芒柄花黃素調(diào)節(jié)TLR4/NF-κB通路對ox-LDL誘導(dǎo)的人冠狀動脈內(nèi)皮細(xì)胞損傷的影響

摘要""目的：探討芒柄花黃素（Form）調(diào)節(jié)Toll樣受體4（TLR4）/核因子κB（NF-κB ）通路對氧化型低密度脂蛋白（ox-LDL）誘導(dǎo)的人冠狀動脈內(nèi)皮細(xì)胞（HCAECs）損傷的影響。方法：采用24 μg/ mL的ox-LDL處理HCAECs 40 h誘導(dǎo)損傷和炎癥，未用ox-LDL處理的HCAECs作為對照組。將ox-LDL處理的HCAECs分為HCAECs組、L-Form組（16 μmol/L Form）、M-Form組（32 μmol/L Form）、H-Form組（64 μmol/L Form）、脂多糖（LPS）組（5 μg/mL TLR4/NF-κB p65通路激活劑"LPS）、H-Form＋LPS組（64 μmol/L Form＋5 μg/mL LPS）。采用細(xì)胞計數(shù)（CCK-8）法檢測細(xì)胞增殖活性；流式細(xì)胞術(shù)檢測細(xì)胞凋亡；Transwell法測定細(xì)胞遷移和侵襲；基質(zhì)膠評估管形成能力；酶聯(lián)免疫吸附試驗（ELISA）檢測白細(xì)胞介素-1β（IL-1β）、白細(xì)胞介素-6（IL-6）、腫瘤壞死因子-α（TNF-α）水平；蛋白免疫印跡法（Western Blot）檢測TLR4/NF-κB通路蛋白表達(dá)水平。結(jié)果：與對照組相比，HCAECs組凋亡率，IL-1β、IL-6、TNF-α水平，TLR4、p-NF-κB p65/NF-κB p65蛋白表達(dá)明顯升高（P＜0.05），細(xì)胞增殖活性O(shè)D值明顯降低（P＜0.05），遷移細(xì)胞數(shù)量、侵襲細(xì)胞數(shù)量、毛細(xì)管管樣的節(jié)點數(shù)量明顯減少（P＜0.05），管總長度明顯縮?。?em>P＜0.05）；與HCAECs組相比，L-Form組、M-Form組、H-Form組HCAECs細(xì)胞凋亡率，IL-1β、IL-6、TNF-α水平，TLR4、p-NF-κB p65/NF-κB p65蛋白表達(dá)明顯下降（P＜0.05），細(xì)胞增殖活性O(shè)D值、遷移細(xì)胞數(shù)量、侵襲細(xì)胞數(shù)量、毛細(xì)管管樣的節(jié)點數(shù)量、管總長度明顯增加（P＜0.05），而LPS組趨勢相反；LPS消除了高濃度Form對HCAECs細(xì)胞有利的影響。結(jié)論：Form可能通過抑制TLR4/NF-κB信號通路來緩解ox-LDL誘導(dǎo)的HCAECs損傷。

關(guān)鍵詞""芒柄花黃素；人冠狀動脈內(nèi)皮細(xì)胞；氧化型低密度脂蛋白；Toll樣受體4/核因子κB信號通路；實驗研究

doi：10.12102/j.issn.1672-1349.2025.07.007

Effect of Formononetin on Human Coronary Endothelial Cell Against ox-LDL-induced "Injury by Regulating TLR4/NF-κB Pathway

YUAN Xiaocui LIAO Jinyu FU Li LUO Yong CHEN Dong

1.Mianyang Central Hospital， Mianyang 621000， Sichuan， China， E-mail： aqyvn87@163.com; 2.The Third People′s Hospital of Chengdu; 3.Mianyang People′s Hospital

Abstract Objective：To investigate the effect of formononetin（Form） in regulating toll-like receptor 4（TLR4）/nuclear factor κB（NF-κB） pathway on human coronary endothelial cell（HCAECs） against oxidative low-density lipoprotein（ox-LDL）-induced "injury.Methods：The HCAECs treated with 24 μg/mL ox-LDL for 40 h induced injury and inflammation，and the non-ox-LDL treated HCAECs served as the control group.HCAECs treated with ox-LDL were divided into HCAECs group，L-form group（16 μmol/L Form），M-Form group（32 μmol/L Form），H-Form group（64 μmol/L Form） and lipopolysaccharide（LPS） group（5 μg/mL） TLR4/NF-κB p65 pathway activator LPS） and H-Form＋LPS groups（64 μmol/L Form＋5 μg/mL LPS）.Cell proliferation activity was detected by cell counting（CCK-8）.Flow cytometry was used to detect apoptosis.Cell migration and invasion were measured by Transwell method.Matrix glue was used to evaluate tube formation ability.The levels of interleukin-1β（IL-1β），interleukin-6（IL-6），and tumor necrosis factor-α（TNF-α） were detected by enzyme-linked immunosorbent assay（ELISA）.Western Blot was used to detect TLR4/NF-κB pathway protein expression.Results：Compared with the control group，the apoptosis rate，the levels of IL-1β，IL-6，TNF-α，the expression of TLR4，P-NF-κB p65/NF-κB p65 protein in HCAECs group "significantly increased（P＜0.05），and the OD value of cell proliferation activity "significantly decreased（P＜0.05），the number of migrating cells，the number of invading cells，the number of capillary tube nodes significantly decreased（P＜0.05），and the total tube length significantly reduced（P＜0.05）.Compared with HCAECs group，the apoptosis rate of HCAECs cells，the levels of IL-1β，IL-6，and TNF-α，and the expression of TLR4 and P-NF-κB p65/NF-κB p65 protein in L-Form，M-Form，and H-Form groups significantly decreased（P＜0.05）.OD value of cell proliferation activity，number of migrating cells，number of invading cells，number of capillary tube nodes，and total tube length significantly increased（P＜0.05），but the trend was opposite in LPS group.LPS eliminated the beneficial effect of high concentration Form on HCAECs cells.Conclusion：Form may alleviate ox-LDL-induced HCAECs damage by inhibiting the TLR4/NF-κB signaling pathway.

Keywords""formononetin; human coronary artery endothelial cells; oxidative low-density lipoprotein; Toll-like receptor 4/nuclear factor κB pathway; experimental study

冠狀動脈疾病是一種常見的心血管疾病，嚴(yán)重威脅著全球范圍內(nèi)人類的健康和生命。據(jù)估計，2017年全球有1 780萬人死于心血管疾病，其中50%以上是由冠心病引起的^［1］。眾所周知，動脈粥樣硬化（AS）是冠狀動脈疾病的主要原因。動脈內(nèi)皮功能障礙是一個潛在的起始因素，與冠狀動脈AS的各個階段有關(guān)^［2］。研究表明，AS是內(nèi)皮細(xì)胞損傷的結(jié)果^［3］。氧化型低密度脂蛋白（ox-LDL）在AS形成和內(nèi)皮細(xì)胞損傷中起關(guān)鍵作用，ox-LDL引起的內(nèi)皮損傷，可促進(jìn)多種炎癥細(xì)胞浸潤受損的血管內(nèi)皮^［4］。芒柄花黃素（Form）是一種從中藥黃芪中鑒定出的類黃酮，在不同的人類疾病中具有抗炎或抗氧化特性。研究表明，F(xiàn)orm可以預(yù)防ox-LDL誘導(dǎo)的內(nèi)皮功能障礙，進(jìn)而緩解冠狀動脈疾病^［5］。Ma等^［6］研究也發(fā)現(xiàn)Form可以減輕冠心病小鼠AS。然而，其具體影響機制尚未明確。Toll樣受體4（TLR4）/核因子κB（NF-κB）通路在氧化應(yīng)激反應(yīng)和炎癥中具有明顯作用，與AS密切相關(guān)，下調(diào)TLR4/NF-κB信號傳導(dǎo)可以抑制炎癥并改善載脂蛋白E（ApoE）缺陷小鼠的AS^［7］。He等^［8］研究發(fā)現(xiàn)，F(xiàn)orm可以通過調(diào)控TLR4/NF-κB信號軸改善膿毒癥小鼠所致心功能不全。本研究探討Form是否可以通過下調(diào)TLR4/NF-κB信號傳導(dǎo)減輕ox-LDL誘導(dǎo)的人冠狀動脈內(nèi)皮細(xì)胞（HCAECs）損傷。

1 材料與方法

1.1 細(xì)胞及主要材料

HCAECs（貨號：YS3585C）購自上海雅吉生物科技有限公司；Form（貨號YT62736）購自北京伊塔生物科技有限公司；TLR4/NF-κB信號通路激活劑脂多糖（LPS，貨號：A2313）、ox-LDL（貨號：B5435）購自北京康瑞納生物科技有限公司；細(xì)胞計數(shù)（CCK-8）細(xì)胞增殖試劑盒（貨號：CA1210）購自北京索萊寶科技有限公司；V-異硫氰酸熒光素（Annexin V-FITC）/碘化丙啶（propidium iodide，PI）細(xì)胞凋亡試劑盒（貨號：70-APCC101）購自杭州聯(lián)科生物技術(shù)股份有限公司；TLR4抗體（貨號：ab13556）、磷酸化NF-κB（p-NF-κB）p65抗體（貨號：ab194729）、NF-κB p65抗體（貨號：ab220803）購自Abcam公司。

1.2 細(xì)胞培養(yǎng)及分組

將購買的HCAECs在添加10%胎牛血清（FBS）的DMEM培養(yǎng)基中培養(yǎng)，置于37 ℃、含有5%CO₂的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。用24 μg/mL的ox-LDL處理40 h^［5］，誘導(dǎo)內(nèi)皮損傷和炎癥。未用ox-LDL處理的HCAECs作為對照組。

當(dāng)ox-LDL誘導(dǎo)的HCAECs達(dá)到60%～70%的融合時，分為HCAECs組、L-Form組、M-Form組、H-Form組、LPS組、H-Form＋LPS組。L-Form組、M-Form組、H-Form組分別用16、32、64 μmol/L的Form處理HCAECs^［9］；LPS組用5 μg/mL TLR4/NF-κB通路激活劑"LPS處理HCAECs^［10］；H-Form＋LPS組在64 μmol/L Form處理的基礎(chǔ)上用5 μg/mL LPS處理HCAECs，培養(yǎng)48 h后，收集HCAECs用于后續(xù)實驗。

1.3 CCK-8法檢測細(xì)胞增殖活性

將藥物處理后的HCAECs以1×10⁴個/孔的密度接種到96孔板中培養(yǎng)48 h，然后與CCK-8溶液在37 ℃下共孵育2 h。共孵育后，在450 nm處讀取每孔細(xì)胞的光密度值（OD）。

1.4 流式細(xì)胞術(shù)檢測細(xì)胞凋亡

將各組HCAECs用磷酸鹽緩沖液（PBS）漂洗，胰蛋白酶消化后，在3 000 r/min下離心5 min收集細(xì)胞，隨后用預(yù)冷PBS洗滌3次，用500 μL的Binding Buffer制成單細(xì)胞懸液，加入5 μL的Annexin V-FITC 孵育5 min后加入5 μL的PI孵育15 min，用流式細(xì)胞儀分析HCAECs凋亡率。

1.5 Transwell法測定細(xì)胞遷移和侵襲

將各組HCAECs以1×10⁵個/mL的濃度置于涂有基質(zhì)膠（侵襲）或不涂有基質(zhì)膠（遷移）的Transwell上室，下室加入600 μL的DMEM培養(yǎng)基和10% FBS，培養(yǎng)4 h后，用4%多聚甲醛固定細(xì)胞，擦拭膜上未侵襲/遷移的細(xì)胞，結(jié)晶紫染色，光學(xué)顯微鏡觀察。并使用Image J軟件對隨機選擇的3個區(qū)域計數(shù)。

1.6 基質(zhì)膠評估管形成能力

在預(yù)冷的48孔板中每孔加入150 μL基質(zhì)凝膠，在37 ℃下孵育30 min。將HCAECs（每孔5×10⁴個細(xì)胞）加入到涂有基質(zhì)凝膠的孔中，在細(xì)胞培養(yǎng)條件下共孵育6 h。共孵育后，使用ImageJ軟件測量用于評估管形成能力的毛細(xì)管管樣的節(jié)點數(shù)和總長度。

1.7 酶聯(lián)免疫吸附試驗（ELISA）檢測炎性因子水平

使用ELISA試劑盒檢測HCAECs中白細(xì)胞介素-1β（IL-1β）、白細(xì)胞介素-6（IL-6）、腫瘤壞死因子-α（TNF-α）水平。

1.8 蛋白免疫印跡法（Western Blot）檢測TLR4/NF-κB蛋白水平

RIPA裂解緩沖液提取細(xì)胞總蛋白。采用二喹啉甲酸（BCA）法測定蛋白濃度。將等量的總蛋白加到10%聚丙烯酰胺凝膠中進(jìn)行電泳后，轉(zhuǎn)移到聚偏二氟乙烯（PVDF）膜，用5%牛血清白蛋白（BSA）封閉2 h。將膜與適當(dāng)?shù)囊豢筎LR4（1∶1 000）、NF-κB p65（1∶2 000）、p-NF-κB p65（1∶1 000）和甘油醛-3-磷酸脫氫酶（GAPDH）抗體（1∶1 000）4 ℃下孵育，次日加入二抗，室溫孵育4 h，通過加入增強化學(xué)發(fā)光試劑（enhanced chemiluminescence，ECL）試劑使其顯影后，使用Image J軟件分析目標(biāo)蛋白的灰度值。

1.9 統(tǒng)計學(xué)處理

采用GraphPad Prism 8.0軟件處理數(shù)據(jù)。符合正態(tài)分布的定量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（x±s）表示，多組間比較采用單因素方差分析，進(jìn)一步兩組間比較采用SNK-q檢驗。以P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 Form對HCAECs增殖活性的影響

與對照組相比，HCAECs組HCAECs增殖活性O(shè)D值明顯下降（P＜0.05）；與HCAECs組相比，L-Form組、M-Form組、H-Form組HCAECs增殖活性O(shè)D值明顯升高（P＜0.05），且H-Form組＞M-Form組＞L-Form組，而LPS組HCAECs增殖活性O(shè)D值較HCAECs組明顯下降（P＜0.05）；與H-Form組相比，H-Form＋LPS組HCAECs增殖活性O(shè)D值明顯降低（P＜0.05）。詳見表1。

2.2 Form對HCAECs凋亡的影響

與對照組相比，HCAECs組HCAECs凋亡率明顯升高（P＜0.05）；與HCAECs組相比，L-Form組、M-Form組、H-Form組HCAECs凋亡率明顯下降（P＜0.05），且呈劑量依賴性，而LPS組HCAECs凋亡率較HCAECs組明顯上升（P＜0.05）；與H-Form組相比，H-Form＋LPS組凋亡率明顯上升（P＜0.05）。詳見圖1、表2。

2.3 Form對HCAECs遷移、侵襲的影響

與對照組相比，HCAECs組遷移、侵襲數(shù)量明顯減少（P＜0.05）；與HCAECs組相比，L-Form組、M-Form組、H-Form組HCAECs遷移、侵襲數(shù)量明顯增多（P＜0.05），且呈劑量依賴性，而LPS組遷移、侵襲數(shù)量較HCAECs組明顯減少（P＜0.05）；與H-Form組相比，H-Form＋LPS組HCAECs遷移、侵襲數(shù)量明顯減少（P＜0.05）。詳見圖2、表3。

2.4 Form對HCAECs管形成的影響

與對照組相比，HCAECs組毛細(xì)管管樣的節(jié)點數(shù)量減少（P＜0.05），管總長度明顯縮?。?em>P＜0.05）；與HCAECs組相比，L-Form組、M-Form組、H-Form組HCAECs毛細(xì)管管樣的節(jié)點數(shù)量、管總長度明顯增加（P＜0.05），且呈劑量依賴性，而LPS組毛細(xì)管管樣的節(jié)點數(shù)量較HCAECs組減少（P＜0.05），管總長度明顯縮小（P＜0.05）；與H-Form組相比，H-Form＋LPS組HCAECs毛細(xì)管管樣的節(jié)點數(shù)量減少（P＜0.05），管總長度明顯縮?。?em>P＜0.05）。詳見圖3、表4。

2.5 Form對HCAECs炎性因子的影響

與對照組相比，HCAECs組IL-1β、IL-6、TNF-α水平明顯升高（P＜0.05）；與HCAECs組相比，L-Form組、M-Form組、H-Form組IL-1β、IL-6、TNF-α水平明顯降低（P＜0.05），且呈劑量依賴性，而LPS組IL-1β、IL-6、TNF-α水平較HCAECs組明顯升高（P＜0.05）；與H-Form組相比，H-Form＋LPS組IL-1β、IL-6、TNF-α水平明顯升高（P＜0.05）。詳見表5。

2.6 Form對HCAECs TLR4/NF-κB通路蛋白水平的影響

與對照組相比，HCAECs組TLR4、p-NF-κB p65/NF-κB p65蛋白表達(dá)明顯升高（P＜0.05）；與HCAECs組相比，L-Form組、M-Form組、H-Form組TLR4、p-NF-κB p65/NF-κB p65蛋白表達(dá)明顯降低（P＜0.05），且呈劑量依賴性，而LPS組TLR4、p-NF-κB p65/NF-κB p65蛋白表達(dá)較HCAECs組明顯升高（P＜0.05）；與H-Form組相比，H-Form＋LPS組TLR4、p-NF-κB p65/NF-κB p65蛋白表達(dá)明顯升高（P＜0.05）。詳見圖4、表6。

3 討論

我國冠狀動脈疾病的死亡率高于癌癥或其他已知疾病^［11-12］。ox-LDL是已知的冠狀動脈疾病危險因素，研究指出，AS性心血管疾病病人血漿ox-LDL水平升高，而ox-LDL的過量產(chǎn)生導(dǎo)致HUVECs異常增殖、凋亡、遷移、血管生成和炎癥反應(yīng)，均是導(dǎo)致內(nèi)皮細(xì)胞損傷的原因^［13］。Form是從黃芪中提取的主要類黃酮成分，對心血管疾病具有保護作用。研究發(fā)現(xiàn)，F(xiàn)orm可以抑制ApoE基因缺陷小鼠AS的發(fā)生^［6］。Zhang等^［5］研究也發(fā)現(xiàn)，F(xiàn)orm可以改善ox-LDL誘導(dǎo)的內(nèi)皮功能障礙。本研究采用24 μg/mL的ox-LDL處理HCAECs 40 h建立體外損傷模型，進(jìn)一步探索Form對ox-LDL誘導(dǎo)的HCAECs損傷的影響。

既往研究表明，ox-LDL可抑制AS病人HUVEC的遷移和增殖^［14］，高濃度的ox-LDL可以通過多種方式誘導(dǎo)不同細(xì)胞的凋亡^［15］。本研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)，ox-LDL處理后HCAECs細(xì)胞的OD值、遷移、侵襲數(shù)量明顯下降，凋亡率明顯升高，與先前研究結(jié)果一致，表明ox-LDL可以促進(jìn)HCAECs細(xì)胞凋亡，抑制細(xì)胞增殖，造成HCAECs損傷。而Form治療后HCAECs增殖活性O(shè)D值、遷移、侵襲數(shù)量明顯升高，凋亡率明顯下降，表明Form可能通過促進(jìn)HCAECs細(xì)胞增殖，抑制其凋亡，改善HCAECs損傷。血管內(nèi)皮細(xì)胞炎癥參與AS的各個階段^［16］。ox-LDL通過誘導(dǎo)血管內(nèi)皮炎癥和細(xì)胞凋亡來促進(jìn)AS斑塊的形成和發(fā)展^［17］。研究表明，ox-LDL處理HCAECs后IL-1β、IL-6、TNF-α水平明顯升高，加重炎癥損傷^［18］。本研究結(jié)果與其一致，HCAECs組IL-1β、IL-6、TNF-α水平明顯上升，而Form干預(yù)后IL-1β、IL-6、TNF-α水平明顯下降，表明Form可能減輕ox-LDL誘導(dǎo)的HCAECs炎性損傷。血管生成是一個復(fù)雜的生理過程，血管生成異常不僅促進(jìn)炎癥反應(yīng)，而且在AS中發(fā)揮作用^［19］。促進(jìn)血管生成可以減少內(nèi)皮炎癥進(jìn)而減輕AS^［20］。本研究發(fā)現(xiàn)，F(xiàn)orm治療后毛細(xì)管管樣的節(jié)點數(shù)量、管總長度明顯增加，表明Form可促進(jìn)ox-LDL誘導(dǎo)的HCAECs血管生成，減輕炎癥反應(yīng)。

TLR4/NF-κB信號通路是研究AS的常見通路，Li等^［21］研究發(fā)現(xiàn)，下調(diào)TLR4/NF-κB通路可以抑制巨噬細(xì)胞脂質(zhì)積累和炎癥反應(yīng)，減輕AS。Zhu等^［22］研究也發(fā)現(xiàn)，下調(diào)TLR4/NF-κB通路可以抑制炎癥，減輕ApoE基因缺陷小鼠的AS程度。在本研究中，ox-LDL處理后HCAECs中TLR4、p-NF-κB p65/NF-κB p65蛋白表達(dá)明顯升高，而Form處理使TLR4、p-NF-κB p65/NF-κB p65蛋白水平明顯降低，表明Form可能通過下調(diào)TLR4/NF-κB信號通路來減輕ox-LDL誘導(dǎo)的HCAECs損傷。為了進(jìn)一步證實，本研究將ox-LDL誘導(dǎo)的HCAECs用TLR4/NF-κB通路激活劑LPS處理，結(jié)果發(fā)現(xiàn)激活TLR4/NF-κB 信號通路加重HCAECs損傷。且LPS可以逆轉(zhuǎn)高濃度Form對HCAECs的有利影響，進(jìn)一步證實，F(xiàn)orm可能通過抑制TLR4/NF-κB信號通路來緩解ox-LDL誘導(dǎo)的HCAECs損傷。

綜上所述，F(xiàn)orm可能通過下調(diào)TLR4/NF-κB信號通路來改善ox-LDL誘導(dǎo)的HCAECs損傷。但是本研究未進(jìn)行體內(nèi)實驗，今后將進(jìn)行體內(nèi)實驗，以驗證Form對冠狀動脈疾病小鼠的干預(yù)效果。

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（收稿日期：2023-08-10）

（本文編輯"郭懷?。?/p>