葡萄雙生病毒A的序列分析及檢測(cè)

中圖分類號(hào)：S665.1;S436.65 文獻(xiàn)標(biāo)志碼：A文章編號(hào)：1001-4330（2025）04-0887-07

摘要：【目的】研究新疆吐魯番市葡萄雙生病毒A（Grapevine geminivirus A）的田間侵染狀況，檢測(cè)采集71份疑似葡萄病毒樣本，為明確葡萄雙生病毒A的發(fā)生、分布及其分子檢測(cè)提供理論指導(dǎo)?！痉椒ā恳罁?jù)高通量測(cè)序結(jié)果，驗(yàn)證樣本中葡萄雙生病毒A，測(cè)定GGVA的全基因序列，以葡萄雙生病毒A的全基因序列為靶標(biāo)設(shè)計(jì)特異性引物進(jìn)行疑似葡萄病毒樣本的檢測(cè)。【結(jié)果】測(cè)定GGVA的全基因組序列，獲得GGVA-QKT分離株，其核苷酸同源性為 94.3%～99.3% ，與已公布的分離株具有高度同源性，其中與來自以色列（KX618694.1）、（NC_031340.1）的2個(gè)GGVA分離株親緣關(guān)系最近?！窘Y(jié)論】71份不同葡萄樣本均有感染雙生病毒A，其中，新疆鄯善縣檢出率最高，檢出率為 30.55% ，新疆托克遜縣檢出率最低，檢出率為 9.10% 。該病毒在新疆吐魯番市葡萄種植區(qū)普遍發(fā)生。

0 引言

【研究意義】葡萄（Vitisspp.）是世界四大水果之一，由于多年的無性繁殖、苗木流轉(zhuǎn)等多導(dǎo)致葡萄中存在多種病原體，葡萄病毒普遍發(fā)生[1]。目前，世界已報(bào)道超過86種病毒[2，我國(guó)已報(bào)道22 種葡萄病毒[3]。在葡萄藤上發(fā)現(xiàn)多種DNA 病毒[4]，如葡萄清靜脈病毒（GVCV）[5]、葡萄葉變色相關(guān)病毒（GRLDaV）、葡萄紅斑病毒（ GRBaV ）[7，8.9]和葡萄雙生病毒A（GrapevinegeminivirusA，GGVA）[10]。而葡萄雙生病毒從最初被檢測(cè)到，陸續(xù)在多個(gè)國(guó)家和地區(qū)報(bào)道[11-14]在我國(guó)云南、山東、遼寧、四川、新疆等?。▍^(qū)）均有發(fā)現(xiàn)[1.5.6]。雙生病毒（GGVA）屬于雙生病毒科Maldovirus屬的成員，基因組為環(huán)狀單鏈DNA（ssDNA），被包裹在一對(duì)不完全二十面體中，可通過感染寄主細(xì)胞中的雙鏈DNA（dsDNA）中間體復(fù)制[7]。其全基因組序列長(zhǎng)度為 2903～2907 bp，具有一個(gè)保守的莖環(huán)序列“TAATATTAC”，正義鏈上有2個(gè)開放閱讀框（ORF）（V1，外殼蛋白；V2，推定運(yùn)動(dòng)蛋白），負(fù)補(bǔ)鏈上有四個(gè)開放閱讀框（ORF），（C1，復(fù)制相關(guān)蛋白；C2，轉(zhuǎn)錄激活蛋白；C3，復(fù)制增強(qiáng)子;C4，宿主激活蛋白）[10]。葡萄雙生病毒A是近幾年報(bào)道的葡萄DNA病毒，研究發(fā)現(xiàn)，該病毒屬于潛隱性病毒，多數(shù)在無癥狀的葡萄葉片檢測(cè)出?！厩叭搜芯窟M(jìn)展】范旭東等[\"]在引進(jìn)的栽培葡萄品種‘夏季黑’上發(fā)現(xiàn)該病毒，且發(fā)生普遍;孫蘇偉等[15]在云南葡萄種植區(qū)發(fā)現(xiàn)雙生病毒（GGVA）并進(jìn)行基因組序列分析;趙小春[16]在新疆葡萄種植區(qū)發(fā)現(xiàn)葡萄雙生病毒（GGVA）；田沂民等[18]對(duì)葡萄雙生病毒進(jìn)行傳毒介體檢測(cè)鑒定相關(guān)研究?！颈狙芯壳腥朦c(diǎn)】關(guān)于吐魯番市葡萄雙生病毒A的檢測(cè)相關(guān)報(bào)道較少，而在新疆吐魯蕃市采集疑似病毒樣本中，通過混樣測(cè)序發(fā)現(xiàn)葡萄雙生病毒A，需明確吐魯番市葡萄雙生病毒A田間侵染情況。【擬解決的關(guān)鍵問題】采集吐魯番市主要葡萄種植區(qū)疑似葡萄病毒樣品材料并低溫保存，對(duì)采集的71份疑似病毒病樣品進(jìn)行PCR檢測(cè)，并進(jìn)行序列鑒定及系統(tǒng)進(jìn)化分析。提取葡萄植株中總DNA并進(jìn)行PCR檢測(cè)，對(duì)擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行序列測(cè)定并在GeneBank中進(jìn)行序列比對(duì)，分析吐魯番市葡萄雙生病毒A田間發(fā)生情況，為明確我國(guó)葡萄雙生病毒A的發(fā)生、分布及其分子檢測(cè)提供理論依據(jù)。

材料與方法

1.1 材料

1.1.1 供試葡萄

于2022年6月以吐魯番市葡萄種植區(qū)為調(diào)查區(qū)域，對(duì)3個(gè)葡萄種植區(qū)進(jìn)行疑似病毒樣本的采集，共71份，將采集的樣品進(jìn)行表面清洗并放在攜帶的液氮罐里，注明采集日期、品種名稱及編號(hào)，樣本帶回實(shí)驗(yàn)室置于 -80% 冰箱保存、備用。表1，圖1

Notes：A、B、C：Suspected grape virus disease symptoms leaf；D： Healthyleaf

1. 1.2 主要儀器與試劑

儀器：超低溫冰箱（青島海爾公司）、超凈工作臺(tái)、PCR儀（美國(guó)伯樂公司）電泳儀、凝膠成像系統(tǒng)（上海嘉鵬公司）、恒溫水浴鍋、臺(tái)式智能精密搖床、高速臺(tái)式冷凍離心機(jī)等。

試劑：總DNA提取試劑盒DNAsecure新型植物基因組DNA提取試劑盒購(gòu)自天根公司； 2×Es.

TaqMasterMix（Dye）購(gòu)自康為世紀(jì)公司；Marker（DNAMarkerII、DL200O）購(gòu)自北京全式金公司、pUCm-T克隆載體、DH5a感受態(tài)、凝膠回收試劑盒等購(gòu)自上海生工公司。

1.1. 3 供試引物

依據(jù)高通量測(cè)序結(jié)果，通過NCBI對(duì)比分析后，參照相似性最高的GGVA全基因組序列，以其

為靶標(biāo)，利用Primer5.0軟件設(shè)計(jì)（ F^2* 和 R^2* ）GG-VA-F（5’-ACCATGTCTGAGGGTAAGGC-3'和GGVA -R（5’ -GGAGTCAATTGGAACGTGCG -

3）特異性檢測(cè)引物和擴(kuò)增全長(zhǎng)基因組引物，并在NCBI數(shù)據(jù)庫中進(jìn)行特異性引物比對(duì)，預(yù)計(jì)產(chǎn)物片段大小為 329bp ，引物均有由上海生工合成。表2

表2供試引物

1.2 方法

1. 2.1 總DNA提取

參考DNAsecure新型植物基因組DNA提取試劑盒說明書，提取71份樣本總DNA，進(jìn)行電泳檢測(cè)其完整性，并保存于 -80^°C 冰箱備用。

1.2.2 高通量測(cè)序

將采集的疑似葡萄病毒樣本混合，送往公司在IlluminaHiseq高通量測(cè)序平臺(tái)檢測(cè)，確認(rèn)RNA的純度（ 0D_260/280 ）、濃度、核酸吸收峰與RNA的完整性是否正常；樣品檢測(cè)合格后，通過試劑盒去除rRNA，進(jìn)行文庫的構(gòu)建；文庫構(gòu)建后，檢測(cè)文庫質(zhì)量，通過不同文庫按照目標(biāo)下機(jī)數(shù)據(jù)量進(jìn)行poo-ling，用IlluminaHiSeq平臺(tái)進(jìn)行測(cè)序分析;測(cè)序最終得到原始數(shù)據(jù)，處理原始數(shù)據(jù)，處理后進(jìn)行測(cè)序數(shù)據(jù)質(zhì)量的控制，得到有效數(shù)據(jù)。最后，進(jìn)行有效數(shù)據(jù)轉(zhuǎn)錄本拼接和組裝，拼接完成后得到Nr數(shù)據(jù)庫和CDS預(yù)測(cè)序列;將Nr數(shù)據(jù)庫進(jìn)行Taxonomic分析，得到未注釋序列和病毒序列信息；基于病毒序列進(jìn)行組裝分析，獲得完整的病毒種類信息，對(duì)于未注釋的序列信息，進(jìn)行dsRNA預(yù)測(cè)分析，獲得RNA病毒和類病毒的序列信息[16，19，20]

1.2.3 PCR擴(kuò)增

根據(jù)（ F^2* 和 R^2* ）的引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增，PCR反應(yīng)體系為 25μL 2×Es Taq MasterMix（Dye） 12.5μL ，正反引物（ 10μmol/L ）各 1μL cDNA模板 2μL ， RNase free ddH₂O 補(bǔ)平 25μL PCR擴(kuò)增條件： 94°C 5min;94°C 3min，55°C 45s ，72°C 1min，35 個(gè)循環(huán)： 72%10min 。PCR擴(kuò)增產(chǎn)物在 1.5% 瓊脂糖 1×TAE 緩沖系統(tǒng)中電泳，每孔加樣 5μL ，用凝膠成像系統(tǒng)觀察并攝影記錄。

1.2.4PCR產(chǎn)物測(cè)定及序列

將PCR擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行回收，具體步驟參考瓊脂糖凝膠DNA回收試劑盒說明書。經(jīng)過連接、純化DNA，連接至 克隆載體，轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5a，獲得陽性克隆，測(cè)序由上海生工完成。測(cè)序結(jié)果利用DNAman軟件進(jìn)行拼接；通過登錄NCBI利用BLAST檢索功能進(jìn)行序列同源性分析，使用SnapGene軟件進(jìn)行序列分析，采用MEGA11軟件構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹（neighbor joining，NJ，Bootstrap重復(fù)次為1000）。

1. 2.5 GGVA全長(zhǎng)基因組序列鑒定

通過NCBI對(duì)比分析后，參照相似性最高的韓國(guó)分離物jaok-vf-1全基因組序列（登錄號(hào)：MF163263）設(shè)計(jì)引物，分段擴(kuò)增GGVA全長(zhǎng)基因組序列。PCR反應(yīng)體系為（ 25μL ）： 2×Es Taq MasterMix（Dye） 12.5μL ，正反引物（ 10μmol/L ））各 1μL ，DNA 模板 2μL ，RNase free ddH₂O 補(bǔ)平25μL ;PCR反應(yīng)條件： 94°C 5min，94°C 30s，55°C 電 30s，72%1min，72%10min，35 個(gè)循環(huán)。 1.5% 瓊脂糖凝膠電泳，凝膠成像，經(jīng)過連接、純化DNA，連接至 克隆載體，轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5a，獲得陽性克隆，測(cè)序由上海生工公司完成，為確保送測(cè)的準(zhǔn)確性，至少送測(cè)3個(gè)陽性克隆樣品進(jìn)行測(cè)序。

2 結(jié)果與分析

2. 1 高通量測(cè)序結(jié)果

研究表明，共得到5種葡萄病毒序列，其中在一個(gè)未知屬中有4個(gè)未知contigs，包含3588條Reads，將得到的contig通過NCBI進(jìn)行序列比對(duì)；有1個(gè)contigs與已報(bào)道的葡萄雙生病毒A有較高的匹配度，其長(zhǎng)度為 586～2058bp ，與已公布的雙生病毒（GGVA）的序列同源性有 94.87% ＼～99.73% 。表3

2.2 引物的擴(kuò)增驗(yàn)證

研究表明，所有目的條帶與空白對(duì)照均正常，特異性引物檢測(cè)條帶約為 329bp ，而擴(kuò)增條帶與目的帶存在偏差，后期測(cè)序結(jié)果證實(shí)，特異性引物擴(kuò)增的 500bp 條帶也為目的基因序列。與美國(guó)分離株（ KX570608.1，KX618694.1） 、印度分離株（OQ427641.1）相似性為 95.1%～99% ，所測(cè)序列與公布序列具有高度同源性，所檢測(cè)病毒及類病毒種類與公布的種類相同。圖2

注：A：病毒的部分PCR檢測(cè)；B：PCR的擴(kuò)增；M：marker;CK：陰性對(duì)照Notes：A：Part of the virus PCR detection；B：PCR amplification；M：marker；CK：Negative control

2.3 GGVA分離物全基因組序列

研究表明，該病毒序列含有6個(gè)ORF，分別編碼6種蛋白，ORF1編碼1個(gè)長(zhǎng)度為 312nt （313～624bp 的 Pre-CP/V2 ;ORF2編碼1個(gè)長(zhǎng)度為771nt（446～1216bp） 的CP/V1;ORF3編碼1個(gè)長(zhǎng)度為 429nt（1213～1641bp） 的 Ren/C3 ; ORF4編碼1個(gè)長(zhǎng)度為 的TrAP/C2;ORF5編碼1個(gè)長(zhǎng)度為 1221nt（1683 ～2903bp 的 Rep/Cl 。ORF6編碼1個(gè)長(zhǎng)度為 的HAP/C4。GGVA-QKT分離株與已報(bào)道的分離株全基因組核苷酸同源性為 94.3%～99.3% ，所測(cè)序列與公布的種類相同。獲得新疆分離株與已公布分離株具有高度同源性，且沒有顯著差異，該病毒不存在地域分布規(guī)律。圖3

2.4 GGVA分離物的系統(tǒng)進(jìn)化

研究表明，供試的全基因組序列分離物共分為3個(gè)大組，獲得的（中國(guó)新疆吐魯番市鄯善縣）七克臺(tái)分離株與日本（KX570616.1）、（KX570615.1）、（KX570612.1）、（KX570613.1）、（LC424098.1）、匈牙利（KX570618.1）、新西蘭（MK690474.1）、中國(guó)（KX950822.1）、（MT344710.1）、（MT344704.1）、（MT344706.1）、（MT344712.1）、以色列（KX618694.1）、（NC_031340.1）、韓國(guó)（KX570607.1）等的GGVA分離株聚為一支，且與來自以色列（KX618694.1）、（NC_031340.1）的2個(gè)GGVA分離株親緣關(guān)系最近；來自中國(guó)（MT344703.1）、（MT344713.1）、（KX570611.1）、日本（KX570610.1）、韓國(guó)（MK336184.1）、中國(guó)新疆（ON868755.1）的GG-VA分離株聚為一支；與來自中國(guó)（KX574323.1）、韓國(guó)（KX570609.1）、（KX570614.1）的GGVA分離物聚為一支。圖3

2.5 葡萄樣本的PCR檢測(cè)

研究表明，71份不同地區(qū)樣本均有感染葡萄雙生病毒（GGVA），其中，善縣檢出率最高，檢出率為 30.55% ;其次是吐魯番市高昌區(qū)，檢出率為 20.83% ；托克遜縣檢出率最低，為 9.10% ，該病毒在吐魯番葡萄種植區(qū)發(fā)生普遍。表4

3討論

3.1該病毒是在鮮食葡萄上通過深度測(cè)序技術(shù)篩查發(fā)現(xiàn)的葡萄新病毒[10]；Jo等[12]在多個(gè)葡萄品種中首次檢出該病毒;其后，范旭東等[\"在多地葡萄園進(jìn)行調(diào)查時(shí)，發(fā)現(xiàn)普通栽培品種和引進(jìn)栽培品種夏季黑攜帶GGVA，且發(fā)生普遍，而在本地栽培品種未發(fā)現(xiàn)GGVA。

3.2研究測(cè)定了GGVA的全基因組序列，并進(jìn)行序列相似性分析，雙生病毒（GGVA-QKT）分離株核苷酸同源性為 94.3%～99.3% ，與已公布分離株具有高度同源性，其中與來自以色列（KX618694.1）（NC_031340.1）的2個(gè)GGVA分離物親緣關(guān)系最近。通過對(duì)采集的71份疑似病毒樣本進(jìn)行PCR檢測(cè)。結(jié)果表明，71份不同地區(qū)樣品感染均有感染雙生病毒（GGVA），其中，善縣檢出率最高，檢出率為 30.55% ；其次是高昌區(qū)，檢出率為 20.83% ；托克遜縣檢出率最低，為9.10% ，從檢測(cè)結(jié)果表明，該病毒在吐魯番葡萄種植區(qū)發(fā)生非常普遍，可見葡萄雙生病毒（GGVA）在新疆已廣泛分布。

3.3葡萄雙生病毒A可侵染木本植物和草本植物，如已報(bào)道的柑橘褪綠矮縮相關(guān)病毒（CCDaV）[21]、麻風(fēng)樹花葉病毒（JaMV）[22]、桑樹花葉矮縮相關(guān)病毒病毒（MMDaV）[23]等。雙生病毒（GGVA）為典型的蟲傳病毒，主要傳毒介體為粉虱、葉蟬等，田沂民等利用PCR或RT-PCR方法在粉虱、薊馬、狹領(lǐng)紋唇盲蝽、菊方翅網(wǎng)蝽、蚜蟲和寡脈蠅等6種昆蟲體內(nèi)均檢出GGVA。而薊馬、狹領(lǐng)紋唇盲蝽、菊方翅網(wǎng)蝽、寡脈蠅未見相關(guān)研報(bào)道證明是否傳毒，幾種昆蟲是否傳毒以及傳毒特點(diǎn)需要進(jìn)一步研究。

4結(jié)論

對(duì)吐魯番市采集的71份樣品進(jìn)行PCR檢測(cè)，共檢測(cè)出17份陽性樣品，檢出率為 23.94% ;以鄯善縣、高昌區(qū)檢出率較高，托克遜縣檢出率較低；測(cè)定GGVA的全基因組序列，其核苷酸同源性為94.3%～99.3% ，與來自以色列（KX618694.1、NC_031340.1）的2個(gè)GGVA分離物親緣關(guān)系最近。

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Abstract：【Objective】 This project aims to determine the field infection status of Grapevine Geminivirus A in Turpan City，Xinjiang.【Methods】71 suspected grape virus samples were collected and detected and according to the results of high -throughput sequencing，the existence of grapevine geminivirus A in the sample was verified，and the whole gene sequence of GGVA was determined. The whole gene sequence of grapevine geminivirus A was used as the target to design specific primers for the detection of suspected grape virus samples.【Results】 The whole genome sequence of GGVA was determined，and GGVA -QKT isolates were obtained，with nucleotide identity of 94.3%-99.3% ，and published isolates were highly homologous，among which，they were closely related to two GGVA isolates from Israel（KX618694.1） and（NC - 031340.1） . 【Conclusion】71 diffrent parts of the grape samples were Grapevine geminivirus A，71 grape samples from diferent regions were infected with Grapevine geminivirus A.among them， Shanshan County，Xinjiang had the highest detection rate 30.55% ，while Tokson County，Xinjiang had the lowest detection rate 9.10% . The virus was very common in the grape growing area of Turpan County，Xinjiang.In thisstudy，the field infection status of Grapevine geminivirus A in Turpan City is detected.

Key words：grape virus；DNA virus;sequence analysis;detection