基于離子液體與微波輔助的川續(xù)斷提取液抑菌作用及機(jī)制研究

中圖分類號(hào)：TS210.9 文獻(xiàn)標(biāo)志碼：A 文章編號(hào)：1671-8755（2025）02-0025-08

Study on the Antibacterial Effect and Mechanism of Dipsacus Asper Extract Based on Ionic Liquid and Microwave-assisted Method

ZOU Jing¹ ，KANG Jianqing'， ZHOU Mengjiao2， ZHANG Yu' ，KANG Ming'，LIANG Xiaofeng1，2

（1. School of Materials and Chemistry，Southwest University of Science and Technology，Mianyang 621010， Sichuan， China; 2. Mianyang Key Laboratory of Development and Utilization of Traditional Chinese Medicine Resources， Sichuan College of Traditional Chinese Medicine，Mianyang 621olo， Sichuan，China）

Abstract：Using Dipsacus as the raw material，the extract was obtained through ionic liquid and microwave-assisted extraction technology.Antibacterial experiments and active component analysis of the extract were conducted，and the antibacterial mechanism was discussed.The results show that the Dipsacus extract exhibits antibacterial effects against Escherichia coli（ E . coli），Staphylococcus aureus （S. aureus），and Salmonella paratyphi β （ S .paratyphi β ），with its inhibitory activity being concentration-dependent. The inhibition zone diameters for E . coli，S.aureus，and S . paratyphi β are 27 mm，39 mm，and 19mm ，respectively. The minimum inhibitory concentration （MIC）and minimum bactericidal concentration（MBC） against S. aureus are determined to be 3.1250mg/mL and 6.250 0mg/mL ， respectively. For E ： coli，the MIC and MBC values are 3.1250mg/mL and 6. 250 0mg/mL ， respectively. For S ：paratyphi β ，MICis 6.250 0mg/mL and MBC is 12.500 0mg/mL . Chromatographic analysis reveals the presence of antibacterial components in Dipsacus extract，including chlorogenic acid，caffeic acid，and asperosaponin VI. Morphological observations suggest that the antibacterial mechanism may involve disruption of bacterial cell wals and membranes.These findings provide valuable references for the development of antimicrobial agents from Dipsacus.

Keywords： Dipsacus asper extract；Antibacterial constituent； Antibacterial activity； Antibacterialmechanism

植物中的皂苷類、酚酸類成分（綠原酸、咖啡酸等）對多種革蘭陽性和革蘭陰性細(xì)菌均具有顯著的抑菌作用[1-4]，其抑菌機(jī)制可能與降解細(xì)菌細(xì)胞壁結(jié)構(gòu)、破壞細(xì)胞膜完整性導(dǎo)致胞內(nèi)物質(zhì)外泄并引發(fā)細(xì)菌死亡相關(guān)[5]

川續(xù)斷（DipsacusasperWall.exHenry）是川續(xù)斷科多年生草本植物的根，富含皂苷成分，以“續(xù)折接骨\"之功效而聞名[6，是一種重要的中藥材。近年來有研究表明川續(xù)斷揮發(fā)油、三萜類化合物及復(fù)方提取物具有抗菌潛力。吳知行等[]研究發(fā)現(xiàn)川續(xù)斷揮發(fā)油對金黃色葡萄球菌具有顯著的抑制效果；張玉[8發(fā)現(xiàn)川續(xù)斷揮發(fā)油對大腸埃希菌有顯著的抑制效果; Yu 等°研究發(fā)現(xiàn)川續(xù)斷的三萜類化合物對金黃色葡萄球菌表現(xiàn)出中等的抗菌活性；王斌等[10]發(fā)現(xiàn)川續(xù)斷提取物（水提物與醇提物的混合物）可作為氟苯尼考的增效劑，通過復(fù)配使用可顯著提升抗生素的抗菌效果。

川續(xù)斷有效成分的提取通常采用有機(jī)溶劑提取法[1]超聲波輔助溶劑提取法[12]、超臨界 CO₂ 提取法[13]等方式。然而，有機(jī)溶劑存在毒性、易燃性和揮發(fā)性等問題，對環(huán)境不友好[14]。因此，研究者將關(guān)注點(diǎn)聚焦于更為安全的溶劑，如離子液體[15]水[16]超臨界流體等。離子液體（ILs）是由離子組成的低熔點(diǎn)鹽[17]，具有低熔點(diǎn)、低揮發(fā)、化學(xué)穩(wěn)定性好、水溶性好等特點(diǎn)[18]，是替代傳統(tǒng)有機(jī)溶劑的理想選擇[19]。目前，離子液體多用于提取多糖類、生物堿類、黃酮類物質(zhì)[20]，對于皂苷類、酚酸類的提取研究較少。胡獻(xiàn)躍等[12]通過超聲輔助離子液體提取體系實(shí)現(xiàn)了川續(xù)斷總皂苷（含皂苷VI）和酚酸類成分（咖啡酸、綠原酸及其異構(gòu)體）的高效共提。然而，針對ILs-微波協(xié)同技術(shù)提取川續(xù)斷活性成分及其抑菌機(jī)制的系統(tǒng)研究仍屬空白。

本研究以川續(xù)斷為研究對象，利用離子液體-微波輔助提取技術(shù)獲得川續(xù)斷提取液，以抑菌圈直徑、最低抑菌濃度（MIC）及最低殺菌濃度（MBC）為考察指標(biāo)，重點(diǎn)研究提取液對大腸埃希菌（E.coli）、金黃色葡萄球菌（S.aureus）、乙型副傷寒沙門菌（S.paratyphiβ）等3種動(dòng)物致病菌的抑制作用。根據(jù)高效液相色譜進(jìn)行成分檢測，推測川續(xù)斷提取液的抑菌活性成分，通過光學(xué)顯微鏡觀察細(xì)菌菌落的分布形態(tài)，探討川續(xù)斷提取液的抑菌機(jī)制。

1 實(shí)驗(yàn)部分

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

川續(xù)斷采自四川涼山彝族自治州，經(jīng)四川中醫(yī)藥高等?？茖W(xué)校王化東副教授鑒定，清洗、烘干、粉碎，過80目篩，放入干燥器血備用;溴化1-辛基-3甲基咪唑（純度 98% ）、咖啡酸（純度 98% ），上海阿拉丁生化科技有限公司；綠原酸（純度 98% ）川續(xù)斷皂苷VI（純度 98% ），上海士峰生物科技有限公司;S. aureus CMCC（B）26003， E. ：coli CMCC（B）44102，S. paratyphi β CMCC（B）50094，綿陽樂濱商貿(mào)有限公司；水解酪蛋白瓊脂（MH）（BR）、營養(yǎng)肉湯培養(yǎng)基（NB）（BR），杭州濱和微生物試劑；環(huán)丙沙星藥敏紙片（ 6mm ）、頭孢克藥敏紙片（ 6mm ）空白藥敏紙片（ 6mm ），比克曼生物科技有限公司；生理鹽水（BR），上海阿拉丁生化科技有限公司；結(jié)晶紫溶液（AR），成都市科隆化學(xué)品有限公司；碘液、丙酮酸、沙黃（BR），青島海博生物科技有限公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)儀器

液相色譜儀（UltiMate3000DGLC），美國賽默飛世爾公司；電子分析天平（BSA124S），賽多利斯科學(xué)儀器有限公司；DHG鼓風(fēng)干燥箱，上海一恒科學(xué)儀器公司；便攜式高壓蒸汽滅菌器（YXQ-LS-18SI），上海博迅醫(yī)療生物儀器股份有限公司；數(shù)顯常溫培養(yǎng)箱（250B），金壇精達(dá)儀器制造廠；旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀（RE52CS-2），昆山禾創(chuàng)超聲儀器有限公司；光學(xué)顯微鏡（MSD100-9），邁時(shí)迪科技有限公司；微波化學(xué)反應(yīng)器（MCR-3型），鞏義市予華儀器有限責(zé)任公司。

1.3 提取液制備

稱取 川續(xù)斷樣品加入 40mL 0.5mol/L 的溴化1-辛基-3－甲基咪唑水溶液微波提取30min，功率 300‰ ，提取溫度為 60^°C ，旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)濃縮，抽濾得到粗提液，命名為ASA1，濃度為 25mg/mL 。

1.4 抑菌實(shí)驗(yàn)

以頭孢克、環(huán)丙沙星為陽性對照，通過濾紙片法[21]測定ASA1對 S_? aureus， E . coli，S. paratyphi β 的抑菌圈直徑。

取ASA1 2.0mL ，向其中加入適量生理鹽水進(jìn)行稀釋，分別得到體積分?jǐn)?shù) 100% ， 50% ， 25% 共3種濃度梯度的ASA1樣品。

選取上述3種供試菌種的培養(yǎng)懸液及固體培養(yǎng)基，在超凈工作臺(tái)上，精確吸取 100μL 細(xì)菌懸浮液[22]（ 10⁸CFU/mL ）滴加至培養(yǎng)基表面，使用一次性滅菌涂布棒將其均勻涂布。利用鑷子將滅菌的空白藥敏紙片貼于培養(yǎng)基表面，精確吸取 10μL 不同濃度的ASA1溶液滴加至空白藥敏紙片上，同時(shí)以無菌生理鹽水作為陰性對照[23]，于數(shù)顯恒溫細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng) 24h ，溫度設(shè)為 37°C ，最后使用數(shù)碼卡尺測量抑菌圈直徑。抑菌作用的強(qiáng)弱依據(jù)濾紙片瓊脂擴(kuò)散法的判定標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行評估，當(dāng)抑菌圈直徑 （d） 超過 7mm ，判定具有抑菌作用[21]，供試菌的抑菌圈直徑越大，意味著樣品的抑菌效果越顯著[22] 。

1.5最低抑菌濃度及最低殺菌濃度測定

在微生物藥敏試驗(yàn)的微量稀釋法中，以在小孔內(nèi)完全抑制細(xì)菌生長的最低藥物濃度為MIC，即OD值接近藥物陰性對照組的最低藥物濃度。以NB液體培養(yǎng)基為陰性對照，在96孔板中通過二倍稀釋法對ASA1依次稀釋，得到質(zhì)量濃度為25.000，12.500，6.250，3.125，1.563，0.781，0.391，0.195mg/mL 系列濃度梯度的ASA1陽性對照組。將不同菌種加入對應(yīng)96孔板中，于 37°C 數(shù)顯恒溫細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng) 24h ，使用酶標(biāo)儀測定 0D₆₀₀ 值，通過陽性對照組與陰性對照組進(jìn)行對比得到測試菌種的MIC。

殺死 99.9% 的供試菌種所需的藥物濃度為最低殺菌濃度（MBC），即培養(yǎng)基平板上菌落數(shù)量低于10CFU的最低濃度。選取MIC/2，MIC，2MIC，4MIC，8MIC濃度孔，接種適量菌液于瓊脂培養(yǎng)基平板上培養(yǎng) 24h ，根據(jù)培養(yǎng)基平板上的菌落數(shù)量情況判定菌種的MBC。

1.6 色譜實(shí)驗(yàn)

本研究重點(diǎn)關(guān)注文獻(xiàn)報(bào)道中具有抑菌潛力的成分，通過HPLC對提取液中綠原酸、咖啡酸、川續(xù)斷皂昔VI成分進(jìn)行定量檢測。

1.6.1 色譜條件

采用HypersilODS色譜柱（型號(hào)為 4.6mm× 250mm ， 5μm ），柱溫： 30^°C ，流動(dòng)相：A（乙腈），B（水，含 0.05% 磷酸）;按照流動(dòng)相濃度梯度程序進(jìn)行洗脫（流動(dòng)相 A，0～5min，2%;5～8min，2% 6% ： 18～22min ， 7%34% ： 22～25min ， 34% 66% ）;設(shè)定檢測波長為 220nm ，流速為 1.0mL/min 液相單次進(jìn)樣體積為 10μL 。在該色譜條件下，川續(xù)斷皂苷VI、綠原酸、咖啡酸的峰形對稱，并且理論塔板數(shù)均不低于 5000 。

1.6.2 標(biāo)準(zhǔn)品溶液制備

取川續(xù)斷皂苷VI、咖啡酸、綠原酸標(biāo)準(zhǔn)品適量，置于 10mL 容量瓶中，加 20% 甲醇定容至刻度，配置成川續(xù)斷皂苷VI、咖啡酸、綠原酸濃度均為 1mg/mL 的混合對照溶液，過 0.22μm 有機(jī)系濾膜備用。

1.6.3 樣品溶液制備

使用D101型大孔樹脂柱依次用去離子水、20% 乙醇 60% 乙醇洗脫純化ASA1，得純化液，過0.22μm 有機(jī)系濾膜備用。

1.6.4 化學(xué)成分指認(rèn)

按照色譜條件分別對標(biāo)準(zhǔn)品溶液及樣品溶液進(jìn)樣檢測，通過與標(biāo)準(zhǔn)品色譜峰保留時(shí)間等進(jìn)行比對，確認(rèn)樣品溶液中是否存在川續(xù)斷皂苷VI、咖啡酸、綠原酸等成分。

1.7 細(xì)菌菌落分布形態(tài)學(xué)觀察

采用革蘭氏染色法[14]制備細(xì)菌染色標(biāo)本，利用光學(xué)顯微鏡（自鏡倍數(shù)為 10× ，物鏡倍數(shù)為 100×） 觀察ASA1處理前后的細(xì)菌菌落形態(tài)變化，探討ASA1的抑菌機(jī)制。

1.8 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析

本實(shí)驗(yàn)用SPSS對數(shù)據(jù)進(jìn)行處理分析，測定結(jié)果以平均數(shù)表示。

2 試驗(yàn)結(jié)果

2.1 川續(xù)斷提取液的抑菌作用

2.1.1ASA1與常用抗生素抑菌效果對比

首先用濾紙片法觀察了ASA1對S.aureus， E coli，S.paratyphi β 的抑菌效果，并與頭孢克肟和環(huán)丙沙星兩種常用的抗生素進(jìn)行了比較，結(jié)果如圖1和表1所示。

從圖1和表1可以看出，ASA1對以上3種供試菌種都具有抑菌效果，其抑菌效果依次為：金黃色葡萄球菌（S.aureus） gt; 大腸桿菌（E.coli） gt; 乙型副傷寒沙門菌（S.paratyphi β ）。具體而言，ASA1對S.aureus的抑菌圈直徑達(dá) 39mm ，顯著優(yōu)于兩種陽性對照藥物；對 E ：coli形成的抑菌圈直徑（ 27mm ）介于環(huán)丙沙星與頭孢克肟之間；而對S.paratyphi β 的抑菌圈直徑僅為 19mm ，弱于兩種對照藥物。

值得注意的是， s. paratyphi β 的抑菌圈出現(xiàn)“雙環(huán)”現(xiàn)象，外環(huán)與內(nèi)環(huán)間存在零星菌落，推測此現(xiàn)象與ASA1的濃度梯度擴(kuò)散特性相關(guān)：在ASA1由內(nèi)向外擴(kuò)散的過程中，藥物濃度逐漸變低，抑菌圈內(nèi)環(huán)可以有效殺菌，而外環(huán)處于低濃度區(qū)，導(dǎo)致抑菌效果不足，且ASA1對S.paratyphi β 抑菌效果較弱，所以出現(xiàn)細(xì)菌在抑菌圈內(nèi)生長的現(xiàn)象。結(jié)合ASA1對該菌株的最低抑菌濃度（MIC）為 6.250 0mg?mL^-1 可進(jìn)一步驗(yàn)證ASA1在低濃度區(qū)抑菌活性下降的特性，這與外環(huán)與內(nèi)環(huán)間存在菌落的觀察結(jié)果相吻合。

綜上可知，ASA1對 S ：aureus的抑菌效果良好，對 E ．coli的抑菌效果較好，對S.paratyphi β 的抑菌效果較弱。

2.1.2 不同濃度ASA1的抑菌效果

從圖2和表2可以看出，ASA1對3種供試菌種的抑菌活性呈現(xiàn)顯著的濃度依賴性。當(dāng)ASA1體積分?jǐn)?shù)為 100% 時(shí)，對 E ：coli的抑菌圈直徑為 27mm ，對 S ：aureus的抑菌圈直徑為 32mm ，對S.paratyphiβ 的抑菌圈直徑為 19mm ，均超過CLSI規(guī)定的敏感閾值（ 15mm， ），且抑菌圈內(nèi)無耐藥菌，屬于敏感，表明ASA1在高濃度下具有廣譜抑菌活性，其中對S.aureus的抑菌效果更明顯;當(dāng)ASA1體積分?jǐn)?shù)為50% 時(shí)，抑菌效果減弱，對 E .coli，S.aureus仍然具有較好的抑菌效果，對 S. paratyphi β 的抑制效果大幅度降低；當(dāng)ASA1體積分?jǐn)?shù)為 25% 時(shí)，抑菌效果繼續(xù)降低，此時(shí)對 E_☉ ：coli，S.aureus的抑菌效果仍然較好，對 s ：paratyphi β 的抑制效果已不顯著。以上結(jié)果表明不同濃度的ASA1對大腸埃希菌（E.co-li ）、金黃色葡萄球菌（S.aureus）、乙型副傷寒沙門菌（S. paratyphi β ）的生長繁殖有不同程度的抑制作用，且抑菌活性與濃度呈正相關(guān)。

2.1.3 ASA1的MIC和MBC

ASA1與供試菌種培養(yǎng) 24h 后的 0D₆₀₀ 值如表3所示，通過與對照組對比，得到 s. aureus，S.para-typhi β，E ：coli的MIC分別為 3.1250.6.2500 3.125 0mg?mL^-1 。ASA1的MIC和MBC 結(jié)果如表4所示。從表4可以看出，ASA1對3種供試菌中的E ：coli，S.aureus具有更好的抑制作用，與抑菌圈試驗(yàn)結(jié)果相印證。

2.2 川續(xù)斷提取液的抑菌活性成分分析

標(biāo)準(zhǔn)品及樣品洗脫液的液相色譜如圖3所示。在標(biāo)準(zhǔn)品液相色譜圖中，綠原酸的出峰時(shí)間為15.597min ，咖啡酸的出峰時(shí)間為 17.370min ，川續(xù)斷皂苷VI的出峰時(shí)間為 26.293min 。通過比對提取液與標(biāo)準(zhǔn)品的出峰時(shí)間、峰面積及理論塔板數(shù)，指認(rèn)了川續(xù)斷提取液中存在綠原酸、咖啡酸、川續(xù)斷皂苷VI3種化學(xué)成分。已有研究發(fā)現(xiàn)，綠原酸可以通過作用于細(xì)菌細(xì)胞壁和細(xì)胞膜使其通透性增加、影響細(xì)菌的集群能力和生物膜形成、誘導(dǎo)細(xì)胞內(nèi)活性氧耗竭、影響特定酶活性干擾正常代謝及損傷細(xì)菌DNA等途徑來發(fā)揮抑菌作用3；咖啡酸可以通過抑制細(xì)菌生物膜形成、破壞細(xì)胞膜的完整性、調(diào)控基因表達(dá)影響蛋白功能等途徑來發(fā)揮抑菌作用4；皂苷類成分可能通過破壞菌體細(xì)胞的結(jié)構(gòu)完整性、抑制生物膜的形成與生長、增強(qiáng)細(xì)胞膜的通透性（川續(xù)斷皂苷VI具有表面活性劑特性）等途徑來發(fā)揮抑菌作用[24]。常春藤皂苷元對大部分革蘭氏陽性菌均有抑制作用[25]，且效果強(qiáng)于革蘭氏陰性菌，抑菌效果不同可能是細(xì)菌細(xì)胞壁結(jié)構(gòu)不同導(dǎo)致的[26]川續(xù)斷皂苷VI為川續(xù)斷的主要活性成分，常春藤皂苷元為川續(xù)斷皂苷類成分的結(jié)構(gòu)母核[27]。結(jié)合文獻(xiàn)與川續(xù)斷提取液的成分檢測，川續(xù)斷提取液的抑菌作用可能源于多成分的協(xié)同效應(yīng)，其抑菌活性成分可能為綠原酸、咖啡酸（酚酸類）及川續(xù)斷皂苷VI（皂苷類）。

2.3 抑菌機(jī)制分析

革蘭氏染色法利用細(xì)菌細(xì)胞壁上的生物化學(xué)性質(zhì)不同將細(xì)菌分為革蘭氏陽性菌和革蘭氏陰性菌[28]。革蘭氏陽性菌染色后呈紫色，而革蘭氏陰性菌則呈紅色。當(dāng)細(xì)胞出現(xiàn)老化或死亡時(shí)，革蘭氏染色結(jié)果可能為陰性，此時(shí)細(xì)胞圖像顯示為紅色[29]

S.aureus屬于革蘭氏陽性菌，其染色標(biāo)本的菌體形態(tài)如圖4所示。圖4（a）顯示，未經(jīng)處理的S.aureus染色后呈現(xiàn)均勻的紫色，菌體細(xì)胞排列緊密，分布有序，呈“葡萄狀”團(tuán)聚。經(jīng)過ASA1處理后菌體形態(tài)如圖4（b）所示，S.aureus的“葡萄狀”團(tuán)聚現(xiàn)象消失，“葡萄狀”聚集體解離為分散單體，菌落分布變得無序，許多菌體出現(xiàn)變形或破損，顯示為紅色染色形態(tài)。羅藝晨等[30]認(rèn)為，綠原酸可以破壞金黃色葡萄球菌的內(nèi)膜，導(dǎo)致其細(xì)胞膜的通透性發(fā)生變化，從而實(shí)現(xiàn)抑制效果。郭麗麗等[31]發(fā)現(xiàn)，黃芪莖葉總皂苷會(huì)損害大腸桿菌的細(xì)胞膜形態(tài)，導(dǎo)致細(xì)胞內(nèi)物質(zhì)快速外泄，營養(yǎng)供應(yīng)受阻，從而顯著抑制細(xì)菌的生長。因此S.aureus菌落經(jīng)ASA1處理，改變了細(xì)菌細(xì)胞膜的通透性，細(xì)胞壁遭到破壞，最終導(dǎo)致細(xì)胞的老化或死亡[32]

E. coli 和 S. paratyphi β 均屬于革蘭氏陰性菌，其染色標(biāo)本的菌體形態(tài)如圖5、圖6所示。從圖5（a）和圖6（a）可以看出，未經(jīng)處理前，E.coli的菌體呈長桿狀，細(xì)胞形態(tài)完整且無相互黏連，而S.paratyphi β 則呈桿狀，通常以成對或短鏈狀排列，分布均勻。在

ASA1處理后，如圖5（b）和圖6（b）所示，E.coli和S. paratyphi β 的菌體均顯示出明顯的細(xì)胞相互黏附和堆積現(xiàn)象，且菌體分布變得雜亂無序，細(xì)菌細(xì)胞壁和細(xì)胞膜遭到破壞，細(xì)胞透性增加從而造成原生質(zhì)外滲[33]。以上研究表明，川續(xù)斷提取液的抑菌作用是通過破壞細(xì)菌細(xì)胞壁和細(xì)胞膜從而抑制了 s aureus，E. coli和S.paratyphi β 菌體生長。

3結(jié)論

通過離子液體-微波輔助提取法獲得川續(xù)斷提取液，分析了提取液對S.aureus，E.coli，S.paratyphi β 的抑菌效果、抑菌活性成分及抑菌機(jī)制。結(jié)果表明川續(xù)斷提取液對S.aureus，E.coli，S.paratyphiβ腸道致病菌均具有一定的抑菌效果，且其抑菌效果隨著濃度的增加而增強(qiáng)，其抑菌機(jī)制主要是通過破壞細(xì)菌細(xì)胞壁和細(xì)胞膜影響細(xì)菌的生長和繁殖。川續(xù)斷中的綠原酸、咖啡酸及川續(xù)斷皂苷VI成分可能為川續(xù)斷提取液抑菌作用的活性成分。本研究表明川續(xù)斷有作為抗菌藥物開發(fā)的潛質(zhì)。

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