雌雄土鱉蟲的纖溶和抗凝活性對(duì)比研究

[摘要]"目的"比較雌雄土鱉蟲的纖溶和抗凝活性。方法"采用回流方式對(duì)雌雄土鱉蟲藥材進(jìn)行提取，進(jìn)行體外纖溶實(shí)驗(yàn)活性評(píng)價(jià)；通過注射鹽酸腎上腺素和強(qiáng)制冰水游泳構(gòu)建寒凝血瘀小鼠模型，將小鼠分為空白組、模型組、尿激酶組、雄土鱉蟲高和低劑量組、雌土鱉蟲高和低劑量組，每組10只。測(cè)定全血黏度、血細(xì)胞等指標(biāo)評(píng)價(jià)雌雄土鱉蟲抗凝活性。"""""""""結(jié)果"體外纖溶實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示雌、雄土鱉蟲的低、高劑量組體外纖溶活性比較差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（Pgt;0.05）。模型組小鼠的全血黏度、血細(xì)胞比容、血小板計(jì)數(shù)均顯著高于空白組（Plt;0.05）。雌、雄土鱉蟲的低、高劑量組小鼠低切變率的全血黏度、血細(xì)胞比容、血小板計(jì)數(shù)均顯著低于模型組（Plt;0.05）。結(jié)論"雌、雄土鱉蟲在纖溶和抗凝活性方面并無顯著差異，這為雌、雄土鱉蟲的進(jìn)一步開發(fā)利用提供支撐。

[關(guān)鍵詞]"體外纖溶實(shí)驗(yàn)；寒凝血瘀；雌雄土鱉蟲；活血化瘀

[中圖分類號(hào)]"R285.5""""""[文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼]"A""""[DOI]"10.3969/j.issn.1673-9701.2025.10.013

Comparative"study"on"the"activities"of"fibrinolysis"and"antithrombosis"in"male"and"female"ground"beetle

ZENG"Yiwang

Department"of"Pharmacy，"Ganzhou"People’s"Hospital，"Ganzhou"341000，"Jiangxi，"China

[Abstract]"Objective"To"compare"the"activities"of"fibrinolysis"and"antithrombosis"between"male"and"female"ground"beetle."Methods"The"medicinal"materials"of"male"and"female"ground"beetle"were"extracted"by"reflux"method，"and"the"fibrinolytic"activity"was"evaluated"in"vitro."The"mouse"model"of"cold"congelation"and"blood"stasis"was"established"bynbsp;injection"of"epinephrine"hydrochloride"and"forced"swimming"in"ice"water."The"mice"were"divided"into"blank"group，"model"group，"urokinase"group，"high"and"low"dose"male"ground"beetle"group，"high"and"low"dose"female"ground"beetle"group，"with"10"mice"in"each"group."The"anticoagulant"activity"of"male"and"female"ground"beetle"was"evaluated"by"measuring"whole"blood"viscosity"and"blood"cells."Results"The"results"of"in"vitro"fibrinolysis"test"showed"that"there"was"no"significant"difference"in"fibrinolytic"activity"between"the"low"and"high"dose"groups"of""male"and"female"ground"beetle"（Pgt;0.05）."The"whole"blood"viscosity，"hematocrit，"and"platelet"count"of"model"group"were"significantly"higher"than"those"of"blank"group"（Plt;0.05）."The"low"shear"rate"of"whole"blood"viscosity，"hematocrit"and"platelet"count"of"low"and"high"dose"groups"male"and"female"ground"beetle"were"significantly"lower"than"those"in"model"group"（Plt;0.05）."Conclusion"There"was"no"significant"difference"in"fibrinolytic"and"anticoagulant"activities"between"male"and"female"ground"beetle，"which"provided"support"for"the"further"development"and"utilization"of"male"and"female"ground"beetle.

[Key"words]"Fibrinolytic"assay"in"vitro;"Cold"congelation"and"blood"stasis;"Male"and"female"ground"beetle;"Promoting"blood"circulation"for"removing"blood"stasis

土鱉蟲具有活血逐瘀、續(xù)筋接骨的功效?，F(xiàn)代研究表明土鱉蟲可促進(jìn)血液流動(dòng)，使血液內(nèi)纖維蛋白分解為纖維蛋白原達(dá)到溶栓目的[1-3]。研究顯示土鱉蟲蛋白質(zhì)占總蟲體的60%，微量元素占0.15%，且土鱉蟲蛋白質(zhì)提取物可促進(jìn)血液內(nèi)血管修復(fù)因子釋放，恢復(fù)損傷血管，說明土鱉蟲蛋白質(zhì)具有治療“血瘀證”的作用。為深入研究土鱉蟲的物質(zhì)基礎(chǔ)，研究者多采用寒凝血瘀模型和體外纖溶實(shí)驗(yàn)，其中寒凝血瘀是指受到風(fēng)寒侵襲、氣血運(yùn)行受阻進(jìn)而凝滯成塊；其臨床評(píng)價(jià)指標(biāo)多為全血黏度、血細(xì)胞比容等。中醫(yī)臨床多采用雌土鱉蟲作為藥材使用，主要原因在于雌雄土鱉蟲的結(jié)構(gòu)差異，雌雄土鱉蟲在蛻皮5次后達(dá)到性成熟，開始交配繁衍下一代，但雌土鱉蟲在性成熟后羽翅蛻化，而雄土鱉蟲性成熟后羽翅更加發(fā)達(dá)，雌雄土鱉蟲交配完成后，雄土鱉蟲由于羽翅存在基本離開，因此采集土鱉蟲時(shí)，雄土鱉蟲具有翅膀不好收集，導(dǎo)致人為選擇性地遺漏，而雌土鱉蟲沒有這一結(jié)構(gòu)被收集起來[4-6]。雌雄土鱉蟲是否因結(jié)構(gòu)上的差異而具有不同藥理作用，這對(duì)后期雄土鱉蟲的綜合開發(fā)至關(guān)重要?；诖?，本研究通過小鼠寒凝血瘀模型和體外纖溶活性實(shí)驗(yàn)系統(tǒng)評(píng)價(jià)雌雄土鱉蟲的纖溶和抗凝活性，以期為其臨床應(yīng)用提供科學(xué)依據(jù)，揭示雌雄土鱉蟲在纖溶和抗凝方面的差異，優(yōu)化用藥策略。

1""材料與方法

1.1""儀器

BPH-9082型精密恒溫培養(yǎng)箱（上海一恒科學(xué)儀器有限公司），HH-601超級(jí)恒溫水浴鍋（鎮(zhèn)江瑞祥儀器有限公司），MS104"TS電子天平、MS105DU"電子天平（梅特勒-托利多國(guó)際貿(mào)易上海有限公司），KQ2200DV型超聲振蕩儀（杭州法蘭特超聲波科技有限公司），LH750全自動(dòng)血細(xì)胞分析儀（貝克曼庫爾特中國(guó)儀器公司）。

1.2""材料與試劑

雌雄土鱉蟲藥材購自山東長(zhǎng)清土元養(yǎng)殖公司，經(jīng)山東中醫(yī)藥大學(xué)郭慶梅教授鑒定為中華冀土鱉。凝血酶（批號(hào)：20150610，活力：500U/g，深圳生化制劑廠），試管（0.5cm×10cm），培養(yǎng)皿（直徑10cm），瓊脂糖（批號(hào)：20151102，購自國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司），牛血纖維蛋白原（純度95.3%，批號(hào)：20140103，購自沈陽拜英生物科技有限公司），牛血清白蛋白（bovine"serum"albumin，BSA）（純度：99.9%，購自國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司），注射用尿激酶（活性：30萬U/g，遼寧天正生物制藥有限公司），生理鹽水（500ml，山東華魯制藥集團(tuán)），去離子水（杭州娃哈哈飲用水有限公司），正丁醇、石油醚（沸程：60～90℃），濃鹽酸、三氯甲烷、甲醇、無水乙醇，以上均為AR級(jí)。

1.3""實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1""纖維平板纖溶實(shí)驗(yàn)""將生理鹽水和磷酸鹽緩沖溶液按照17∶1的比例配制工作液，取工作液100ml，加熱煮沸，加入0.5g瓊脂糖，待其徹底溶解后，取出放涼至50℃，加入20ml牛纖維蛋白原溶液，加入10U/ml凝血酶溶液1.0ml，振蕩后導(dǎo)入培養(yǎng)皿內(nèi)部，每個(gè)培養(yǎng)皿10ml，放入4℃冰箱冷藏15min。用直徑1mm打孔器進(jìn)行打孔，并在每個(gè)孔內(nèi)加入尿激酶標(biāo)準(zhǔn)溶液10μl，放入恒溫培養(yǎng)箱培養(yǎng)12h（37℃）。取出后采用游標(biāo)卡尺對(duì)溶圈進(jìn)行測(cè)定，計(jì)算溶圈面積。以溶圈面積為縱坐標(biāo)，以尿激酶活性的對(duì)數(shù)為橫坐標(biāo)進(jìn)行線性回歸。同時(shí)，配制300"000U/ml、100"000U/ml、"30"000U/ml、2000U/ml的尿激酶溶液，并按照上述方法對(duì)確定的線性回歸方程進(jìn)行驗(yàn)證。

1.3.2""雌雄土鱉蟲纖溶活性對(duì)比""分別取雌土鱉蟲、雄土鱉蟲藥材各10g置于250ml錐形瓶中，各加去離子水100ml，采用回流方式進(jìn)行提取，提取時(shí)間為1.0h，過濾，收集濾液，分別標(biāo)記為雌土鱉蟲提取液、雄土鱉蟲提取液。分別調(diào)整上述樣品的濃度至1.0g/ml和2.0g/ml（生藥/體積），采用纖維平板纖溶實(shí)驗(yàn)方法進(jìn)行實(shí)驗(yàn)，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算得出4種樣品的活力。

1.3.3""基于寒凝血瘀小鼠模型評(píng)價(jià)雌雄土鱉蟲活性""昆明小鼠70只，雄性，SPF級(jí)，體質(zhì)量18～20g，實(shí)驗(yàn)動(dòng)物生產(chǎn)許可證號(hào)：SCXK（魯）20230002。適應(yīng)性飼養(yǎng)7d后開始肌內(nèi)注射1%注射用鹽酸腎上腺素，0.1ml/次，持續(xù)30d。第16天開始在注射鹽酸腎上腺素后4.0h，4℃冰水浴強(qiáng)制游泳15min，持續(xù)15d。將小鼠分為空白組、模型組、尿激酶組、雄土鱉蟲高和低劑量組、雌土鱉蟲高和低劑量組，每組10只。第31天開始，尿激酶組采用靜脈注射方式給藥，其余各組均采用灌胃方式給藥；給藥濃度：尿激酶組30"000U/ml，雄土鱉蟲藥材組、雌土鱉蟲藥材組調(diào)整生藥濃度至1.0g/ml和2g/ml；給藥體積：1.0ml；空白組、模型組給予相同體積生理鹽水，持續(xù)16d，第16天末次給藥后1.0h，采用5.0%戊巴比妥鈉溶液麻醉小鼠，腹主靜脈取血，使用管壁附著肝素鈉的抗凝管存儲(chǔ)血液，測(cè)定全血黏度、血細(xì)胞指標(biāo)。

1.4""統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

采用SPSS"19.0統(tǒng)計(jì)軟件對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行分析。計(jì)量資料符合正態(tài)分布的以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（"）表示，兩組比較采用t檢驗(yàn)，多組比較采用單因素方差分析。Plt;0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2""結(jié)果

2.1""標(biāo)準(zhǔn)曲線的建立

對(duì)纖溶曲線進(jìn)行回歸分析，其線性方程為Y=1.564X-1.8635，R2=0.9972，線性良好，見圖1。同時(shí)，配制300"000U/ml、100"000U/ml、30"000U/ml、2000U/ml的尿激酶溶液，測(cè)得各尿激酶溶液的溶圈面積并計(jì)算大小，見表1。通過平板纖維實(shí)驗(yàn)計(jì)算得出的各尿激酶溶液的活力與標(biāo)準(zhǔn)值相差不大，與凝血酶滴定方法相比，準(zhǔn)確性更高。因此，實(shí)驗(yàn)采用纖維平板纖溶實(shí)驗(yàn)作為體外活性篩選方法。

2.2""雌雄土鱉蟲纖溶活性對(duì)比結(jié)果

采用體外纖溶活性結(jié)果對(duì)雌雄土鱉蟲進(jìn)行活性評(píng)價(jià)研究，結(jié)果表明雌雄土鱉蟲均具有纖溶活性，且兩者差距較小，說明雌雄土鱉蟲在體外纖溶活性方面不存在明顯差異，見表2。

2.3""基于寒凝血瘀小鼠模型評(píng)價(jià)雌雄土鱉蟲活性

2.3.1""全血黏度測(cè)定結(jié)果""采用全血流變分析測(cè)定儀對(duì)小鼠全血進(jìn)行測(cè)定，記錄低切變率、中切變率、高切變率下的各組全血黏度變化。模型組小鼠的全血黏度均顯著高于空白組（Plt;0.05），說明造模成功。連續(xù)給藥后，尿激酶組小鼠的全血黏度均顯著低于模型組（Plt;0.05）。雌、雄土鱉蟲低、高劑量組小鼠的低切變率全血黏度顯著低于模型組（Plt;0.05），但雌雄土鱉蟲各組小鼠的中切變率和高切變率全血黏度比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（Pgt;0.05），見表3。

2.3.2""血細(xì)胞分析結(jié)果""模型組小鼠的血細(xì)胞比容、血小板計(jì)數(shù)顯著高于空白組（Plt;0.05），說明造模成功。連續(xù)給藥后，尿激酶組小鼠的血細(xì)胞比容、血小板計(jì)數(shù)均顯著低于模型組（Plt;0.05）。雌雄土鱉蟲高、低劑量組小鼠的血細(xì)胞比容、血小板計(jì)數(shù)均低于模型組（Plt;0.05），但雌雄土鱉蟲各組的血細(xì)胞比容、血小板計(jì)數(shù)比較均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（Pgt;0.05）。各組小鼠的血紅蛋白比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（Pgt;0.05），見表4。

3""討論

蟲類中藥大多屬行走通竄之物，具有破血逐瘀之功，如水蛭、蜈蚣、土鱉蟲等。土鱉蟲系鱉蠊科昆蟲地鱉Eupolyphaga"sinensis"Walker或冀地鱉Steleophaga"plancyi（Boleny）的雌蟲干燥體，屬活血化瘀之要藥[7]。土鱉蟲雌雄異型，雄蟲有翅，雌蟲無翅。在野外環(huán)境中，土鱉蟲的雌雄比例受自然選擇影響，通常表現(xiàn)為雌性占絕對(duì)優(yōu)勢(shì)。根據(jù)養(yǎng)殖研究數(shù)據(jù)推斷，自然種群中雌蟲占比可能超過70%，而雄蟲比例低于30%。研究表明雌雄土鱉蟲均具有抗凝與活血化瘀活性[8]。因此，研究雌雄土鱉蟲的纖溶和抗凝活性對(duì)比具有深遠(yuǎn)意義。

本研究通過水煎煮對(duì)雌雄土鱉蟲藥材進(jìn)行提取，并進(jìn)行體外纖溶實(shí)驗(yàn)活性評(píng)價(jià)。結(jié)果表明不同濃度的尿激酶溶液測(cè)得計(jì)算活力值與標(biāo)準(zhǔn)值相差不大。因此，纖維平板纖溶實(shí)驗(yàn)適用于體外活性篩選。雌雄土鱉蟲纖溶活性對(duì)比結(jié)果顯示，雌、雄土鱉蟲低、高劑量組纖溶活性測(cè)定結(jié)果比較無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，表明雌、雄土鱉蟲在纖溶活性上不存在顯著差異?；诤鲂∈竽Ｐ驮u(píng)價(jià)雌、雄土鱉蟲的抗凝活性。在抗凝治療中，切變率主要用于評(píng)估血液流變學(xué)特性對(duì)血栓形成風(fēng)險(xiǎn)的影響，低切變率反映紅細(xì)胞聚集程度[9]。當(dāng)切變率降低時(shí)，紅細(xì)胞易形成“緡錢狀”聚集，導(dǎo)致全血低切黏度升高。本研究以低切變率、中切變率、高切變率下的各組全血黏度變化為指標(biāo)，發(fā)現(xiàn)模型組小鼠的全血黏度均高于空白組，而給予雌、雄土鱉蟲提取液治療后，與模型組相比，雌、雄土鱉蟲各組在低切變率下均有顯著差異，而中切變率和高切變率下各給藥組均無顯著差異，表明雌雄土鱉蟲均具有良好的活血化瘀功效。曾瓊[10]采用仿生酶解法處理土鱉蟲飲片與配方顆粒，以血塊溶解率考察溶栓活性，以凝血酶原時(shí)間、活化部分凝血活酶時(shí)間、血漿凝血酶時(shí)間考察抗凝活性，纖維平板實(shí)驗(yàn)考察纖溶活性。結(jié)果表明土鱉蟲飲片與配方顆粒均能降低全血黏度，延長(zhǎng)凝血酶原時(shí)間、凝血酶時(shí)間，降低纖維蛋白原含量，印證土鱉蟲的活血化瘀活性。血細(xì)胞分析結(jié)果表明，尿激酶組小鼠的血細(xì)胞比容、血小板計(jì)數(shù)均顯著低于模型組小鼠。與模型組相比，雌、雄土鱉蟲高、低劑量組在血細(xì)胞比容和血小板計(jì)數(shù)方面均具有顯著差異，且在一定程度上呈現(xiàn)劑量依賴性，表明雌、雄土鱉蟲均具有良好的活血化瘀作用。姜珊等[11]采用體外仿生酶解技術(shù)對(duì)土鱉蟲藥材進(jìn)行仿生酶解，并研究其對(duì)急性血瘀模型大鼠的血液流變學(xué)指標(biāo)。結(jié)果表明土鱉蟲活性肽組分可顯著降低血液黏度、血細(xì)胞比容、血小板計(jì)數(shù)，與本研究結(jié)果一致，進(jìn)一步驗(yàn)證雌、雄土鱉蟲提取液在改善血液循環(huán)方面的顯著作用，為臨床應(yīng)用提供有力依據(jù)。

綜上，雌、雄土鱉蟲均具有纖溶和抗凝活性，這為雌、雄土鱉蟲的資源化利用提供前期基礎(chǔ)，也為其綜合開發(fā)提供支撐。

利益沖突：作者聲明不存在利益沖突。

[參考文獻(xiàn)]

[1] 王瀟，"文敏，"鄭沛，"等."土鱉蟲化學(xué)成分和藥理作用的研究進(jìn)展及其質(zhì)量標(biāo)志物（Q-Marker）的預(yù)測(cè)分析[J]."環(huán)球中醫(yī)藥，"2024，"17（5）："933–940.

[2] 趙江鵬，"張敏，"張明生."土鱉蟲雌雄蟲對(duì)外傷血瘀證大鼠模型的作用差異研究[J]."中國(guó)中醫(yī)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)雜志，"2024，"30（3）："443–446.

[3] 董偉超，"王少平，"黃瑩潔，"等."基于\"化學(xué)成分-藥效\"對(duì)比分析的雄土鱉蟲成藥性評(píng)價(jià)研究[J]."時(shí)珍國(guó)醫(yī)國(guó)藥，"2023，"34（10）："2494–2498.

[4] 馬鴻雁，"范紅，"劉倩，"等."HS-SPME-GC-MS和氣味活度值分析土鱉蟲關(guān)鍵腥臭氣成分[J/OL]."中國(guó)現(xiàn)代應(yīng)用藥學(xué)，"1-10."（2023-09-04）[2025-03-02]."https：//doi.org/10."13748/j.cnki.issn1007-7693.20221872.

[5] 張?zhí)瘢?袁銘君，"李軍德."《中國(guó)藥典》2020年版動(dòng)物類中藥功效統(tǒng)計(jì)分析和質(zhì)量評(píng)價(jià)[J]."中國(guó)現(xiàn)代中藥，"2023，"25（8）："1627–1634.

[6] 李濟(jì)君."土鱉蟲小分子及其衍生物抗腎維化活性及作用機(jī)制研究[D]."深圳："深圳大學(xué)，"2023.

[7] ?；搓?，"史紅專，"鄒潔，"等."雌雄地鱉內(nèi)在品質(zhì)及營(yíng)養(yǎng)成分差異研究[J]."中國(guó)中藥雜志，"2022，"47（12）："3192–3197.

[8] 付靜，"姜秋，"楊春淼，"等."土鱉蟲炮制歷史沿革及現(xiàn)代研究進(jìn)展[J/OL]."中華中醫(yī)藥學(xué)刊，"1-14."（2024-12-04）"[2025-03-04].http：//kns.cnki.net/kcms/detail/21.1546.R.

20241204."1048."014."html.

[9] 付曉星，"王寧勃，"向越."芪冬頤心口服液聯(lián)合常規(guī)西醫(yī)對(duì)冠心病患者的應(yīng)用效果及對(duì)糖脂代謝、血液黏度的影響[J]."臨床和實(shí)驗(yàn)醫(yī)學(xué)雜志，"2024，"23（21）："2263–2267.

[10] 曾瓊."土鱉蟲飲片與配方顆粒化學(xué)成分與藥效比較研究[D]."成都："成都醫(yī)學(xué)院，"2024.

[11] 姜珊，"王少平，"代龍，"等."土鱉蟲活性肽組分對(duì)急性血瘀模型大鼠血液流變學(xué)、血脂四項(xiàng)指標(biāo)及血液因子含量的影響[J]."食品與機(jī)械，"2020，"36（1）："175–180.

（收稿日期：2024–12–17）

（修回日期：2025–03–07）