鐵皮石斛DobHLH74基因克隆及非生物脅迫下的表達分析

摘要：為了探究鐵皮石斛（Dendrobium officinale）DobHLH74基因的生物學特性和抗逆功能，利用同源克隆技術獲得廣東丹霞鐵皮石斛DobHLH74基因的完整cDNA序列并進行生物信息學和表達特性分析。結果顯示，DobHLH74（GenBank登錄號：PP534457）開放讀碼框全長996 bp，編碼331個氨基酸殘基；其蛋白質理論分子量為36.557 ku，理論等電點為5.53，表明其為親水性不穩(wěn)定蛋白；具有bHLH_SF保守結構域，屬于bHLH超家族，且無信號肽和跨膜區(qū)域，符合轉錄因子結構特征；與金釵石斛（Dendrobium nobile）親緣關系最近，同源性高達97.22%。DobHLH74基因具有組織表達特異性，在葉組織中表達量顯著高于其他組織，可能參與碳源調控過程。DobHLH74的啟動子具有與低溫、干旱、鹽堿響應和ABA應答相關的順式作用元件，且在低溫、干旱和ABA脅迫下表達量顯著上調；與未處理相比，DobHLH74基因在低溫和干旱處理6 h后表達量分別提高93.78倍和5.91倍，在ABA處理9 h后表達量是未處理的20.90倍，推測該基因在轉錄水平上可能通過ABA信號途徑參與低溫和干旱脅迫響應，研究結果為進一步挖掘DobHLH74基因功能及其在非生物脅迫響應中的作用機制提供研究基礎。

關鍵詞：鐵皮石斛；bHLH轉錄因子；DobHLH74基因；同源克??；表達分析；非生物脅迫

中圖分類號：S188；S567.23+9.01" 文獻標志碼：A

文章編號：1002-1302（2025）04-0262-08

收稿日期：2024-04-06

基金項目：廣東省基礎與應用基礎研究基金（編號：2024A1515013167）；廣東省普通高校重點領域專項（編號：2022ZDZX4044、2024ZDZX2023）；黑龍江省自然科學基金（編號：LH2021E091）；哈爾濱商業(yè)大學教師“創(chuàng)新”項目支持計劃（編號：XL0063）。

作者簡介：葛秀麗（1996—），女，安徽阜陽人，碩士研究生，研究方向為鐵皮石斛分子分析與基因改良。E-mail：984239190@qq.com。

通信作者：崔 迪，博士，副研究員，研究方向為中藥資源學，E-mail：jscz_dd@hotmail.com；劉羽佳，博士，副教授，研究方向為藥用植物逆境生理與分子生物學，E-mail：liuyj1206@sgu.edu.cn。

鐵皮石斛（Dendrobium officinale）是蘭科石斛屬多年生草本植物，因其悠久的藥用歷史和豐富的藥理活性成分而備受推崇，被譽為“藥界大熊貓”［1］。研究發(fā)現(xiàn)，鐵皮石斛富含苯丙氨酸，以及黃酮、聯(lián)芐與核苷類化合物等多種活性物質，具有顯著的抗氧化、抗腫瘤、降血糖等多種藥理活性，在多種疾病的預防和治療中展現(xiàn)出良好的療效［2-5］。然而，野生鐵皮石斛資源的快速減少，導致其瀕臨滅絕，雖然人工栽培能部分緩解資源匱乏的問題，但由于引種不當、栽培品種混雜、成品質量參差不齊等原因，鐵皮石斛的藥用品質難以得到有效保障［6-8］。

bHLH（basic helix-loop-helix）轉錄因子家族作為重要的轉錄調控因子，在植物的生長發(fā)育和逆境脅迫中扮演著關鍵角色［9-10］。bHLH轉錄因子具有高度保守的結構域，由約60個氨基酸構成，分為堿性和螺旋-環(huán)-螺旋2個功能區(qū)域，其中堿性區(qū)域負責DNA元件結合，而螺旋-環(huán)-螺旋區(qū)域則促進同源和異源二聚體復合物的形成［11-12］。近年來，隨著研究的不斷深入，bHLH轉錄因子在植物生長發(fā)育、信號轉導和逆境脅迫等方面的功能逐漸得以揭示［13-17］。例如，陸地棉（Gossypium hirsutum）bHLH基因（GhPAS1）能夠介導油菜素甾醇信號通路，調控陸地棉植株的生長發(fā)育［18］；在擬南芥（Arabidopsis thaliana）中異源過表達鱗葉卷柏（Selaginella lepidophylla）SlbHLHopt基因能夠顯著提高轉基因植株在缺水和鹽脅迫下的生存能力［19］；玉米（Zea Mays）的bHLH基因（ZmPTF1）在干旱脅迫下通過依賴于ABA（脫落酸）信號途徑促進了根系的發(fā)育，提高了植株的抗旱性［20］。水稻（Oryza sativa）OsbHLH148基因能夠調控茉莉酸信號傳導途徑中相關基因的表達，作為干旱脅迫響應的初始反應因子參與干旱和創(chuàng)傷應答過程［21］。同時，將葡萄（Vitis vinifera）VvbHLH1基因在擬南芥中異源過表達，能夠增強轉基因植株的耐寒能力［22］。在擬南芥中異源過表達歐洲甜櫻桃（Prunus avium）PavbHLH28基因能夠提高脯氨酸含量，降低丙二醛含量，進而增強轉基因擬南芥的抗寒性［23］。此外，bHLH轉錄因子還參與植物對病蟲害的防御機制，通過調控揮發(fā)性物質的合成增強植物對害蟲的抗性。如水稻OsbHLH6基因可以通過動態(tài)調節(jié)水楊酸和茉莉酸信號轉導途徑來調控植物體在感染水稻稻瘟病病菌時的防御響應機制［24］。在百脈根（Lotus corniculatus）中同源過表達LjbHLH7基因可以增強轉基因植株的抗蟲性［25］。然而，鐵皮石斛作為一種重要的藥用植物，其bHLH轉錄因子在逆境脅迫下的分子遺傳機制尚未得到充分研究。因此，本研究利用同源克隆技術從廣東丹霞鐵皮石斛中克隆了DobHLH74基因全長序列，分析了其理化性質、蛋白結構以及系統(tǒng)發(fā)育進化關系。本研究初步分析了DobHLH74基因的組織表達特性及在脅迫下的表達模式，以期為后續(xù)挖掘其生物學功能提供理論基礎，并為培育高產(chǎn)、優(yōu)質、抗逆的藥用鐵皮石斛提供基因資源，同時也為遺傳育種提供重要支撐。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

試驗用的廣東“丹霞”鐵皮石斛，由韶關市石斛工程技術中心提供。pUCm-T載體試劑盒購自生工生物工程（上海）股份有限公司；2×Taq PCR Mix plus、FastPure Gel DNA Extraction Mini Kit、2×Realab Green PCR Fast Mixture、All-in-One First-Strand Synthesis MasterMix均購自北京蘭博利德生物技術有限公司；由生工生物工程（上海）股份有限公司負責引物的合成及DNA測序工作。

1.2 試驗時間與方法

試驗于2022年9月至2023年12月在廣東省韶關市韶關學院生物與農(nóng)業(yè)學院分子生物學與基因工程研究室進行。

1.2.1 樣品處理 鐵皮石斛成熟蒴果經(jīng)次氯酸鈉表面消毒后播種于添加了馬鈴薯粉的培養(yǎng)基上，光照周期 16 h/d，（25±1） ℃ 恒溫培養(yǎng)約6 個月。選取長勢一致、生長狀況良好的組培幼苗（株高5～6 cm）作為試驗樣品。低溫處理：將組培幼苗置于 4 ℃ 恒溫恒濕培養(yǎng)箱中，正常生長的植株作為對照。干旱及ABA處理：分別用20% PEG（聚乙二醇）-6000溶液和 100 μmol/L ABA溶液澆灌幼苗，對照植株均用清水澆灌。不同處理組分別在處理后0、3、6、9、12、24 h采集葉片，液氮速凍后保存于超低溫冰箱。每個時間點的樣品均取3 次生物學重復。

1.2.2 基因克隆 采用Trizol法提取鐵皮石斛葉片總RNA，參照All-in-One First-Strand Synthesis MasterMix 試劑盒說明書合成單鏈cDNA。根據(jù)NCBI數(shù)據(jù)庫中已知的鐵皮石斛DobHLH74 基因（基因ID：LOC110114258）為參考序列，使用Primer Premier 5.0 設計基因全長引物：DobHLH74-F：5′-ATGGCAACTCCATGTTCATC-3′，DobHLH74-R：5′-CTAAATAGATAATTGATTC-3′。PCR 體系：2×Taq PCR Mix 10 μL，上、下游引物各1.0 μL，cDNA 模板 2.0 μL，ddH2O 補足至20.0 μL。反應程序如下：94 ℃預變性3 min；接著進行30 個循環(huán)，每個循環(huán)包括：94 ℃變性30 s，58 ℃退火30 s，72 ℃延伸40 s；最后在72 ℃下延伸7 min。擴增產(chǎn)物經(jīng)電泳檢測后回收目的片段，與pUCm-T 載體連接后轉化至大腸桿菌（Escherichia coli） DH5α 感受態(tài)細胞，篩選陽性克隆進行測序驗證。

1.2.3 生物信息學分析 以克隆的鐵皮石斛DobHLH74蛋白序列為基準，利用NCBI-BLASTP工具篩選同源蛋白，運用DNAMAN軟件進行多序列比對，并通過MEGA 11軟件的鄰接法構建系統(tǒng)發(fā)育進化樹。為深入了解DobHLH74蛋白特性，采用 NCBI-CDD工具預測其蛋白結構域，利用Expasy ProtParam在線服務分析其理化性質；分別采用SPLIT 4.0 SERVER和SWISS-MODEL預測分析DobHLH74蛋白的高級結構和親疏水性。另外，使用在線程序TMHMM和SignaIP 4.1分別預測分析DobHLH74蛋白的跨膜區(qū)和信號肽；利用NetPhos 3.1在線軟件對其蛋白磷酸化位點進行了預測。采用New PLACE在線網(wǎng)站預測分析DobHLH74啟動子序列的DNA元件。所用工具的網(wǎng)址參考理雅等的研究［26］。

1.2.4 不同處理表達模式的轉錄組分析 采用Trizol 法分別提取“1.2.1”節(jié)中不同處理樣品RNA，構建cDNA文庫，高通量測序委托深圳華大基因科技有限公司完成，使用Illumina HiSeqTM 2500/MiSeqTM 平臺進行測序。數(shù)據(jù)處理及分析方法參考理雅等的研究［26］。基因表達量以FPKM進行量化，分析鐵皮石斛DobHLH74 基因在低溫、干旱和ABA 脅迫下的表達特性。

1.2.5 RT-qPCR表達分析 以鐵皮石斛根、莖、葉、花和“1.2.1”節(jié)中不同處理樣品cDNA 為模板，使用Primer Premier 5.0 軟件對克隆的DobHLH74 基因序列設計特異性引物（F：5′-AGCAACAAGTAGAGTTC-3′；R：5′-TGAGCATATGGAGTGCT-3′）；內參基因引物（DoActin7-F：5′-CCCTACCTCCTACCTCTGCG；DoActin7-R：5′-GCAAACCCAGCCTTCACCAT-3′）。DobHLH74 基因的組織特異性表達分析和在不同脅迫下的表達分析用2-ΔΔC T 法進行量化。每個樣品進行3 次重復。

1.3 統(tǒng)計分析

采用WPS 2019 軟件對數(shù)據(jù)進行處理，使用GraphPad Prism 8 和SPSS 27.0 軟件進行作圖和差異顯著性分析（α=0.05）。

2 結果與分析

2.1 鐵皮石斛DobHLH74 基因克隆與序列分析

以鐵皮石斛葉片cDNA作為模板進行PCR擴增，獲得1條清晰且無雜帶的DobHLH74 基因片段（圖1-A），測序比對結果顯示，該基因序列長度為996 bp，編碼331 個氨基酸。基因結構和染色體定位分析結果顯示，DobHLH74 基因位于第7 號染色體，由8 個外顯子和7 個內含子構成（圖1-B）。與參考序列（序列號：LOC110107930）存在8 個堿基差異，其中同義替換和非同義替換各4 個（圖2）。

2.2 鐵皮石斛DobHLH74蛋白理化性質分析

DobHLH74蛋白包含1個高度保守的bHLH_SF結構域（圖3-A），這一特征清晰地表明該基因歸屬于bHLH 超家族。蛋白性質預測分析結果顯示，DobHLH74蛋白的分子式為C1 581H2 556N442O514S18，理論分子量為36.557 ku，理論等電點為5.53。其不穩(wěn)定指數(shù)為50.00，表明該蛋白具有親水性且不穩(wěn)定（圖3-B）。蛋白結構預測結果顯示，DobHLH74二級結構由13.60%的α-螺旋、4.83%的β-折疊以及81.57%的無規(guī)則卷曲構成（圖3-C）；其三級結構與建蘭（Cymbidium ensifolium）bHLH74 蛋白相似度高達81.79%（圖4-C）。另外，DobHLH74 不含信號肽（圖4-A），無跨膜區(qū)域（圖4-B），不具備分泌性。蛋白磷酸化位點預測結果顯示，DobHLH74 共有59 個磷酸化位點，其中包括39 個絲氨酸位點、15 個蘇氨酸位點以及5 個酪氨酸位點（圖4-D）。

2.3 DobHLH74 蛋白同源性及系統(tǒng)發(fā)育關系分析

利用NCBI數(shù)據(jù)庫的BLASTP工具對鐵皮石斛DobHLH74氨基酸序列進行同源序列比對，挑選6 個與DobHLH74蛋白高度同源的植物bHLH蛋白序列進行多重序列比對分析。結果顯示，金釵石斛（KAI0525262.1）與DobHLH74同源性最高，相似度為97.22%，其次是鼓槌石斛（KAH0468352.1）、建蘭（QDL88375.1）和蝴蝶蘭（XP_020573315.1），相似度分別為88.92%、81.54%、76.92%。多序列對比結果發(fā)現(xiàn)，DobHLH74蛋白序列與多種植物的bHLH 蛋白序列在155～237 aa位置均含有螺旋-環(huán)-螺旋結構域（圖5）。系統(tǒng)發(fā)育分析結果顯示，鐵皮石斛DobHLH7 蛋白與金釵石斛bHLH蛋白的親緣關系最近，聚類在同一分支（圖6）。

2.4 DobHLH74 基因組織表達分析

利用qRT-PCR對鐵皮石斛DobHLH74基因的組織表達情況進行分析。結果顯示，DobHLH74在不同組織中表達水平存在顯著差異，在葉相對表達量顯著高于其他組織，是莖表達量的28.60倍；在花和根中表達量相對較低（圖7）。表明DobHLH74基因在鐵皮石斛葉組織的形態(tài)建成和生長發(fā)育中發(fā)揮重要作用，可能參與光合作用的調控過程。

2.5 DobHLH74 在非生物脅迫下的表達分析

順式作用元件分析結果顯示，DobHLH74基因

起始密碼子上游2.0 kb啟動子序列具有多種DNA順式作用元件，主要涉及干旱及低溫響應、鹽堿脅迫響應和ABA響應過程（表1）。因此，進一步分析了DobHLH74基因在低溫、干旱以及ABA脅迫下的表達特性。轉錄組分析結果顯示，低溫、干旱和ABA處理均能夠誘導DobHLH74基因表達，且該基因的相對表達量在脅迫處理6～9 h后達到最高（圖8）。qRT-PCR分析進一步驗證了這一結果，與未處理時相比，DobHLH74基因在低溫和干旱處理6 h后表達量到達峰值，分別顯著提高了93.78倍和5.91倍（圖9-A和圖9-C）；在ABA處理9 h后，DobHLH74基因表達量達到最高，是未處理的20.90倍（圖9-B）。這些結果表明，DobHLH74基因在應對非生物脅迫過程中具有重要功能，并可能參與調控植物對逆境的適應機制。

3 討論

植物bHLH轉錄因子是一類重要的調控蛋白，通過bHLH結構域與DNA上的元件識別互作，調控下游基因的轉錄，參與調節(jié)植物體內的基因表達，在植物生長發(fā)育、逆境應答和次生代謝等方面發(fā)揮關鍵作用［17，19，22，27］。截至2024年，鐵皮石斛基因組中共鑒定到108個bHLH基因家族成員［28］。本研究克隆的DobHLH74基因全長序列為996 bp，編碼331個氨基酸殘基，含有1個bHLH_SF保守結構域，無堿性區(qū)域，屬于非典型的bHLH蛋白。DobHLH74編碼的蛋白無信號肽和跨膜結構，為非分泌性蛋白，符合轉錄因子核內定位特性。另外，DobHLH74含有59個磷酸化位點，其中39個為絲氨酸磷酸化，表明其可能為該蛋白的主要磷酸化形式。另外，DobHLH74蛋白與金釵石斛、鼓槌石斛的bHLH蛋白同源性極高，表明該基因在蘭科石斛屬植物中高度保守，可能對石斛屬植物的生存和適應性至關重要，在石斛屬植物的演化過程中扮演著重要的功能角色。

以往研究表明，在植物中bHLH基因表達具有時空特異性［29-30］。例如，在苦蕎麥（Fagopyrum tataricum）中，F(xiàn)tbHLH2和FtbHLH155基因在花器官表現(xiàn)出高水平表達，而FtbHLH67和FtbHLH70基因則在果實組織中顯著表達［31］；水稻OsbHLH109基因在根、莖、葉和幼穗等組織中均有表達，但在葉片中的表達量最高［32］；在蒺藜苜蓿（Medicago truncatula）中，MtbHLH148基因在莖組織中表現(xiàn)出高水平表達，而在葉中表達量最低［33］。本研究的結果與前述研究結果相契合，DobHLH74基因在鐵皮石斛不同組織和器官中的表達水平存在顯著差異，在葉片中的表達水平顯著高于其他組織器官，暗示該基因在光合作用中發(fā)揮功能，可能參與光合作用的碳源調控過程。此外，bHLH表達調控及其參與的信號通路在對抗低溫、干旱、高鹽等脅迫時發(fā)揮重要作用［34］。例如，在擬南芥中過表達蘋果（Malus pumila）bHLH基因（MdCIB1）能夠提高脯氨酸含量，降低過氧化物積累，增強抗氧化酶活性，進而增強轉基因植株的耐旱能力［35］。將小麥（Triticum aestivum）TabHLH39基因在擬南芥異源表達，顯著提高了非生物脅迫下轉基因植株的成活率，同時該基因增加了可溶性糖和脯氨酸含量，降低了電解質滲漏率，提高了轉基因植株的抗旱、抗鹽和抗寒性［36］?；ㄉˋrachis hypogaea）AhbHLH112基因通過調節(jié)POD（過氧化物酶）介導的H2O2穩(wěn)態(tài)，提高了活性氧清除能力，通過ABA依賴性脅迫響應途徑在干旱脅迫耐受性中起積極作用［37］。本研究發(fā)現(xiàn)，DobHLH74啟動子序列具有低溫、干旱、鹽堿等多種環(huán)境脅迫的應答元件，并在低溫、干旱和ABA脅迫時，該基因的表達量均存在顯著上調，且表達模式呈現(xiàn)出高度的一致性，提示該基因可能在轉錄水平上通過ABA信號途徑參與對低溫和干旱脅迫的應答過程，但具體調控機制目前缺乏詳盡的解析，須要通過基因過表達或敲除等分子生物學方法和基因工程技術進一步深入研究。這也是筆者所在課題組今后的重點研究方向。

4 結論

本研究成功克隆了DobHLH74基因，表達特異性分析提示該基因可能參與鐵皮石斛光合作用的碳源調控過程。同時，DobHLH74基因可能通過依賴ABA信號途徑在轉錄水平上參與低溫和干旱脅迫的響應。因此，該基因可作為候選基因，進一步研究鐵皮石斛響應非生物脅迫的作用機制，為鐵皮石斛抗逆性育種提供理論依據(jù)。

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