一株產(chǎn)胞外蛋白酶嗜鹽古菌的分離、鑒定及其基本酶學(xué)性質(zhì)

前言

嗜鹽微生物是一類生長于鹽湖、鹽礦和高鹽食品等高鹽環(huán)境，通過在胞內(nèi)積累高濃度的鹽離子或有機(jī)相容性溶質(zhì)來適應(yīng)高鹽環(huán)境的極端微生物[1]。嗜鹽微生物包括古菌、細(xì)菌和真核生物，而嗜鹽古菌和嗜鹽細(xì)菌占主導(dǎo)地位[2]。2019年，陳禮楠等研究發(fā)現(xiàn)在安徽定遠(yuǎn)采集的鹽礦中分離到的部分嗜鹽古菌具有產(chǎn)胞外蛋白酶的功能[3]。蛋白酶是一類在蛋白質(zhì)水解中發(fā)揮功能的酶的統(tǒng)稱，在整個(gè)生物體代謝過程中起著重要作用[4]。

嗜鹽微生物分泌的胞外蛋白酶具有在水分含量較低的環(huán)境下，包括在高鹽濃度和有機(jī)溶劑的環(huán)境中[5，依舊保持活性且作用穩(wěn)定的性質(zhì)[6]。經(jīng)研究發(fā)現(xiàn)，嗜鹽微生物的蛋白酶表面富含多種酸性氨基酸[7]。酸性氨基酸具有水合羧基和與水親和的功能，使得在蛋白周圍形成封閉的水化層來保護(hù)高鹽環(huán)境中的蛋白酶活性[8]。嗜鹽微生物分泌的酶中包含較多的鹽橋和氫鍵結(jié)構(gòu)，這些結(jié)構(gòu)可以提高其分泌的蛋白酶在水分含量較低的環(huán)境中的耐受性和溶解度[9]。此外，在其分泌的蛋白酶中包含一些特異的結(jié)合位點(diǎn)及以低聚體形式存在的蛋白，這種特點(diǎn)在一定程度上可以對嗜鹽微生物分泌的胞外蛋白酶起到保護(hù)作用[10]。

隨著工業(yè)上對能在極端環(huán)境中依舊保持活性的蛋白酶的需求逐漸增加以及人們對極端環(huán)境的進(jìn)一步研究，嗜鹽微生物胞外蛋白酶的相關(guān)研究也逐漸增多，細(xì)菌和古菌的胞外蛋白酶分別在食品加工、制革工業(yè)和廢水處理等方面都具有廣泛的應(yīng)用價(jià)值[-1]。2016年，呂欣然等人從市場上購買的錦州蝦醬中分離產(chǎn)胞外蛋白酶嗜鹽菌株，分析了菌體內(nèi)可溶性蛋白的變化，發(fā)現(xiàn)從蝦醬中分離得到的可培養(yǎng)菌株及其分泌的酶會(huì)在發(fā)酵過程中產(chǎn)生影響，發(fā)酵物中的蛋白質(zhì)在嗜鹽古菌及其分泌的酶的相互作用下會(huì)被進(jìn)一步降解為多肽類、氨基酸等小分子物質(zhì)，即影響風(fēng)味的以寡肽和低聚肽形式存在的前體物質(zhì)，這在一定程度上為增添風(fēng)味奠定基礎(chǔ)[14]。Bacilluscrolab MTCC 5468分泌的堿性蛋白酶在皮革生產(chǎn)再水化中應(yīng)用后減水量達(dá) 66.6% 左右，浸泡時(shí)間縮短約 50% ，有害脫毛化學(xué)品的使用量控制在 50%～60% 的范圍，從而消除了預(yù)制過程中的軟化操作[15]。2023年，Kokwe等人發(fā)現(xiàn) Bacilus sp.NFH5的熱活性金屬角蛋白酶（KerBNK1）在生物去除頑固角質(zhì)以及廢物水解蛋白方面具有一定的作用，研究發(fā)現(xiàn)該角蛋白酶的最適pH和溫度分別為8.0和 90^°C ，具有顯著的pH和熱穩(wěn)定性，且活性受到EDTA和1，10-菲咯啉的抑制，表明其是一種金屬角蛋白酶，作者通過優(yōu)化該菌生產(chǎn)角蛋白酶的條件來提高產(chǎn)酶使其更好的應(yīng)用于洗滌劑工業(yè)生產(chǎn)中[16]。

目前，對于產(chǎn)胞外蛋白酶嗜鹽微生物，尤其是產(chǎn)胞外蛋白酶嗜鹽古菌的研究較少、不夠深入，已知產(chǎn)胞外蛋白酶的嗜鹽古菌仍不到20個(gè)[17]。工業(yè)對高鹽環(huán)境中依舊保持活性的蛋白酶需求較大，而在高鹽環(huán)境中有較高活性的嗜鹽古菌的胞外蛋白酶投入商業(yè)卻很少。本研究從高鹽環(huán)境如鹽漬海帶中篩選產(chǎn)胞外蛋白酶嗜鹽古菌菌株，并對其所產(chǎn)的胞外蛋白酶活性進(jìn)行探究。這將為進(jìn)一步分離純化在工業(yè)廢水、食品等行業(yè)中具有特殊應(yīng)用價(jià)值的極端酶資源奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 培養(yǎng)基

嗜鹽微生物分離所用NOM寡營養(yǎng)培養(yǎng)基[18-19] （g/L） ：酵母粉0.05，魚蛋白脈0.25，丙酮酸鈉 1.0，KCl5.4 ，NH4C1 0.27，CaCl 0.29， MgSO₄ 7H₂O 26.8， MgCl₂ 6H₂O 23.0，NaCl184.0和 K₂HPO₄2.0 。用 1mol/LNaOH 調(diào)節(jié)pH至 7.5，121^°C 滅菌 20min 。如制備固體培養(yǎng)基，則在滅菌前加入瓊脂粉 12.0g/L 。

分離培養(yǎng)基：用脫脂奶粉在無菌玻璃容器配制 10%（w/v） 的脫脂牛奶，置于沸水浴中煮 30min ;待固體NOM培養(yǎng)基冷卻至 60^°C～65^°C ，以 10mL 脫脂牛奶/ 100mL NOM培養(yǎng)基的量加入，搖勻后，倒平板 20mL/ Ⅲ），制作固體牛奶N(yùn)OM培養(yǎng)基。

1.2樣品采集及產(chǎn)酶菌株篩選

鹽漬海帶樣品購于安徽省蕪湖市世紀(jì)聯(lián)華超市。將樣品表面的鹽霜在超凈工作臺(tái)中收集于一無菌50mL離心管中，加入 5mL 無菌的 20%（w/v）NaCl 溶液，在旋渦混合器上充分溶解鹽霜。以此為原液，用無菌的 20%NaCl 溶液進(jìn)行稀釋梯度。各吸取吸 200μL 的 10^-1，10^-2 和 10^-3 的梯度稀釋溶液，涂布于NOM牛奶平板上，封口膜封口后置于 37^°C 恒溫培養(yǎng)箱中倒置培養(yǎng)。培養(yǎng)7天后，挑取產(chǎn)透明圈較大的單菌落至新的NOM牛奶平板上劃線，進(jìn)一步分離純化，得到純培養(yǎng)物。

1.3 PCR擴(kuò)增

1.3.1模板DNA的制備用無菌牙簽取適量的菌體于 50μL 無菌水中，吹打混勻，作為PCR擴(kuò)增的模板。

1.3.2PCR擴(kuò)增引物嗜鹽古菌16SrRNA基因擴(kuò)增通用引物：F8（ 5^′ -TTGATCCTGCCGGAGGCCATTG-3'和R1462（ 5^′ ATCCAGCCGCAGATTCCCCTAC-3）[20]。

1.3.3PCR擴(kuò)增的體系和程序PCR反應(yīng)體系（ 50μL） 包括： 2×PCR Mix（翌圣生物科技股份有限公司）25.0μL ，引物 ，引物R1462 2.5μL ，DNA模板 2.0μL ，無菌水 18.0μL 。PCR反應(yīng)程序包括： 95^°C 預(yù)變性 5min ；循環(huán)體（ 95^°C 變性30s， 54^°C 退火 延伸 2min ，循環(huán)35次）和 72^°C 循環(huán)體外延伸10min 。 1%%（w/v） 瓊脂糖凝膠電泳檢測PCR產(chǎn)物，將成功擴(kuò)增的PCR產(chǎn)物送通用生物系統(tǒng)（安徽）有限公司進(jìn)行DNA測序。

1.416SrRNA基因序列相似性及系統(tǒng)發(fā)育分析

用BioEdit軟件對測序峰圖結(jié)果進(jìn)行分析，去除測序結(jié)果兩端具有多重峰段的序列，利用SeqMan軟件[2]對序列進(jìn)行拼接和組裝。將拼接后的16S rRNA基因序列在BLAST（htps：/last.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi）

中進(jìn)行同源性搜索分析，根據(jù)同源性搜索結(jié)果初步確定菌株的分類地位。

根據(jù)BLAST同源性搜索結(jié)果，從GenBank中下載同屬其他已報(bào)道物種的16SrRNA基因序列，以Metha-nospirillum hungatei JF-1為外類群，使用BioEdit[22]中嵌人的ClustalW進(jìn)行多序列比對。將多序列比對結(jié)果導(dǎo)人MEGA7[23]，構(gòu)建基于最大似然法（Maximum Likelihood，ML）、最大簡約法（Maximum Parsimony，MP）和鄰接法（Neighbor-Joining，NJ）[24]三種算法的系統(tǒng)發(fā)育樹，揭示菌株在屬內(nèi)的系統(tǒng)發(fā)育關(guān)系。

1.5 胞外蛋白酶活性檢測

1.5.1粗酶液制備挑取單菌落，接入 pH8.0 的NOM液體培養(yǎng)基， 37^°C 振蕩培養(yǎng) 10d，5，000r/min 離心10min收集上清。利用截留分子量為 10，000Da 膜包（SartoriusVIVAFLOW50，MWCO： 10，000Da 進(jìn)行切向流濃縮，將上清（粗酶液）濃縮20倍。

1.5.2蛋白酶活力測定參照福林酚法[25]，稱取 2mgL -酪氨酸溶解在 2mL 的無菌水中，以此為標(biāo)準(zhǔn)溶液分別稀釋成 0.0，10.0，20.0，30.0，40.0 和 50.0μg/100mL ；取 200μL 稀釋液（3次平行），分別加入 1mL 的 0.4M 碳酸鈉溶液和 200μL 福林酚試劑， 40^°C 顯色 20min ;在離心管于 12，000r/min 離心 10min 后，取上清液放置在 680nm 處測定吸光度;將粗酶液與酪蛋白混合作為空白組的反應(yīng)體系調(diào)零，分別測定不同濃度的吸光值。酶活力單位定義為 1mL 酶液在 50^°C 和 pH8.0 的條件下，每分鐘水解酪蛋白產(chǎn)生 1μg 酪氨酸為一個(gè)酶活力單位，以U表示。以測量品的濃度為橫坐標(biāo)，吸光度值為縱坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。

1.6胞外蛋白酶學(xué)性質(zhì)研究

1.6.1胞外蛋白酶的最適反應(yīng)溫度取 100μL 粗酶液，加入 100μL 酪蛋白溶液（3次平行）作為實(shí)驗(yàn)組，分別在 4^°C，30^°C，35^°C，40^°C，45^°C，50^°C，55^°C，60^°C，65^°C，70^°C 和 75^°C 反應(yīng) 30min ，加入 200μL 三氯乙酸終止體系，測定 OD₆₈₀ 。以粗酶液先加三氯乙酸，再在相應(yīng)的條件下處理同樣的時(shí)間為對照組。

1.6.2熱穩(wěn)定性取 100μL 粗酶液，加入 100μL 酪蛋白溶液（3次平行）作為實(shí)驗(yàn)組，在 35^°C，45^°C 和 55^°C 分別反應(yīng)20、40和 60min 后，加人 200μL 三氯乙酸終止體系，測定 OD₆₈₀ 。對照組設(shè)置同上。

1.6.3最適反應(yīng)pH用 200mmol/L 乙酸-乙酸鉀調(diào)節(jié)粗酶液的 pH 至4.0和5.0；用MES緩沖液調(diào)節(jié)粗酶液pH至6.0;用MOPS緩沖液調(diào)節(jié)粗酶液的 pH 至7.0;用Tris緩沖液調(diào)節(jié)粗酶液 pH 調(diào)至8.0;用CHES緩沖液調(diào)節(jié)粗酶液 pH 至9.0和10.0（粗酶液的鹽濃度均為 3M 。緩沖液的濃度均為 50mmol/L ）。各取不同pH 值的粗酶液 100μL ，分別加入 100μL 酪蛋白溶液（3次平行）作為實(shí)驗(yàn)組，在 45^°C 水浴反應(yīng) 30min ，再分別加入 200μL 三氯乙酸終止體系，測定 OD₆₈₀ 。對照組設(shè)置同上。

1.6.4酸堿穩(wěn)定性用上述pH調(diào)至 6.0，8.0，10.0 的粗酶液進(jìn)行酸堿穩(wěn)定性實(shí)驗(yàn)（鹽濃度均為 3M ）。各取100μL 不同pH的粗酶液，加入 100μL 酪蛋白溶液（3次平行）作為實(shí)驗(yàn)組，在 45^°C 水浴反應(yīng)20、40和 60min 加入 200μL 三氯乙酸終止體系，測定 OD₆₈₀ 。對照組設(shè)置同上。

1.6.5NaCl濃度對胞外蛋白酶活力的影響取 100μL 粗酶液，加入 100μL 酪蛋白溶液（3次平行）作為實(shí)驗(yàn)組，分別在NaCl濃度為 0.5、1.0、1.5、2.0、2.5 和 3.0M 后在 45^°C 水浴反應(yīng) 30min ，加入 200μL 三氯乙酸終止體系，測定 OD₆₈₀ 。對照組設(shè)置同上。

1.6.6胞外蛋白酶的鹽穩(wěn)定性取 100μL 粗酶液，加入 100μL 酪蛋白溶液（3次平行）作為實(shí)驗(yàn)組，分別在NaCl 濃度為1、2和 3M 分別后置于 45^°C 水浴反應(yīng)20、40和 60min 加入 200μL 三氯乙酸終止體系，測定OD₆₈₀ 。對照組設(shè)置同上。

1.6.7金屬離子對蛋白酶酶活的影響取 100μL 粗酶液，加入 100μL 酪蛋白溶液（3次平行）作為實(shí)驗(yàn)組，分別加入 2μL 終濃度為 5mmol/L 的 Ca²⁺（CaCl₂?2H₂O）?Mn²⁺（MnCl₂?4H₂O）?Cu²⁺（CuSO₄?5H₂O）?KCl?Mg²⁺（Mg-m²⁺6H₂O）?（Δ（OH））² SO₄?7H₂O）?Fe²⁺（FeSO₄?7H₂O）?Zn²⁺（ZnSO₄?7H₂O） 溶液后在 45^°C 反應(yīng) 20min 后加入 200μL 三氯乙酸終止體系測定 OD₆₈₀ 。對照組設(shè)置同上。

1.6.8蛋白酶抑制劑對蛋白酶酶活的影響取 100μL 粗酶液，加入 100μL 酪蛋白溶液（3次平行）作為實(shí)驗(yàn)組，分別加入 1μL 終濃度為 1mmol/L 的EDTA溶液 、4mmol/L 的PMSF溶液后在 45^°C 反應(yīng) 20min 后加入200μL 三氯乙酸終止體系測定 OD₆₈₀ 。對照組設(shè)置同上。

1.6.9PMSF對蛋白酶水解活性的影響將 100μL 粗酶液與 100μL PMSF（ 4mmol/L 混勻后在 45^°C 反應(yīng)30min 再滴于培養(yǎng)基孔內(nèi)， 37^°C 下培養(yǎng) 12h 觀察是否有水解透明圈出現(xiàn)。取 100μL 粗酶液滴于NOM-牛奶培養(yǎng)基所打孔徑中， 37^°C 下培養(yǎng)12h作為陽性對照。

2結(jié)果

2.1 PRR-65菌株的分離與鑒定

利用NOM固體牛奶培養(yǎng)基進(jìn)行產(chǎn)胞外蛋白酶嗜鹽古菌的分離（圖1a）。從NOM固體牛奶平板上挑取產(chǎn)胞外蛋白酶活性最強(qiáng)的菌株，劃線分離，從而獲得純化的產(chǎn)胞外蛋白酶嗜鹽菌株，將其命名為PRR-65（圖1b）。利用F8/R1462引物對PRR-65菌種的16SrRNA基因進(jìn)行擴(kuò)增后進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳檢測，得到了約1500bp的PCR產(chǎn)物，說明PRR-65菌種的16SrRNA基因擴(kuò)增成功（圖1c）。將上述PCR產(chǎn)物送滁州通用生物科技有限公司進(jìn)行DNA測序。

將拼接后的16SrRNA基因序列在NCBI網(wǎng)站上使用BLAST工具進(jìn)行同源性搜索分析，結(jié)

果顯示PRR-65菌株的16S rRNA基因序列與Halorubellus litoreus JCM17117的相似性最高，序列一致性達(dá)到 98.09% 。與其他屬最近緣的其他屬物種為Halomicrococcus hydrotolerans H22和 Haloarchaeobius salinusYC82，序列一致性分別為 92.21% 和 91.77% 。因此，將PRR-65菌株歸入Halorubellus屬。PRR-65菌株的16SrRNA基因序列提交GenBank，獲得序列登錄號：OR857485。

2.2 PRR-65菌株在Halorubellus屬內(nèi)的系統(tǒng)發(fā)育關(guān)系

PRR-65菌株與Halorubellus屬的Haloru-belluslitoreus和Halorubellussalinus兩個(gè)物種親緣關(guān)系最近，聚為一支。三種建樹方法均獲得了較高（ （gt;75% ）的支持率，說明這樣的系統(tǒng)發(fā)育關(guān)系比較穩(wěn)固，親緣關(guān)系比較明確可靠（圖2）。

2.3PRR-65菌株所產(chǎn)胞外蛋白酶酶學(xué)性質(zhì)2.3.1最適反應(yīng)條件及其穩(wěn)定性通過NOM液體培養(yǎng)基擴(kuò)大培養(yǎng)PRR-65菌株并制備該菌株的粗酶液進(jìn)行酶學(xué)性質(zhì)的研究。以酪氨酸濃度為橫坐標(biāo)，吸光度值為縱坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，得標(biāo)準(zhǔn)曲線方程 y=0.0093x+ 0.0023。將所測的酶活結(jié)果通過Origin軟件構(gòu)建折線統(tǒng)計(jì)圖。

將所測的酶活結(jié)果通過Origin軟件構(gòu)建折線統(tǒng)計(jì)圖顯示，不同的溫度處理后PRR-65菌株的胞外蛋白酶在 4^°C～75^°C 內(nèi)均有活性，酶的活性隨著溫度的升高先增加后降低，該酶的最適反應(yīng)溫度為 45^°C ，但在75^°C 以上時(shí)便失活。該酶在 45^°C～65^°C 下具有較高酶活（最高酶活的 60% 以上）。PRR-65菌株胞外蛋白酶在 35^°C 具有良好的熱穩(wěn)定性，處理 60min 后蛋白酶活性較 30min 時(shí)升高了 31% 。在 45^°C 和 55^°C 溫度范圍內(nèi)，隨著反應(yīng)時(shí)間的增加，酶活先上升后降低，處理 60min 后蛋白酶活性提高了 27% ，說明該蛋白酶具有一定的耐高溫特性以及熱穩(wěn)定性。

將PRR-65菌株蛋白酶溶液在 pH 范圍 5.0～11.0 處理后，該酶活隨著酸堿度的升高先升高后降低，最適反應(yīng)pH為6.0，當(dāng)pH低于最適或高于最適 pH 時(shí)，蛋白酶活力迅速降低。由此可知，該蛋白酶屬于偏酸性蛋白酶。PRR-65菌株的胞外蛋白酶在 pH8.0 和 pH10.0 處理 60min 后酶活均沒有顯著變化，在 pH6.0 處理60min后蛋白酶的酶活上升了 23% ，保持了相對的穩(wěn)定，PRR-65菌株分泌的胞外蛋白酶具有良好的酸堿穩(wěn)定性。

此外PRR-65菌株所產(chǎn)的胞外蛋白酶在 0～3MNaCl 溶液中均保持一定的活性，且PRR-65菌株的胞外蛋白酶最適反應(yīng)NaCI濃度為 1M ，蛋白酶活性會(huì)隨著 NaCl 濃度升高先上升后下降，當(dāng)NaCI濃度升至 3M 時(shí)，其活性降為最高活性的 63% ，并且PRR-65菌株分泌的胞外蛋白酶在 1.0MNaCl 條件下PRR-65菌株胞外蛋白酶酶活均高于 2.0M 和 3.0M ，但是在2.0和 3.0MNaCl 濃度條件下酶活隨時(shí)間的增加而上升，說明PRR-65菌株所產(chǎn)的胞外蛋白酶具有一定的鹽耐受力。

從圖3（a）和（b）分析可知，PRR-65菌株的胞外蛋白酶活力呈現(xiàn)先增高后降低的趨勢，其中酶活在 45^°C 條件下達(dá)到最高。測定PRR-65胞外蛋白酶在不同的溫度下孵育 20.40.60min 后的酶活探究其熱穩(wěn)定性，對不同溫度下孵育 20～60min 后的酶活進(jìn)行方差分析，在 35^°C 時(shí)F檢驗(yàn)統(tǒng)計(jì)量為29.167，大于F的臨界值6.591，plt;0.05 ，蛋白酶 35^°C 下孵育 20～60min 后有顯著差異，且酶活處于上升趨勢。在 45^°C 和 55^°C 時(shí)F檢驗(yàn)統(tǒng)計(jì)量分別為：6.333和2.111，均小于F的臨界值 6.591，pgt;0.05 ，蛋白酶在 45^°C 和 55^°C 下孵育 20～60min 后無顯著差異。因此PRR-65菌株所分泌的胞外蛋白酶具有一定的耐高溫性和熱穩(wěn)定性。蛋白酶的耐熱性對于工業(yè)生產(chǎn)應(yīng)用起到重要作用。而在 4^°C 低溫條件下，該蛋白酶依舊可以保持最高酶活的 50% ，因此，其在洗衣粉制造工藝中也有具有一定潛在的研究意義。

從圖3（c）和（d）可以看出，粗酶液在實(shí)驗(yàn)組pH范圍 5.0～11.0 時(shí)，均保持蛋白酶活性，并且在pH為6.0是酶活力達(dá)到最高。PRR-65胞外蛋白酶于不同 pH 下孵育 20.40.60min 后以探究其 pH 穩(wěn)定性，對不同 pH 下酶活方差分析，pH為6時(shí)F檢驗(yàn)統(tǒng)計(jì)量90.333大于6.591， plt;0.05 ，pH為6孵育 20～60min 有顯著差異，且酶活隨孵育時(shí)間增長而提高，知該蛋白酶屬偏酸性蛋白酶； pH 為8和10時(shí)F檢驗(yàn)統(tǒng)計(jì)量分別為4.333、1.928，均小于 6.591，pgt;0.05，pH 為8和10孵育 20～60min 無顯著差異，PRR-65胞外蛋白酶在此 pH 下穩(wěn)定良好。而在目前已發(fā)表的關(guān)于嗜鹽古菌胞外蛋白酶中，蛋白酶的最適pH均偏堿性，且這是第一株研究發(fā)現(xiàn)嗜鹽古菌胞外蛋白酶最適pH偏酸的菌株。PRR-65菌株分泌的胞外蛋白酶具有良好的酸堿穩(wěn)定性，這為在食品發(fā)酵工業(yè)、酸性工業(yè)廢水處理等行業(yè)中進(jìn)行應(yīng)用提供了一定的思路。

從圖3（e）和（f可以看出，PRR-65所產(chǎn)的胞外蛋白酶在 0～3MNaCl 溶液中呈現(xiàn)先上升后下降的趨勢，NaCI濃度為1M時(shí)酶活達(dá)到最高通過測定PRR-65胞外蛋白酶于不同 NaCl 濃度下孵育 20～60min 后的酶活，來探究其NaC1穩(wěn)定性，針對不同NaC1濃度下孵育 20～60min 后的酶活實(shí)施方差分析，所得F檢驗(yàn)統(tǒng)計(jì)量依次為：25.000、32.333以及12.333，這些均大于F的臨界值6.591，PRR-65胞外蛋白酶在 NaCl 濃度為1M，2M 和 3M 時(shí)孵育 20～60min 后存在顯著差異。綜上，PRR-65菌株分泌的蛋白酶在不同鹽濃度中都有較好的活性，在低鹽和高鹽濃度的環(huán)境中保持較好的耐受性這為后期廣鹽性蛋白酶制劑的開發(fā)應(yīng)用提供了基礎(chǔ)。

2.3.2金屬離子對蛋白酶活性的影響將粗酶液與不同的金屬離子混合處理后測定酶活結(jié)果繪圖分析，空白對照組具有較高酶活，其中 Mn²⁺ 對蛋白酶活的促進(jìn)作用相對于其他金屬離子的促進(jìn)作用最強(qiáng)。 Ca²⁺ K+和Mg²⁺ 同樣對蛋白酶具有促進(jìn)作用， Cu²⁺ 、Fe2+和 Zn²⁺ 對蛋白酶處理后酶活略低于對照組酶活。

金屬離子可以促進(jìn)或抑制蛋白酶活力。從圖4可以看出， Ca²⁺，Mn²⁺，K⁺，Mg²⁺ 對蛋白酶活性有促進(jìn)作用，而 Cu²⁺ Fe2+和 Zn²⁺ 對蛋白酶有抑制作用。因此，利用不同金屬離子對反應(yīng)的影響，在工業(yè)應(yīng)用中可以通過螯合 Ca²⁺，Mn²⁺，K⁺ 和 Mg²⁺ 等金屬離子使酶活性增加。

2.3.3PRR-65菌株所產(chǎn)胞外蛋白酶為絲氨酸蛋白酶PRR-65菌株所產(chǎn)胞外蛋白酶活幾乎被PMSF完全抑制，異丙醇為PMSF的溶劑且對蛋白酶酶活有影響，而 Ca²⁺ 螯合劑EDTA對酶活幾乎沒有影響（圖5a）。說明PRR-65菌株所產(chǎn)的胞外蛋白酶不是金屬蛋白酶，很可能是一類絲氨酸蛋白酶。將濃縮后的PRR-65菌株上清（粗酶液）滴在固體牛奶平板上，出現(xiàn)明顯的水解圈，而將PRR-65菌株上清（粗酶液）與PMSF混合后滴在牛奶平板上，不產(chǎn)生水解牛奶活性。也同樣說明PRR-65菌株上清中發(fā)揮功能的為絲氨酸蛋白酶類。

（a） 4^°C～75^°C 反應(yīng)溫度下粗酶液的酶活；（b）35 ^°C 、45℃和55 ^°C 下反應(yīng)20、40和 60min 的酶活;（c）pH為 4.0～11.0 反應(yīng)下蛋白酶粗酶液的酶活；（d）pH為6.0、8.0和10.0下反應(yīng)20、40和 60min 的酶活；（e）鹽濃度在0.5、1.0、1.5、2.0、2.5和 3.0M 反應(yīng)下的酶活;（f）鹽濃度在1.0、2.0和3.0M下反應(yīng)20、40和 60min 的酶活

3 討論

本研究從鹽漬海帶的鹽霜中分離純化得到一株產(chǎn)胞外蛋白酶能力較強(qiáng)的嗜鹽古菌，命名為PRR-65。經(jīng)16S rRNA基因序列相似性比對分析，發(fā)現(xiàn)其與Halorubellus litoreus JCM17117菌株的序列一致性最高，達(dá)到98.09% 。因此，PRR-65菌株屬于Halorubellus屬，并且與已知物種的16SrRNA基因序列一致性低于98.65%^[26] ，推測其很可能代表了Halorubellus屬的一個(gè)新種。

目前，Halorubellus屬尚未有關(guān)于胞外蛋白酶的報(bào)道。PRR-65菌株胞外蛋白酶的最適反應(yīng)條件為 45^°C pH6.0 和 1MNaCl ，且具有良好的熱穩(wěn)定性、酸堿穩(wěn)定性，在低鹽和高鹽濃度情況下都有較好的耐受性，這與已報(bào)道的來自 Halococcus屬嗜鹽古菌胞外蛋白酶HlyA具有一定的相似性[27]。此外，PRR-65 菌株的胞外蛋白酶最適pH為6.0，這與此前報(bào)道的多數(shù)嗜鹽古菌胞外蛋白酶，如HlyR4[28]， Hly34^[29] ，HlyA[27]等存在較大差異。之前報(bào)道的多數(shù)嗜鹽古菌胞外蛋白酶的最適pH均偏堿性[17]。嗜鹽古菌胞外蛋白酶的最適酶活的pH偏酸的情況較為少見。 Ca²⁺，Mn²⁺，K⁺ 和 Mg²⁺ 對PRR-65菌株多產(chǎn)的胞外蛋白酶活性有促進(jìn)作用，而 Cu²⁺ Fe2+和Zn²⁺ 對其有抑制作用。PMSF能明顯抑制酶活，說明PRR-65菌株所分泌的胞外蛋白酶可能是絲氨酸蛋白酶。

綜上所述，高鹽環(huán)境中分布著豐富的產(chǎn)胞外蛋白酶的嗜鹽古菌，其胞外蛋白酶活性在環(huán)境治理、高鹽食品發(fā)酵產(chǎn)生獨(dú)特風(fēng)味等方面能發(fā)揮重要的作用。PRR-65菌株所產(chǎn)的胞外蛋白酶具有特殊的酶學(xué)性質(zhì)，例如在酸性條件保持較高酶活性的特點(diǎn)將為其在工業(yè)技術(shù)的應(yīng)用方面奠定基礎(chǔ)。

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