化肥施用量對(duì)設(shè)施黃瓜葉片差異代謝物的影響

Effects of fertilizer application rate on differential metabolites in facility cucumberleaves

SUN Shaokun1，2， WANG Shuang23，LIU Shujun'

（1.Institutefblcna; culture，eileid ，Liaoning，China）

Abstract：To investigatethemechanismoftheeffectsoffertilizerapplicationrateonmetabolitesanddierentialmetabolic pathwaysincucumberleaves，thecucumbervarietyJinyou30wasusedasthetestmaterial，ndnofertlization（CFO）， reduced fertilization（CF0.5），conventional fertilization（CF1），and excessve fertilization（CF2）treatments were setup. Gas chromatography-masspectrometry（GC-MS）wasusedtoanalyzethechanges inleafmetabolomics，and themetabolic diffrences between CF0.5，CF2，and CF1 were compared.The results showed that compared with CF1， CF0.5 treatment screened14 differential metabolites，CF2 treatment screened16 differential metabolites，and CF0.5 and CF2 had a total of10diferential metabolites.These diffrential metabolitesare mainlydivided intoaminoacids，sugars，andorganic acids，and their relativeabundance generallyshowsa downward trend under CF0.5 treatment and anupward trend under CF2treatment.Thechanges indifferentialmetabolitesmaybecloselyrelatedtonutrientcontentinsoil，andcucumber leaves may respond to fertilization stress by accumulating amino acids and organic acids.

Keywords：Facilitycucumber;Fertilizerapplication;Metabolomics;Differential metabolites

設(shè)施蔬菜具有較高的經(jīng)濟(jì)效益，近年來發(fā)展迅速。然而，在高收益的驅(qū)動(dòng)下，以市場為導(dǎo)向，設(shè)施蔬菜生產(chǎn)中農(nóng)民大量使用肥料來提高產(chǎn)量，且北方地區(qū)設(shè)施栽培一年兩茬，休耕時(shí)間短，大量的養(yǎng)分在設(shè)施土壤中不斷累積，導(dǎo)致土壤酸化、次生鹽漬化等問題頻發(fā)[2-4]。這不僅影響蔬菜類作物的品質(zhì)與產(chǎn)量，也危及設(shè)施產(chǎn)業(yè)的可持續(xù)發(fā)展[2-5]?？茖W(xué)精準(zhǔn)施肥是農(nóng)業(yè)生產(chǎn)提質(zhì)增效的重要措施。

氮磷鉀肥調(diào)控蔬菜的形態(tài)建成，影響蔬菜的生長發(fā)育、產(chǎn)量和代謝。代謝組學(xué)是系統(tǒng)生物學(xué)的重要組成部分，越來越多地應(yīng)用于探究植物在各種非生物脅迫條件下的生理反應(yīng)7。前人在養(yǎng)分脅迫對(duì)作物生理代謝的影響方面已有相關(guān)研究。氮素缺乏會(huì)導(dǎo)致作物葉片的代謝重新編程，主要影響次生代謝和激素譜，反映在光合性能、冠層生長和果實(shí)品質(zhì)調(diào)節(jié)中[8]。低氮供應(yīng)對(duì)生菜碳代謝、氨基酸代謝和酚類生物合成代謝均有顯著影響，低氮處理下可能通過有效地將更多的碳和氮資源轉(zhuǎn)向酚類生物合成途徑而促進(jìn)生菜中酚類物質(zhì)的積累。當(dāng)土壤中磷肥缺乏時(shí)，油棕葉片中糖類、氨基酸類和有機(jī)酸類物質(zhì)的形成受到干擾，尤其是糖類物質(zhì)[。據(jù)報(bào)道，在低磷條件下，大麥植株中的銨代謝產(chǎn)物顯著積累[]，但也有研究表明，缺磷條件下氨基酸含量降低[12]。田秀英等[3]研究表明，適宜施用鉀肥顯著提高黃花梨葉片葉綠素、可溶性糖、游離氨基酸和可溶性蛋白含量，顯著提高果實(shí)硬度、維生素C含量、可溶性固形物含量和總酸量，顯著降低了葉片丙二醛和果實(shí)硝酸鹽含量，適宜的鉀肥能促進(jìn)黃花梨生長發(fā)育，提高果實(shí)產(chǎn)量和改善品質(zhì)。除了低氮、低磷脅迫外，高氮脅迫也會(huì)影響作物的生長發(fā)育，與正常氮肥處理相比，過量施氮降低了小麥對(duì)活性氧的清除能力，提高了脂質(zhì)過氧化水平，并引起顯著的代謝變化，干擾了氮代謝、次生代謝和脂質(zhì)代謝，導(dǎo)致籽粒灌漿減少[14]。此外，在水培條件下，營養(yǎng)液電導(dǎo)率升高會(huì)顯著影響甜椒的生長和生理反應(yīng)，脯氨酸和可溶性蛋白含量從低電導(dǎo)率處理到高電導(dǎo)率處理逐漸升高[15]。當(dāng)前對(duì)氮、磷、鉀肥單素脅迫影響作物生理代謝的研究已經(jīng)較為深入，然而氮磷鉀三素化肥同時(shí)施用更加符合實(shí)際生產(chǎn)情況，可關(guān)于不同濃度氮磷鉀三素施用對(duì)設(shè)施蔬菜葉片代謝特征影響的研究尚未見詳細(xì)報(bào)道。

鑒于此，筆者以黃瓜為試材，探究氮磷鉀三素化肥同時(shí)減量施用和過量施用對(duì)設(shè)施栽培黃瓜葉片代謝物的影響，明晰黃瓜葉片在氮磷鉀三素化肥脅迫下的反應(yīng)機(jī)制，以期為設(shè)施生產(chǎn)中合理施用化肥和維持設(shè)施產(chǎn)業(yè)綠色健康可持續(xù)發(fā)展提供理論依據(jù)。

1材料與方法

1.1材料

本試驗(yàn)在農(nóng)業(yè)大學(xué)日光溫室內(nèi)進(jìn)行，于2017年和2018年進(jìn)行為期兩年連作4茬的盆栽試驗(yàn)，以購買自天津農(nóng)業(yè)科學(xué)院的黃瓜品種津優(yōu)30為試材。試驗(yàn)所用土壤取自農(nóng)業(yè)大學(xué)溫室后方，過篩混勻后待用。試驗(yàn)土壤的基礎(chǔ)化學(xué)性質(zhì)如下：pH=7.21 ，有機(jī)質(zhì)含量（SOM） （w ，后同） 17.8g?kg^-1 ，速效氮含量（AN） 105mg?kg^-1; 速效磷含量（AP）112.8mg?kg^-1 ，速效鉀含量（A K）121.5mg?kg^-1 0

1.2 試驗(yàn)設(shè)計(jì)

本研究設(shè)4個(gè)施肥處理，分別是不施肥（CF0）、減量施肥（ CF0.5） 、常規(guī)施肥（CF1）和過量施肥（CF2），常規(guī)施肥量參考農(nóng)戶平均施肥量而設(shè)定。其中氮肥使用尿素，磷肥使用磷酸二氫鉀，鉀肥使用硫酸鉀。每個(gè)處理設(shè)置5次重復(fù)，共20盆隨機(jī)擺放。試驗(yàn)開始時(shí)在每個(gè)盆中裝 7kg 風(fēng)干土壤，待黃瓜幼苗長到3葉1心時(shí)定植到盆中，種植20d后進(jìn)行第1次施肥處理，種植50d后進(jìn)行第2次施肥處理，種植70d后進(jìn)行第3次施肥處理，每次施肥量一致。整個(gè)生長期為100d，共施肥3次，化肥施用總量如表1所示。

表1不同水平化肥施用試驗(yàn)中的化肥施用量

Table1 Fertilizerapplicationrateindifferent levels of fertilizer application experiment （kg?hm^-2）

在連作第4茬取樣測定，每個(gè)處理隨機(jī)選取4株黃瓜，在種植90d時(shí)，從黃瓜生長點(diǎn)往下第4片葉取樣，每個(gè)處理隨機(jī)選取4個(gè)樣品。將黃瓜葉片用去離子水洗凈后快速擦干，剪碎后混勻用錫箔紙包裹，立即浸泡在液氮中速凍，然后放置于 -80^°C 的超低溫冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

1.3 方法

1.3.1代謝物提取及測定參考Zhang 等[的方法，取冷凍葉片樣品，研磨成粉末。稱約 60mg 樣品，將其轉(zhuǎn)移到帶有液氮的 1.5mL Eppendorf試管中，向每個(gè)試管中加入 360μL 冷甲醇和 40μL 內(nèi)標(biāo)物（溶于甲醇中的 0.3mg?mL^-12? -氯-1-苯丙氨酸）。在冰水中渦旋 2min 并超聲 30min 后，加入 200μL 氯仿渦旋 1min ，再加入 400μL 水渦旋 1min 并超聲 30min 。然后將試管在 4^°C，13900g 下離心10min 。將每個(gè)試管中約 300μL 的上清液轉(zhuǎn)移到1.5mL 的Eppendorf試管中，真空濃縮并冷凍干燥。在樣品衍生化后，使用與Aglient5977A質(zhì)量選擇性檢測器（AgilentTechnologies股份有限公司，SantaClara，CA）耦合的Agilent7890B氣相色譜系統(tǒng)測定衍生樣品，配備的色譜柱為HP-5MS（ 30m× 0.25mmID×0.25μm. ，安捷倫Jamp;WScientific，F(xiàn)ol-som，CA，USAAgilentTechnologies，SantaClara，CA）。以無分流模式注入 1μL 衍生樣品，恒定氮?dú)饬魉贋?1mL?min^-1 ，界面溫度和離子源溫度分別設(shè)定為 250^°C 和 230^°C 。烘箱初始溫度為 70^°C ，保溫 1min ，以 的速度逐漸升至 76^°C ，保溫5min 后以 5^°C?min^-1 的速度逐漸升至 165^°C ，再以3^°C?min^-1 的速度升至 200^°C ，最后以 7^°C?min^-1 的速度升至 250^°C ，保溫 10min 。

1.3.2代謝物數(shù)據(jù)分析每個(gè)代謝產(chǎn)物的相對(duì)豐度在分析前進(jìn)行內(nèi)標(biāo)歸一化處理，缺失值被認(rèn)為低于檢測極限，用最小化合物值的一半替代。使用MetaboAnalyst 6.0 （https：//www.metaboanalyst.ca/ ）進(jìn)行主成分分析（PCA）、偏最小二乘判別分析（PLS-DA）、正交偏最小二乘判別分析（OPLS-DA）和差異代謝途徑分析[。OPLS-DA分析中，以處理組中 VIPgt;1 且 plt;0.05 的代謝物視為顯著代謝物[8]。差異代謝途徑分析中 pgt;0.1 的通路被認(rèn)為受到明顯干擾[。此外，使用在線網(wǎng)頁（https：//bioinfogp.cnb.csic.es/tools/venny/）繪制Venn圖。

2 結(jié)果與分析

2.1不同施肥量下設(shè)施黃瓜葉片代謝物分析

使用GC-MS在黃瓜葉片中共鑒定出32種代謝物，主要為糖類、氨基酸類和有機(jī)酸類物質(zhì)。根據(jù)主成分分析（PCA）可知，適量施肥和過量施肥下葉片代謝物略有重疊，沿著第一坐標(biāo)軸與不施肥和減量施肥顯著分離（圖1-a）。為了更清晰地顯示不同化肥施用量對(duì)黃瓜葉片差異代謝物的影響，使用偏最小二乘判別分析（PLS-DA）對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行了分析，如圖1-b所示，不施肥和3種不同化肥施用水平的葉片代謝物顯著分離，在第一和第二坐標(biāo)軸上分別解釋總變量的 67.5% 和 7.4% 0

圖1不同施肥量對(duì)設(shè)施黃瓜葉片代謝物影響的PCA分析（a）和PLS-DA分析（b） Fig.1PCAanalysis（a）andPLS-DAanalysis（b）of theeffectsofdiferentfertilizerlevelsonmetabolitesinfacility cucumberleaves

2.2不同施肥量下設(shè)施黃瓜葉片代謝組差異分析

為了進(jìn)一步深入探究減量施肥、過量施肥與適量施肥對(duì)黃瓜葉片代謝組的差異影響，筆者采用正交偏最小二乘判別法（OPLS-DA）分析表明，在減量施肥與適量施肥下代謝物明顯分離（圖2-a），模型分析顯示R2為0.996，Q2為0.890（圖2-b），在過量施肥與適量施肥下代謝物也明顯分離（圖3-a），模型分析顯示R2為0.997，Q2為0.931（圖3-b），所有結(jié)果均未發(fā)生過擬合，這說明模型可靠度高，預(yù)測能力良好。根據(jù)OPLS-DA模型參數(shù)中VIP得分（ VIP?1） 和 t 檢驗(yàn)的 p 值來篩選減量施肥、過量施肥分別與適量施肥 CF0.5νs CF1和CF2vsCF1）之間的差異代謝物。

由圖2-c可知， CF0.5 vsCF1組共篩選出14種差異代謝物，這些差異代謝物分別屬于氨基酸類（甘氨酸、2-氨基己二酸水合物、氨基丁酸、谷氨酸）、糖類（塔羅糖、蔗糖、葡萄糖肟、海藻糖）、有機(jī)酸類（甘油酸、富馬酸、蘋果酸）、酯類[4-（2-氨甲酰-2-氰基-1-甲基乙烯基氨基）苯甲酸乙酯]、醇類（肌醇）和其他類（磷酸）。其中，與適量施肥相比，減量施肥下除了甘氨酸和氨基丁酸的含量上調(diào)外，其余12種差異代謝物含量均為下調(diào)。

注：紅色代表差異代謝物含量上調(diào)，藍(lán)色為下調(diào)。下同。

圖2減量施肥與常規(guī)施肥對(duì)設(shè)施黃瓜葉片代謝物影響的OPLS-DA分析（a）、模型分析（b）和VIP分析（c） Fig.2OPLS-DAanalysis（a），modelanalysis（b），andVIPanalysis（c）oftheeffectsofreducedfertilizationand conventional fertilizationonmetabolitesinfacilitycucumberleaves

Note：Redrepresentsup-regulationofdifferentialmetabolitecontent，whilebluerepresentsdown-regulation.Thesamebelow.

CF2vsCF1組共篩選出16種差異代謝物，這些差異代謝物分別是有機(jī)酸類（琥珀酸、蘋果酸、甘油酸、十八酸）、糖類（左旋葡聚糖、葡萄糖肟、蔗糖）氨基酸類（2-氨基已二酸水合物 ?L? 脯氨酸、哌啶酸、甘氨酸、氨基丁酸）、醇類（肌醇、丙三醇）、酯類[4-（2-氨甲酰-2-氰基-1-甲基乙烯基氨基）苯甲酸乙酯]和其他類（磷酸）。其中，與適量施肥相比，過量施肥下除了甘油酸、左旋葡聚糖、蔗糖的含量顯著下調(diào)外，其余13種差異代謝物含量均為顯著上調(diào)（圖3-c）。

此外，韋恩分析（圖4）表明， CF0.5 vs CF1和CF2vsCF1兩個(gè)對(duì)比組中有10種共有的差異代謝物，分別是甘油酸、蘋果酸、甘氨酸、蔗糖、磷酸、2-氨基己二酸水合物、葡萄糖、氨基丁酸、（2-氨甲酰-2-氰基-1-甲基乙烯基氨基）苯甲酸乙酯、肌醇。CF0.5νs CF1組特有的4種差異代謝物為富馬酸、塔羅糖、海藻糖、谷氨酸。CF2vsCF1組特有的6種差異代謝物為琥珀酸 ?L? -脯氨酸、哌啶酸、左旋葡聚糖、丙三醇、十八酸。

2.3不同施肥量下設(shè)施黃瓜葉片差異代謝物通路分析

通過分析減量施肥和過量施肥下設(shè)施黃瓜葉片內(nèi)代謝通路的變化，探索黃瓜葉片響應(yīng)施肥脅迫的代謝機(jī)制。KEGG富集分析發(fā)現(xiàn)減量施肥下主要干擾丙氨酸、天冬氨酸和谷氨酸代謝，乙醛酸和二羧酸代謝，甘氨酸、絲氨酸和蘇氨酸代謝，丙酮酸代謝，丁酸代謝，谷胱甘肽代謝，酪氨酸代謝途徑（圖5-a）。過量施肥主要擾動(dòng)甘氨酸、絲氨酸和蘇氨酸代謝，乙醛酸和二羧酸代謝，甘油酯代謝，丙酮酸代謝，丁酸代謝，丙氨酸、天冬氨酸和谷氨酸代謝途徑（圖5-b）。在減量施肥和過量施肥下，共同干擾的代謝途徑有甘氨酸、絲氨酸和蘇氨酸代謝，乙醛酸和二羧酸代謝，丙酮酸代謝，丁酸代謝，丙氨酸、天冬氨酸和谷氨酸代謝途徑。這些代謝通路可能與黃瓜響應(yīng)施肥脅迫的代謝機(jī)制密切相關(guān)。

圖3過量施肥與常規(guī)施肥對(duì)設(shè)施黃瓜葉片代謝物影響的OPLS-DA分析（a）、模型分析（b）和VIP分析（c） Fig.3OPLS-DAanalysis（a），modelanalysis（b），andVIPanalysis（c）of theeffctsof excessivefertilizationand conventionalfertilizationonmetabolitesinfacilitycucumberleaves

圖4不同化肥施用量下設(shè)施黃瓜葉片差異代謝物的韋恩圖

Fig.4Venn diagramofdiferentialmetabolitesinfacilitycucumberleaves under diferent fertilizerapplicationrate！

3 討論與結(jié)論

作物響應(yīng)逆境脅迫是一個(gè)非常復(fù)雜的過程，其中代謝的改變是極為重要的調(diào)節(jié)機(jī)制之一。作物調(diào)節(jié)代謝網(wǎng)絡(luò)進(jìn)而產(chǎn)生特定代謝物來抵御逆境脅迫，通過改變相關(guān)代謝通路來實(shí)現(xiàn)對(duì)逆境脅迫的生物防御[9]。當(dāng)前關(guān)于同時(shí)減施氮磷鉀肥對(duì)作物葉片代謝的研究較少，但前人研究發(fā)現(xiàn)，在低磷條件下葉片中大部分糖類含量會(huì)降低，缺磷導(dǎo)致番茄葉片中糖和糖酵解中間體含量下降[20]。減施鉀肥降低浮萍碳水化合物含量，減少次生代謝物的產(chǎn)生[2]。在缺磷條件下，番茄葉片中酮酸、富馬酸和蘋果酸含量顯著降低，檸檬酸含量顯著升高[20。筆者在本研究中發(fā)現(xiàn)，減量施肥下差異代謝物以下調(diào)為主，這與前人在單獨(dú)減施氮、磷、鉀肥的影響研究基本一致[14，20-21]。此外，在減量施肥下顯著上調(diào)的代謝物為甘氨酸和氨基丁酸，這兩種代謝物同屬于氨基酸類，前人發(fā)現(xiàn)，甘氨酸和氨基丁酸在葉片中有維持滲透穩(wěn)態(tài)和提高免疫力的作用[22]。由此猜測，在減施化肥下，甘氨酸和氨基丁酸含量上調(diào)可能與在低養(yǎng)分下通過提高氨基酸含量來維持黃瓜正常生理代謝有關(guān)。

前人采用GC-MS方法表征了7種不同基因型的黑麥草葉片對(duì)3種氮處理（低、中、高氮水平）的代謝反應(yīng)， 24h 后，觀察到氨基酸水平與氮供應(yīng)水平相關(guān)，經(jīng)歷氮限制的植物積累了長鏈脂肪酸和次生芳香代謝產(chǎn)物的前體，而糖水平?jīng)]有受到顯著影響[23]。在磷含量過高的條件下，茶葉中草酸和蘋果酸含量升高[24。本研究發(fā)現(xiàn)，在過量施用氮磷鉀肥下設(shè)施黃瓜葉片差異代謝物的含量以顯著上調(diào)為主，這些代謝物為有機(jī)酸類和氨基酸類物質(zhì)。有機(jī)酸類中顯著上調(diào)的琥珀酸和蘋果酸參與三羧酸循環(huán)過程，這說明過量施肥下黃瓜葉片中三羧酸循環(huán)途徑可能上調(diào)。氨基酸類物質(zhì)可以與酶相互作用，保護(hù)蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)和功能，改善細(xì)胞膜的水環(huán)境，維持膜結(jié)構(gòu)的穩(wěn)定性[25]。氨基酸是作物重要的滲透調(diào)節(jié)物質(zhì)，在植物抗性中起重要作用[2，保護(hù)生物大分子和膜結(jié)構(gòu)免受過量施肥導(dǎo)致的高鹽損害[27]。

在減量施肥和過量施肥下，共同干擾的代謝途徑有甘氨酸、絲氨酸和蘇氨酸代謝，乙醛酸和二羧酸代謝，丙酮酸代謝，丁酸代謝，丙氨酸、天冬氨酸和谷氨酸代謝途徑。這說明施肥脅迫顯著影響設(shè)施黃瓜葉片中的氨基酸代謝和有機(jī)酸代謝途徑。有機(jī)酸代謝物可以提供能量給各種分解和合成代謝途徑的前體物質(zhì)，保障作物在逆境脅迫中維持正常生長發(fā)育[28]。作物在應(yīng)對(duì)非生物脅迫的標(biāo)志性反應(yīng)有氨基酸類代謝物的累積[29。氨基酸代謝途徑在抵御逆境脅迫中也發(fā)揮著非常重要的作用。總之，這些氨基酸和有機(jī)酸代謝途徑的變化與黃瓜響應(yīng)施肥脅迫的代謝機(jī)制密切相關(guān)，在施肥脅迫下黃瓜通過調(diào)控這些代謝途徑來維持正常的生長發(fā)育。

綜上所述，減量施肥和過量施肥脅迫下設(shè)施黃瓜葉片代謝組與適量施肥下有顯著差異。在減量施肥下篩選出14種差異代謝物，其中12種差異代謝物含量顯著下調(diào)，甘氨酸和氨基丁酸含量顯著上調(diào)。在過量施肥下篩選出16種差異代謝物，除了甘油酸、左旋葡聚糖、蔗糖含量顯著下調(diào)外，其他差異代謝物含量均顯著上調(diào)。此外，KEGG富集分析發(fā)現(xiàn)，施肥脅迫下主要擾動(dòng)設(shè)施黃瓜葉片中的氨基酸代謝和有機(jī)酸代謝途徑，黃瓜葉片通過調(diào)控相應(yīng)的代謝途徑來應(yīng)對(duì)施肥脅迫。其中，減量施肥最顯著擾動(dòng)丙氨酸、天冬氨酸和谷氨酸代謝，而過量施肥最顯著擾動(dòng)甘氨酸、絲氨酸和蘇氨酸代謝。

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