.氨基酸代謝

氨基酸代謝在泌乳過程中起著至關(guān)重要的作用，能夠調(diào)節(jié)母體內(nèi)分泌狀態(tài)、乳腺血流量、參與激活靶雷帕霉素（mTOR）信號(hào)通路[26]。而乳中大部分乳蛋白是乳腺上皮細(xì)胞利用日糧提供的能量和血液中的氨基酸合成。當(dāng)乳腺組織攝入氨基酸過量時(shí)，會(huì)直接合成乳蛋白及非必需氨基酸；而當(dāng)乳腺組織攝入游離氨基酸不足時(shí)，一些非游離氨基酸則以肽的形式合成乳蛋白[27]。生物素、泛酸是水溶性B族維生素。生物素參與反芻動(dòng)物糖異生、丙酸代謝及脂肪酸合成等生化過程。提高血槳和初乳中生物素含量，改善奶牛的糖代謝和胰島素敏感性[23]。生物素能增強(qiáng)奶牛血清中氨基酸代謝水平[28]。泛酸廣泛存在于所有生物體組織中，是輔酶A的組成成分之一，與氨基乙醇和腺苷二磷酸構(gòu)成人和動(dòng)物體內(nèi)?；D(zhuǎn)移酶類的輔酶A，參與蛋白質(zhì)、脂肪、糖的代謝，具有乙酰化作用，在物質(zhì)代謝中起著重要的作用。泛酸的主要代謝功能有促進(jìn)脂肪酸的合成和分解以及參與檸檬酸循環(huán)。泛酸與維生素B12、VC 的利用具有相互促進(jìn)作用，可能與葉酸、生物素也存在某種關(guān)聯(lián)[29]。試驗(yàn)初乳時(shí)期的血漿中生物素、泛酸與常乳時(shí)期相比均顯著上調(diào)，說明生物素、泛酸可能作為輔酶或輔因子提高血液中氨基酸代謝水平。血根堿是一種生物堿，能夠抑制機(jī)體的炎癥表達(dá)[30]。血根堿在動(dòng)物生產(chǎn)中主要通過調(diào)節(jié)動(dòng)物腸道功能，增強(qiáng)機(jī)體免疫和抗氧化能力，進(jìn)而提高畜禽生產(chǎn)性能[31]。有研究表明，飼糧中添加血根堿會(huì)使血清中必需氨基酸的濃度增加[32]。凌浩等[33]研究表明，奶山羊日糧中添加血根堿可以提高產(chǎn)奶量。試驗(yàn)初乳時(shí)期血漿中血根堿含量顯著上調(diào)，原因可能是血根堿通過增強(qiáng)機(jī)體免疫和抗氧化能力，改善微生物菌群[30]，進(jìn)而提高了初乳時(shí)期的產(chǎn)奶量及氨基酸含量。這些差異代謝物均可提高初乳時(shí)期的氨基酸代謝水平，促進(jìn)乳腺組織從血液中攝入氨基酸合成乳蛋白，與初乳中乳蛋白含量高于常乳的結(jié)果一致。

4小結(jié)

伊犁馬初乳中乳脂、乳蛋白、固形物和非脂肪固形物均顯著高于常乳。初乳時(shí)期血槳中富集很多中長(zhǎng)鏈脂肪酸、氨基酸、小肽等，例如：棕櫚酸、亞麻酸、賴氨酸、生物素、泛酸，這些差異代謝物對(duì)乳腺合成乳脂、乳蛋白有積極作用，常乳時(shí)期血漿中主要富集了許多提高葡萄糖代謝水平的差異代謝物，例如D-蘇糖醇、D-葡萄糖醛酸、D-木糖、雙半乳糖醛酸和甘油等，促進(jìn)了常乳時(shí)期乳腺中乳糖的合成。

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Abstract：【Objective】 This project aims to investigate the differences in milk composition between the two periods and the potential regulatory mechanisms by analysing the milk composition and plasma metabolome of Il horses during colostrum and regular milk.【Methods】Milk and blood samples were collcted from eight Yilihorses on dayO andday3O of parturition，respectively，and milk routine analyses of milk from the two periods were carred out bya milk composition analyser，and comparative analyses of plasma metabolites were performed by non-targeted metabolomics.【Results】The results revealed that milk fat，milk protein，solids and non- solids were significantly higherin colostrum than in regular milk （ Plt;0.05 ），and lactose was significantly lower in colostrum thanin regularmilk （ Plt;0.05 ）.Plasma metaboliteswere analyzed and a total of 363 differential metabolites were screened according to conditions.【Conclusion】Pathway enrichment analysis of differential metabolites significantly enriched a total of 5 functional pathways.The presence of many metabolites in plasma during colostrum period was assciated with the promotion of fatyacid metabolism，glucose metabolism，and amino acid metabolism in the mammary gland，such as palmitic acid，D-threitol，biotin，and pantothenic acid.

Key words： Ili horse； colostrum； regular milk ;milk components； plasma metabolome