多花黃精PcWRKY1基因的克隆及響應(yīng)高溫脅迫功能分析

摘要：探究WRKY轉(zhuǎn)錄因子家族在多花黃精（Polygonatum cyrtonema Hua）適應(yīng)高溫脅迫中的作用，基于前期轉(zhuǎn)錄組分析鑒定到受高溫影響顯著下調(diào)的基因PcWRKY1，克隆了PcWRKY1基因，并利用生物信息學(xué)、RT-qPCR和玉米原生質(zhì)體瞬時(shí)轉(zhuǎn)化體系等技術(shù)對(duì)其編碼蛋白的基本特性、組織表達(dá)特異性、高溫脅迫下表達(dá)模式及功能進(jìn)行了分析。結(jié)果顯示：PcWRKY1基因CDS序列全長(zhǎng)共1 560 bp，編碼519個(gè)氨基酸；PcWRKY1蛋白沒有跨膜結(jié)構(gòu)，分子量為 56.93 ku，等電點(diǎn)為7.2，具有2個(gè)WRKY保守結(jié)構(gòu)域，屬于Group Ⅰa類群；RT-qPCR分析結(jié)果顯示，PcWRKY1基因在多花黃精不同組織中均有表達(dá)，且在種子中表達(dá)量最高，其轉(zhuǎn)錄水平受高溫脅迫的抑制；玉米原生質(zhì)體中PcWRKY1定位于細(xì)胞核中，且高溫處理不影響其位點(diǎn)；在玉米原生質(zhì)體中瞬時(shí)過表達(dá)PcWRKY1，與無高溫脅迫相比，抑制了過氧化氫酶（CAT）活性的增加，提高了高溫脅迫誘導(dǎo)的丙二醛（MDA）含量的增加，說明過表達(dá)PcWRKY1降低了原生質(zhì)體在高溫脅迫下的耐性。綜上所述，PcWRKY1可能在多花黃精響應(yīng)高溫脅迫中起負(fù)調(diào)控作用。

關(guān)鍵詞：多花黃精；WRKY轉(zhuǎn)錄因子；高溫脅迫；生物信息學(xué)分析；功能分析

中圖分類號(hào)：S188；S567.23+9.01" 文獻(xiàn)標(biāo)志碼：A

文章編號(hào)：1002-1302（2025）04-0200-09

收稿日期：2024-10-29

基金項(xiàng)目：國(guó)家重點(diǎn)研發(fā)計(jì)劃（編號(hào)：2022YFD1601808）；國(guó)家現(xiàn)代農(nóng)業(yè)產(chǎn)業(yè)技術(shù)體系建設(shè)專項(xiàng)（編號(hào)：CARS-21）；河南省現(xiàn)代農(nóng)業(yè)產(chǎn)業(yè)技術(shù)體系建設(shè)專項(xiàng)（編號(hào)：HARS-22-11-G2）。

作者簡(jiǎn)介：賈 慧（1999—），女，河南滎陽人，碩士研究生，主要從事中藥資源學(xué)研究。E-mail：2396554366@qq.com。

通信作者：臘貴曉，博士，副研究員，主要從事中藥材生態(tài)栽培、育種等研究。E-mail：zju-1@163.com。

多花黃精（Polygonatum cyrtonema Hua）為百合科（Liliaceae）黃精屬（Polygonatum）多年生草本植物，其根莖常被用作藥物和食物，具有降低血糖、抗癌、調(diào)節(jié)免疫力及抑菌等功效，是《中華人民共和國(guó)藥典》收錄的3種藥用黃精之一［1-2］。近年來，隨著對(duì)多花黃精的藥用價(jià)值和營(yíng)養(yǎng)保健等功能的逐步挖掘，其原料的需求量也日益增加，致使價(jià)格不斷上漲，供不應(yīng)求。但掠奪式的采挖方式導(dǎo)致自然資源枯竭，野生產(chǎn)能急劇下降，遠(yuǎn)不能滿足市場(chǎng)需求，因此，越來越多的人開始選擇人工種植多花黃精［3］。

隨著溫室氣體濃度的逐年上升，全球氣候日益變暖，極端高溫的發(fā)生更為頻繁、強(qiáng)度更強(qiáng)、持續(xù)時(shí)間更久［4］。氣溫升高已成為限制植物生長(zhǎng)和產(chǎn)量的主要非生物脅迫之一。當(dāng)植物遭受高溫脅迫時(shí)，常常會(huì)對(duì)其生理、生化和發(fā)育造成嚴(yán)重的影響。例如高溫使蛋白質(zhì)變性、聚集和降解，同時(shí)抑制蛋白質(zhì)的合成，加速活性氧（ROS）的產(chǎn)生和葉綠素降解，增加膜脂的流動(dòng)性和滲透性，引起細(xì)胞器的功能紊亂，加速細(xì)胞衰老，引起植物光合作用器官的提前衰老等［5- 9］。而多花黃精作為中性需光植物，喜陰涼和濕潤(rùn)的環(huán)境，但極端高溫災(zāi)害事件的頻發(fā)，給多花黃精種植帶來極大阻礙。大田栽培過程中，夏季的極端高溫天氣會(huì)對(duì)多花黃精造成高溫脅迫，從而引起植物細(xì)胞膜損傷，損害葉綠體結(jié)構(gòu)導(dǎo)致凈光合速率下降，影響其根莖生長(zhǎng)和有效活性成分的積累，嚴(yán)重的還會(huì)使多花黃精提前倒伏、病蟲害加重甚至整株死亡［10-11］。但是，目前對(duì)多花黃精在響應(yīng)高溫脅迫中的研究少之又少。因此，克隆調(diào)控多花黃精耐熱性相關(guān)的基因，并解析其在高溫脅迫的作用機(jī)制，不但有助于對(duì)多花黃精耐熱機(jī)制的理解，而且可以為多花黃精分子輔助育種提供新的理論依據(jù)。

研究報(bào)道，植物可以通過調(diào)控許多轉(zhuǎn)錄因子（TF）進(jìn)而調(diào)控相關(guān)基因的表達(dá)，從而參與對(duì)外界脅迫的響應(yīng)，如MYB、AP2/ERFBP、NAC和WRKY［12］。而植物特異性WRKY轉(zhuǎn)錄因子是一種研究最為廣泛的基因轉(zhuǎn)錄因子家族之一，能夠響應(yīng)不同非生物脅迫（寒冷、干旱、UV-B、高溫、鹽和堿性環(huán)境），并且通過結(jié)合下游基因啟動(dòng)子的W-box順式作用元件，以作為靶基因表達(dá)的抑制因子和激活因子，并在關(guān)鍵信號(hào)通路發(fā)揮重要作用［13］。AtWRKY57可以直接與RD29A和NCED3啟動(dòng)子區(qū)域的W-box結(jié)合，上調(diào)了這2個(gè)脅迫基因的表達(dá)，而且擬南芥過表達(dá)植株的耐旱性也得到了增強(qiáng)［14］；棉花中GhWRKY17的轉(zhuǎn)錄水平受到干旱脅迫、鹽脅迫和H2O2的誘導(dǎo)，從而有可能調(diào)控下游耐性基因的表達(dá)增強(qiáng)其耐性［15］；通過UV-B輻射處理，可以誘導(dǎo)擬南芥中3個(gè)AtWRKY基因和水稻中OsWRKY89的表達(dá)，而它們通過調(diào)控蠟質(zhì)物質(zhì)合成的基因從而使其在葉片表面產(chǎn)生較厚的蠟質(zhì)物質(zhì)，提高了對(duì)高溫的耐受性［16-17］。此外，越來越多的研究表明WRKY家族參與了植物對(duì)高溫脅迫的響應(yīng)，當(dāng)植物受到高溫脅迫時(shí)，其通過調(diào)控多種途徑的下游靶基因的表達(dá)，從而響應(yīng)外部脅迫［18-19］。

目前，有關(guān)多花黃精WRKY轉(zhuǎn)錄因子的報(bào)道尚不多見，并且在高溫中的功能也并不清楚。因此，本研究以前期多花黃精在轉(zhuǎn)錄組學(xué)中鑒定得到的顯著受高溫下調(diào)的PcWRKY1為研究對(duì)象（數(shù)據(jù)未發(fā)表）為基礎(chǔ)，克隆其基因編碼序列的全長(zhǎng)，并利用生物信息學(xué)分析其基因，同時(shí)探究其在不同組織、高溫脅迫處理后的表達(dá)模式；同時(shí)，又利用玉米原生質(zhì)體瞬時(shí)轉(zhuǎn)化體系對(duì)其正常條件和高溫脅迫下亞細(xì)胞定位和生理指標(biāo)進(jìn)行分析，初步確定PcWRKY1在高溫下的功能。以期對(duì)進(jìn)一步研究PcWRKY1在高溫中功能及其作用機(jī)制奠定基礎(chǔ)，也為培育耐熱性強(qiáng)、適應(yīng)性廣的優(yōu)良多花黃精新品種提供優(yōu)良的基因資源。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

以2年生多花黃精根莖為無性繁殖材料，于2023年10月種植于河南省農(nóng)業(yè)科學(xué)院現(xiàn)代農(nóng)業(yè)科技試驗(yàn)示范基地的多花黃精為試驗(yàn)材料，用于基因的克隆、表達(dá)模式分析；質(zhì)粒pCAMBIA1302-GFP由河南農(nóng)業(yè)大學(xué)胡秀麗教授提供，用于亞細(xì)胞定位和瞬時(shí)過表達(dá)；暗培養(yǎng)的玉米自交系B73的第2張完全展開葉，用于提取玉米原生質(zhì)體。

試驗(yàn)試劑：KOD OneTM PCR Master Mix-Blue高保真酶（貨號(hào)：KMM-201，TOYOBO，上海），RNA提取試劑盒（貨號(hào)：R6827-01，Omega Bio-Tek，廣州）、HiScript Ⅱ 1st Strand cDNA Synthesis Kit （+gDNA wiper） 逆轉(zhuǎn)錄試劑盒（貨號(hào)：R212-01，諾唯贊，南京）、小量瓊脂糖凝膠DNA回收試劑盒（貨號(hào)：ZP202-2，莊盟，北京）、Taq Pro Universal SYBR qPCR Master Mix熒光定量試劑盒（貨號(hào)：Q712-02，諾唯贊，南京）、限制性內(nèi)切酶（NEB，美國(guó)）、一步法無縫克隆試劑盒（貨號(hào)：10923ES50，翊圣，上海）、大腸桿菌DH5α感受態(tài)（貨號(hào)：DL1001，唯地，上海）、質(zhì)粒小提試劑盒（貨號(hào)：DP103，天根，北京）、無內(nèi)毒素質(zhì)粒大提試劑盒（增強(qiáng)型）（貨號(hào)：DP120，天根，北京）、纖維素酶Cellulose R-10（貨號(hào)：MX7352，Yakult，日本）、離析酶Macerozyme R-10（貨號(hào)：MX7351，Yakult，日本）、丙二醛（MDA）含量檢測(cè)試劑盒（貨號(hào)：BC0025，索萊寶，上海）和過氧化氫酶（CAT）活性檢測(cè)試劑盒（貨號(hào)：BC0205，索萊寶，上海），其他試劑均購自索萊寶。

1.2 PcWRKY1基因的克隆及生物信息學(xué)分析

1.2.1 基因克隆 以有1個(gè)完整頂芽的多花黃精根莖（2年生）為無性繁殖材料培育的多花黃精幼苗的葉片、根、莖和塊莖的混合材料為基礎(chǔ)，利用RNA提取試劑盒提取總RNA，使用逆轉(zhuǎn)錄試劑盒逆轉(zhuǎn)錄生成cDNA；根據(jù)轉(zhuǎn)錄組所提供的臨時(shí)轉(zhuǎn)錄本為參考，設(shè)計(jì)特異性引物（F：5′-ATGGCTTCTTCAACTGGGAGTTT-3′，R：5′-TTAACATAGCAGCGATTCGATGAACA-3′），使用高保真酶進(jìn)行PCR擴(kuò)增，擴(kuò)增程序?yàn)椋?8 ℃ 5 min；98 ℃ 10 s，60 ℃ 5 s，68 ℃ 10 s，共計(jì)35個(gè)循環(huán)；68 ℃、10 min，4 ℃保存；使用1%的瓊脂糖凝膠電泳進(jìn)行電泳檢測(cè)，檢測(cè)無誤后利用膠回收試劑盒切膠回收，回收產(chǎn)物送到生工生物工程（上海）股份有限公司進(jìn)行測(cè)序（試劑盒具體操作步驟見說明書）。

1.2.2 生物信息學(xué)分析 通過相關(guān)的在線生信網(wǎng)站（表1）對(duì)測(cè)序獲得PcWRKY1基因編碼蛋白的氨基酸數(shù)目、蛋白相對(duì)分子質(zhì)量、等電點(diǎn)、蛋白的親疏水性、跨膜區(qū)域、蛋白結(jié)構(gòu)域和蛋白的二級(jí)、三維結(jié)構(gòu)等；利用軟件MEGA 8.0和在線網(wǎng)站對(duì)其同源蛋白序列進(jìn)行進(jìn)化樹分析。

1.3 材料處理

1.3.1 組織特異性表達(dá)分析 2024年6月，取種植在現(xiàn)代農(nóng)業(yè)科技試驗(yàn)示范基地中多花黃精的根、莖、葉、塊莖以及保存的種子為試驗(yàn)材料，取樣后用液氮速凍放置于-80 ℃保存。

1.3.2 高溫脅迫處理 2024年6月，取種植在現(xiàn)代農(nóng)業(yè)科技試驗(yàn)示范基地中多花黃精幼苗，移栽入新的花盆中，在人工氣候箱中進(jìn)行培養(yǎng)（培養(yǎng)溫度為白天28 ℃/夜晚22 ℃，光照14 h—黑暗 10 h），培養(yǎng)幼苗株高至20 cm左右，選取生長(zhǎng)狀態(tài)一致的幼苗進(jìn)行高溫脅迫處理。高溫處理采取2種不同的處理方法：直接高溫處理，處理的溫度為40 ℃，高溫處理的時(shí)間為0、0.5、1、2、4、8、10 h；模擬大田高溫處理的方法為采用梯度升溫的方法，以2 ℃/h的升溫速度從28 ℃上升到40 ℃，并在40 ℃維持 2 h，共計(jì)高溫脅迫處理8 h。取樣后用液氮速凍放置于 -80 ℃ 保存；原生質(zhì)體的高溫脅迫處理?xiàng)l件是 38 ℃、30 min。

1.3.3 實(shí)時(shí)熒光定量PCR分析 對(duì)所需進(jìn)行表達(dá)模式分析的材料利用RNA提取試劑盒提取RNA，經(jīng)檢驗(yàn)合格后逆轉(zhuǎn)錄合成cDNA。利用Primer Premier 6.0設(shè)計(jì)所需特異性引物（F：5′-ATCCTCCATCTCTCCCGA-3′，R：5′-CCTCTTTGACGCCTTGCT-3′），使用SYBR Green熒光染料、Step One Plus熒光定量PCR儀（ABI，USA）進(jìn)行RT-qPCR檢測(cè)，用2-ΔΔCT法計(jì)算相對(duì)表達(dá)量數(shù)值。PcGAPDH為本試驗(yàn)的內(nèi)參基因（F：5′-CCATGGTCAACGTCGGAATC-3′，R：5′-GCGAAGATGTGGATGGCTTT-3′）。

1.4 PcWRKY1基因的瞬時(shí)過表達(dá)載體的構(gòu)建

使用同源重組的方法進(jìn)行載體的構(gòu)建。用限制性內(nèi)切酶NcoⅠ和SpeⅠ將pCAMBIA1302-GFP的質(zhì)粒進(jìn)行雙酶切，完全酶切后純化回收并與純化回收的PcWRKY1基因進(jìn)行酶連，體系為：3 μL的PcWRKY1基因擴(kuò)增產(chǎn)物、2 μL回收后的酶切產(chǎn)物、5 μL 的同源重組酶，條件為：50 ℃、15 min。然后，將連接產(chǎn)物利用熱激法轉(zhuǎn)化至大腸桿菌DH5α感受態(tài)后加入800 μL無抗性的LB培養(yǎng)基，37 ℃、220 r/min 活化1 h；涂于相應(yīng)抗性的LB固體平板，37 ℃培養(yǎng)至單菌落形成；在超凈工作臺(tái)中挑取陽性單菌落至1 mL相應(yīng)抗性的LB培養(yǎng)液中，37 ℃、220 r/min 擴(kuò)搖 16 h 后送生工生物工程（上海）股份有限公司進(jìn)行測(cè)序。測(cè)序結(jié)果使用DNAman 8.0軟件進(jìn)行序列比對(duì)，比對(duì)結(jié)果無誤的菌液加入終濃度為25%的甘油置于-80 ℃冰箱保存，用于后續(xù)研究。其中PcWRKY1基因擴(kuò)增的同源重組引物為F：5′-acgggggactcttgaccatggaaATGGCTTCTTCAACTGGGAGTTT-3′，R：5′-aagttcttctcctttactagtACATAGCAGCGATTCGATGAACA-3′。

1.5 玉米原生質(zhì)體的提取和轉(zhuǎn)化

玉米原生質(zhì)體的提取和轉(zhuǎn)化參照Zhao等的方法［20］。

1.5.1 原生質(zhì)體的提取 剪下玉米黃化苗（從玉米幼苗出土后約5 cm后置于黑暗條件下培養(yǎng)10～12 d）的第2張葉片，用鋒利的刀片將其切成1～2 mm 的細(xì)絲，然后浸入20 mL的酶解液中［1.5%（質(zhì)量體積比） 纖維素酶、0.3%（質(zhì)量體積比）離析酶、600 mmol/L甘露醇、1 mmol/L MES（一水合物）、1 mmol/L氯化鈣、0.1%（質(zhì)量體積比）牛血清蛋白和0.035%（體積比）β-巰基乙醇，pH值5.8］；然后將其放入避光的真空泵中抽真空1 h；取出酶解液置于水平搖床上40 r/min、25 ℃避光酶解3 h；然后80 r/min、25 ℃劇烈振蕩5 min；最后利用300目細(xì)胞篩過濾掉未酶解組織，收集過濾液至 50 mL 離心管中，100 g離心3 min，輕棄上清液，加入5 mL洗脫緩沖液［600 mmol/L甘露醇、4 mmol/L MES（一水合物）、20 mmol/L氯化鉀，pH值 5.8］再次100 g離心3 min，重復(fù)1次；再加入10 mL的洗脫緩沖液，用移液槍輕吹混勻，置于冰上黑暗靜置30 min；然后100 g離心3 min，輕棄上清液，在沉淀中加入約5 mL的Mmg［400 mmol/L甘露醇、15 mmol/L 六水氯化鎂、4 mmol/L MES（一水合物），pH值5.8］重懸浮原生質(zhì)體，使用細(xì)胞計(jì)數(shù)板調(diào)整溶液中原生質(zhì)體密度為2×105 個(gè)/mL后用于下步試驗(yàn)。

1.5.2 質(zhì)粒的大量提取 從-80 ℃保存的構(gòu)建好的甘油菌中吸取50 μL菌液，接種5 mL的相應(yīng)抗性液體LB培養(yǎng)基中37 ℃、220 r/min培養(yǎng)至D600 nm為1.6～1.8；取上步2 mL的菌液于200 mL的LB液體培養(yǎng)基中，37 ℃，220 r/min培養(yǎng)至D600 nm為2.0。然后利用無內(nèi)毒素質(zhì)粒大提試劑盒提取質(zhì)粒，質(zhì)粒的終濃度應(yīng)大于1 μg/μL（試劑盒具體操作步驟見說明書）。

1.5.3 原生質(zhì)體的轉(zhuǎn)化 將上述大量提取的 10 μg 的質(zhì)粒DNA和100 μL的原生質(zhì)體（濃度約為5×105個(gè)/mL）分別加入2 mL的離心管底部，移液槍輕吹混勻；加入等體積的PEG轉(zhuǎn)化試劑［40%（質(zhì)量體積比） PEG 4000、200 mmol/L甘露醇和 100 mmol/L 氯化鈣］，然后輕輕混勻，置于25 ℃黑暗條件下培養(yǎng) 40 min；用440 μL的W5［600 mmol/L甘露醇、3 mmol/L MES（一水合物）和20 mmol/L氯化鉀，pH值5.8］輕輕混勻后100 g離心3 min后輕棄上清，重復(fù)2～3遍，直至完全清洗干凈；最后置于1 mL的原生質(zhì)體培養(yǎng)液［600 mmol/L甘露醇、3 mmol/L MES（一水合物）和4 mmol/L氯化鉀，pH值5.8］，25 ℃ 黑暗條件下培養(yǎng)16 h用于后續(xù)研究。

1.6 亞細(xì)胞定位的觀察

將35S：AtIMP4-mCherry分別與重組質(zhì)粒35S：PcWRKY1-GFP和35S：GFP混勻后，利用PEG-Ca介導(dǎo)的玉米原生質(zhì)體瞬時(shí)轉(zhuǎn)化技術(shù)轉(zhuǎn)化入玉米原生質(zhì)體，培養(yǎng)結(jié)束后，用激光共聚焦顯微鏡（Nikon AIR HD25，日本）進(jìn)行觀察，其中AtIMP4是擬南芥中定位于細(xì)胞核的蛋白。觀察GFP熒光的最大激發(fā)波長(zhǎng)為488 nm，最大發(fā)射波長(zhǎng)為 507 nm；觀察mCherry熒光的最大激發(fā)波長(zhǎng)為 587 nm，最大發(fā)射波長(zhǎng)為610 nm。

1.7 生理指標(biāo)的測(cè)定

收集高溫脅迫處理后以及未處理的原生質(zhì)體進(jìn)行MDA含量和CAT活性測(cè)定，測(cè)定的方法參照試劑盒說明書進(jìn)行。

2 結(jié)果與分析

2.1 PcWRKY1基因的克隆及生物信息學(xué)分析

以多花黃精的根、莖、葉和塊莖混合組織提取的總RNA逆轉(zhuǎn)錄合成的cDNA為模版，利用轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)提供的參考轉(zhuǎn)錄本設(shè)計(jì)引物，PCR擴(kuò)增獲得PcWRKY1的CDS序列，回收測(cè)序后分析其長(zhǎng)度為 1 560 bp（圖1-A中泳道1、2和3所示），與參考轉(zhuǎn)錄本的序列一致。對(duì)其編碼蛋白序列進(jìn)行生物信息學(xué)分析，結(jié)果顯示其編碼蛋白的相對(duì)分子質(zhì)量為56.93 ku，理論等電點(diǎn)為7.20，屬于中性蛋白；跨膜結(jié)構(gòu)分析結(jié)果表明，該蛋白不具有跨膜結(jié)構(gòu)（圖1-B）；保守結(jié)構(gòu)域分析結(jié)果表明，該蛋白含有2個(gè)WRKY轉(zhuǎn)錄因子家族所特有的保守結(jié)構(gòu)域，且每個(gè)保守結(jié)構(gòu)域中含有1個(gè)七肽保守基序（WRKYGQK）和C2H2（C-X4-C-X23-H-X1-H）型鋅指基序（圖1-C、圖1-D），屬于WRKY轉(zhuǎn)錄因子家族Group Ⅰa類群；信號(hào)肽分析結(jié)果表明，該蛋白不存在信號(hào)肽（圖 1-E）；蛋白親疏水性分析結(jié)果表現(xiàn)，其可能是一種親水性蛋白（圖1-F）；蛋白三級(jí)結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)結(jié)果顯示其含無規(guī)卷曲含量較多（圖1-G），說明預(yù)測(cè)蛋白的結(jié)構(gòu)可靠性較低；通過亞細(xì)胞預(yù)測(cè)網(wǎng)站分析，其亞細(xì)胞位點(diǎn)都是細(xì)胞核，位于其他部位的可能性都很低。

2.2 PcWRKY1進(jìn)化樹分析

對(duì)多花黃精PcWRKY1基因編碼的蛋白序列通過數(shù)據(jù)庫（https：//www.uniprot.org/）進(jìn)行蛋白序列比對(duì)，從結(jié)果中篩出13個(gè)物種中同源蛋白序列，利用軟件MEGA 8.0中的鄰接法（neighbor-joining，NJ）構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹，結(jié)果（圖2）表明，多花黃精中的PcWRKY1與石刁柏（Asparagus officinalis L.）的親緣關(guān)系最為接近，其次是深圳擬蘭（Apostasia shenzhenica）與黃石斛（Dendrobium catenatum L.）；與鳳梨（Ananas comosus）的親緣關(guān)系最遠(yuǎn)。

2.3 PcWRKY1組織表達(dá)模式分析

為了檢驗(yàn)PcWRKY1在多花黃精各個(gè)組織中的表達(dá)情況，利用RT-qPCR方法分析了PcWRKY1在2年生的多花黃精的根、莖、葉、塊莖和種子中的表達(dá)情況，結(jié)果（圖3）顯示，PcWRKY1在多花黃精的根、莖、葉、塊莖和種子均有表達(dá)，其表達(dá)量由高到低的組織部位分別種子、塊莖、根、莖和葉片，其中在根和塊莖中的表達(dá)量無明顯差異。

2.4 PcWRKY1基因表達(dá)受高溫脅迫的抑制

為了進(jìn)一步確定PcWRKY1基因的表達(dá)是否受高溫的影響，對(duì)已有1個(gè)完整頂芽的多花黃精根莖（2年生）為無性繁殖材料培育的幼苗分別進(jìn)行高溫梯度處理和模擬大田高溫處理， 然后選取中上部成

熟葉片提取總RNA，通過RT-qPCR分析PcWRKY1在高溫脅迫下表達(dá)，結(jié)果如圖4-A所示，以正常條件下作為對(duì)照，PcWRKY1在高溫脅迫下的轉(zhuǎn)錄水平降低了10倍，說明高溫脅迫顯著抑制了它的表達(dá)；此外，高溫梯度處理顯示，PcWRKY1的表達(dá)量在2 h受到顯著抑制，并且隨著高溫處理時(shí)間的增加到 10 h 后又恢復(fù)至原始水平（圖4-B）。

2.5 高溫脅迫對(duì)PcWRKY1亞細(xì)胞位點(diǎn)影響分析

為了進(jìn)一步確定PcWRKY1的亞細(xì)胞位點(diǎn)，本研究首先用植物蛋白亞細(xì)胞定位預(yù)測(cè)網(wǎng)站預(yù)測(cè)，結(jié)果顯示PcWRKY1定位于細(xì)胞核中。然后，本試驗(yàn)利用同源重組的方法構(gòu)建了一個(gè)35S：PcWRKY1-GFP（綠色熒光蛋白標(biāo)記的融合載體），用已知定位細(xì)胞核的AtIMP4偶聯(lián)櫻桃紅熒光蛋白的融合載體35S：AtIMP4-mCherry作為對(duì)照，利用PEG介導(dǎo)的玉米原生質(zhì)體瞬時(shí)表達(dá)體系進(jìn)行共表達(dá)。共表達(dá)的原生質(zhì)體在黑暗條件下，25 ℃培養(yǎng)16 h后在激光共聚焦顯微鏡下進(jìn)行熒光觀察。結(jié)果如圖5所示，在正常條件下，PcWRKY1的綠色熒光信號(hào)與AtIMP4的櫻桃紅熒光相重合，這說明PcWRKY1定位于細(xì)胞核中。

此外，為了確定高溫脅迫是否會(huì)影響其亞細(xì)胞定位，對(duì)培養(yǎng)后的原生質(zhì)體進(jìn)行高溫處理，處理的條件為38 ℃、30 min，結(jié)果如圖5顯示，當(dāng)高溫處理后，PcWRKY1的亞細(xì)胞位點(diǎn)與不進(jìn)行高溫處理一樣。這些結(jié)果說明，PcWRKY1的亞細(xì)胞位點(diǎn)跟網(wǎng)絡(luò)

預(yù)測(cè)的結(jié)果一致，定位于細(xì)胞核中，且位點(diǎn)不受高溫影響。

2.6 PcWRKY1提高了玉米原生質(zhì)體在高溫脅迫中的耐性

為了研究PcWRKY1在高溫中的作用，利用PEG介導(dǎo)的玉米原生質(zhì)體中瞬時(shí)遺傳轉(zhuǎn)化技術(shù)，將PcWRKY1過表達(dá)轉(zhuǎn)化入玉米原生質(zhì)體中，黑暗培養(yǎng)16 h后再進(jìn)行高溫38 ℃、30 min的脅迫處理，以不進(jìn)行高溫處理的作為對(duì)照組，然后對(duì)其MDA含量和CAT活性進(jìn)行測(cè)定， 結(jié)果如圖6所示， 在玉米原

生質(zhì)體中瞬時(shí)過表達(dá)PcWRKY1提高了高溫誘導(dǎo)MDA含量的增加，降低了CAT活性的提高。這些結(jié)果可以說明，PcWRKY1過表達(dá)顯著降低了玉米原生質(zhì)體在高溫脅迫下的耐性。

3 討論與結(jié)論

近年來，由于溫室氣體的大量排放，全球日益變暖， 氣候變暖導(dǎo)致的高溫已經(jīng)成為全球主要的自然災(zāi)害之一。高溫脅迫往往通過改變植物生化、生理和代謝過程，最終引起植物的萎蔫、生殖系統(tǒng)發(fā)育異常，顯著影響了植物的產(chǎn)量和品質(zhì)［21-22］。而許多轉(zhuǎn)錄因子有助于植物對(duì)不利環(huán)境條件的耐受性，并被廣泛用作作物育種的潛在候選基因［23］。

WRKY轉(zhuǎn)錄因子作為植物中所特有的一種轉(zhuǎn)錄因子家族，已經(jīng)越來越多被報(bào)道在植物響應(yīng)高溫脅迫中起著重要作用［24-26］，但在多花黃精中的研究卻少之又少。本研究在前期通過對(duì)多花黃精在高溫脅迫下的轉(zhuǎn)錄組學(xué)研究發(fā)現(xiàn)PcWRKY1顯著受高溫脅迫抑制的基礎(chǔ)上，從根、莖、葉和塊莖混合組織中，克隆獲得了轉(zhuǎn)錄因子PcWRKY1的CDS序列，經(jīng)測(cè)序發(fā)現(xiàn)其CDS序列全長(zhǎng)共1 560 bp；根據(jù)測(cè)序得到的CDS所翻譯的氨基酸序列中，分析發(fā)現(xiàn)其具有2個(gè)WRKY保守的結(jié)構(gòu)域，該結(jié)構(gòu)域中含有WRKYGQK的七肽核心基序和C2H2（C-X4-C-X23-H-X1-H）鋅指結(jié)構(gòu)，屬于WRKY轉(zhuǎn)錄因子家族GroupⅠa類群；系統(tǒng)進(jìn)化樹分析結(jié)果顯示PcWRKY1與石刁柏的親緣關(guān)系最為接近，說明它們之間的功能可能存在相似性；對(duì)PcWRKY1在不同組織的表達(dá)模式分析，發(fā)現(xiàn)其在根、莖、葉、塊莖和種子中均有表達(dá)，且在種子中表達(dá)量最高；利用PEG介導(dǎo)的玉米原生質(zhì)體瞬時(shí)轉(zhuǎn)化體系，對(duì)PcWRKY1在正常和高溫脅迫下的亞細(xì)胞位點(diǎn)進(jìn)行了分析，與已知報(bào)道的WRKY亞細(xì)胞位點(diǎn)一樣，都定位于細(xì)胞核，并且其位點(diǎn)還不受高溫脅迫的影響。

研究認(rèn)為，WRKY家族常常通過識(shí)別靶基因啟動(dòng)子中所含的順式作用元件W-box并與其結(jié)合，從而調(diào)控植物中的各種靶基因信號(hào)通路從而應(yīng)對(duì)各種脅迫。如百合中的LIWRKY39作為L(zhǎng)IMBF1c上游調(diào)控因子，結(jié)合LIMBF1c啟動(dòng)子上保守的W-box順式作用元件，激活了LIMBF1c的轉(zhuǎn)錄活性從而正調(diào)控百合的耐熱性［27］。在擬南芥中過表達(dá)小麥TaWRKY1和TaWRKY33，激活了下游脅迫反應(yīng)相關(guān)基因從而調(diào)節(jié)對(duì)高溫的耐受性［28］。此外，WRKY可以調(diào)控下游與熱脅迫相關(guān)基因的表達(dá)，調(diào)控抗氧化防護(hù)酶的活性，從而提高植物的耐熱性。如在辣椒中，CaWRKY40參與了植物對(duì)高溫脅迫的響應(yīng)，通過提高高溫脅迫下相關(guān)熱脅迫應(yīng)答蛋白編碼基因的轉(zhuǎn)錄（如HSP等標(biāo)志基因）來響應(yīng)高溫；同時(shí)在其煙草轉(zhuǎn)基因植株中顯示，過表達(dá)降低了煙草對(duì)高溫處理的敏感性，而缺失突變體正好相反［29-30］。此外，在煙草中過表達(dá)小麥TaWRKY10后，降低了由高溫脅迫誘導(dǎo)升高的MDA含量，提高了受高溫脅迫促進(jìn)的抗氧化防護(hù)酶的活性，從而降低了由高溫脅迫帶來的損傷［31］；并且在玉米中高溫能夠誘導(dǎo)ZmWRKY106基因的表達(dá)，并且在其擬南芥過表達(dá)株系中可以通過誘導(dǎo)抗氧化防護(hù)酶的活性，從而提高轉(zhuǎn)基因株系的耐熱性［32］。水稻中的OsWRKY10能夠與VQ8相互拮抗從而調(diào)控水稻熱脅迫下ROS穩(wěn)態(tài)以及熱休克轉(zhuǎn)錄因子和蛋白基因的表達(dá)，從而適應(yīng)高溫脅迫［33］。然而，植物中也有一些WRKY對(duì)高溫耐受性起負(fù)調(diào)控作用，如在擬南芥中的過表達(dá)向日葵HaWRKY6會(huì)顯著降低其對(duì)高溫的耐受性［34］。在本研究中，利用RT-qPCR分析PcWRKY1的轉(zhuǎn)錄水平顯著受到高溫的抑制，并且對(duì)其進(jìn)行高溫處理2 h時(shí)，表達(dá)量最低，說明其對(duì)高溫脅迫較敏感；同時(shí)利用玉米原生質(zhì)體瞬時(shí)轉(zhuǎn)化體系，瞬時(shí)過表達(dá)PcWRKY1后，對(duì)其在高溫脅迫下的生理指標(biāo)進(jìn)行了測(cè)定，發(fā)現(xiàn)瞬時(shí)過表達(dá)PcWRKY1進(jìn)一步升高了由高溫造成的MDA含量的增加，降低了受高溫脅迫提高的CAT活性的增加，說明PcWRKY1的過表達(dá)加重了高溫脅迫對(duì)玉米原生質(zhì)體造成的氧化損傷，降低了其在高溫脅迫中的耐性。這些結(jié)果表明PcWRKY1在多花黃精適應(yīng)高溫脅迫中起負(fù)調(diào)控作用。為進(jìn)一步分析和確認(rèn)PcWRKY1具體調(diào)控哪些基因的表達(dá)進(jìn)而參與高溫脅迫，可以通過DAP-sequence、ChIP、EMSA等試驗(yàn)篩選和驗(yàn)證。

本研究從多花黃精中克隆得到了一個(gè)顯著受高溫抑制的WRKY轉(zhuǎn)錄因子GroupⅠa類群成員PcWRKY1，其CDS序列長(zhǎng)為1 650 bp，編碼519個(gè)氨基酸。并且利用玉米原生質(zhì)體瞬時(shí)表達(dá)體系，發(fā)現(xiàn)其過表達(dá)降低了玉米原生質(zhì)體在高溫脅迫下的耐性，推測(cè)其在多花黃精高溫脅迫響應(yīng)中起負(fù)調(diào)控作用。這可以為闡述多花黃精在適應(yīng)高溫脅迫中的作用機(jī)制及開展分子育種研究提供理論依據(jù)。

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