煙草轉(zhuǎn)錄因子NtWRKY65在響應(yīng)干旱脅迫中的功能研究

摘要：為研究轉(zhuǎn)錄因子NtWRKY65在煙草抵御干旱脅迫中的功能，探究NtWRKY65調(diào)控?zé)煵莞珊得{迫的生理分子機(jī)制，以NtWRKY65過表達(dá)轉(zhuǎn)基因株系（OE）和煙草栽培品種K326（WT）為試材，分析正常和干旱脅迫條件下OE株系和WT株系表型特征、相對(duì)電導(dǎo)率、根系活力、葉綠素含量、膜脂過氧化指標(biāo)、激素含量、抗氧化防御系統(tǒng)酶活性以及關(guān)鍵基因的表達(dá)水平。結(jié)果表明，干旱脅迫處理后，OE株系的生長(zhǎng)狀態(tài)較WT株系良好，生物量約是WT株系的1.5倍，OE-6株系的根系活力較WT株系增加21.53%，WT株系的葉綠素含量較OE-8、OE-11株系顯著降低31.06%、33.58%（Plt;0.05），OE株系的抗旱能力較WT株系明顯提高；與WT株系相比，OE株系的丙二醛含量、過氧化氫含量和超氧陰離子自由基含量顯著降低，并且OE株系的抗氧化酶活性顯著高于WT株系；脫落酸含量較WT株系顯著增加，ABA響應(yīng)基因、應(yīng)激相關(guān)基因以及干旱相關(guān)基因的表達(dá)水平均顯著高于WT株系。干旱脅迫下，過表達(dá)NtWRKY65可顯著提高OE株系的生物量和葉片含水率，增強(qiáng)植株葉片內(nèi)活性氧（ROS）清除能力，提高煙草整體抗氧化防御能力，增強(qiáng)耐旱相關(guān)基因表達(dá)，促進(jìn)ABA的合成，從而提高煙草的耐旱性，故轉(zhuǎn)錄因子NtWRKY65正調(diào)控?zé)煵菽秃敌浴?/p>

關(guān)鍵詞：煙草；NtWRKY65；過表達(dá)；干旱脅迫；功能驗(yàn)證

中圖分類號(hào)：S188；S572.01" 文獻(xiàn)標(biāo)志碼：A

文章編號(hào)：1002-1302（2025）04-0225-08

收稿日期：2024-08-03

基金項(xiàng)目：河南省煙草公司三門峽市公司科技項(xiàng)目（編號(hào)：2024411200200016X、2023411200200008X）；河南省科技攻關(guān)項(xiàng)目（編號(hào)：242102110288）。

作者簡(jiǎn)介：張亞萱（1999—），女，河北保定人，碩士研究生，主要研究方向煙草遺傳育種。E-mail：zhang1085204993@163.com。

通信作者：張小全，博士，教授，主要研究方向煙草遺傳育種。E-mail：zxq013415@163.com。

煙草是一種重要的經(jīng)濟(jì)作物，長(zhǎng)期處于干旱脅迫條件下會(huì)嚴(yán)重影響煙葉的產(chǎn)量和品質(zhì)［1-3］。為了應(yīng)對(duì)干旱脅迫，植物已在細(xì)胞層面、形態(tài)結(jié)構(gòu)、生理過程、生化途徑和分子機(jī)制上進(jìn)化出一系列復(fù)雜的適應(yīng)性防御機(jī)制。其中，轉(zhuǎn)錄因子發(fā)揮著重要作用。在感知到干旱脅迫后，植物體內(nèi)與干旱脅迫相關(guān)的轉(zhuǎn)錄因子被激活，通過與下游靶基因啟動(dòng)子區(qū)域的順式作用元件結(jié)合，調(diào)節(jié)相關(guān)基因表達(dá)并進(jìn)行信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)抵御，從而來(lái)提高植物對(duì)脅迫的抗性［4］。WRKY、bZIP、NAC、MYB、AP2/ERF等轉(zhuǎn)錄因子家族在植物抗逆方面被廣泛研究。胡雅丹等綜述了MYB轉(zhuǎn)錄因子家族響應(yīng)鹽脅迫、干旱脅迫、極端溫度脅迫以及重金屬脅迫等的作用機(jī)制［5］；Li等的研究表明，NtNAC053參與煙草對(duì)鹽和干旱脅迫的響應(yīng)［6］；Zhang等研究發(fā)現(xiàn)，CaNAC035能夠提高辣椒的耐旱性［7］。因此，挖掘煙草抗旱相關(guān)轉(zhuǎn)錄因子，對(duì)改善煙草的耐旱性具有重要意義。

WRKY轉(zhuǎn)錄因子家族是在植物界中普遍存在的一類轉(zhuǎn)錄調(diào)控蛋白，在介導(dǎo)植物的生長(zhǎng)發(fā)育過程和響應(yīng)生物與非生物脅迫防御反應(yīng)中具有重要作用［8-9］。研究表明，WRKY廣泛參與調(diào)節(jié)植物干旱等逆境脅迫［10-12］，如蘋果中WRKY17、WRKY50和WRKY115能夠提高蘋果對(duì)干旱和鹽脅迫的耐受性［13-14］；SbWRKY30異源表達(dá)能夠增強(qiáng)擬南芥和水稻的抗旱性［15］；ZmWRKY40能夠正調(diào)控玉米抗旱性［16］。筆者所在實(shí)驗(yàn)室前期研究發(fā)現(xiàn)，WRKY家族中有164個(gè)候選基因在煙草中均有表達(dá)，特別是WRKY65轉(zhuǎn)錄因子能夠在干旱、鹽和極端溫度脅迫中高表達(dá)，表明其可能參與煙草干旱脅迫響應(yīng)［17］。通過研究發(fā)現(xiàn)，WRKY65轉(zhuǎn)錄因子屬于Ⅱ類WRKY家族成員，其典型特征是含有一個(gè)WRKY結(jié)構(gòu)域和C2H2鋅指結(jié)構(gòu)；亞細(xì)胞定位結(jié)果顯示，NtWRKY65-GFP融合蛋白僅定位于細(xì)胞核中；啟動(dòng)子分析結(jié)果顯示，其包含脫落酸（ABRE）、低溫（LTR）、應(yīng)激（TC-rich）等多種響應(yīng)元件，表明NtWRKY65可能參與脅迫信號(hào)響應(yīng)途徑；在干旱脅迫條件下，NtWRKY65基因表達(dá)量顯著升高［17］。通過構(gòu)建pCAMBIA1305.1-WRKY65轉(zhuǎn)基因載體，并通過農(nóng)桿菌介導(dǎo)的葉盤法轉(zhuǎn)化普通栽培煙草K326，獲得過表達(dá)NtWRKY65轉(zhuǎn)基因株系，經(jīng)過篩選鑒定，獲得純合的穩(wěn)定遺傳的T3代株系。WRKY轉(zhuǎn)錄因子廣泛響應(yīng)干旱脅迫，但NtWRKY65對(duì)煙草耐旱性的機(jī)制尚不清晰。

本研究以煙草栽培品種K326（WT）和過表達(dá)NtWRKY65轉(zhuǎn)基因煙草（OE）為試驗(yàn)材料，通過對(duì)各材料進(jìn)行自然干旱脅迫處理和正常澆水對(duì)照處理，觀察表型特征變化并測(cè)定相關(guān)生理生化指標(biāo)，以期探究煙草轉(zhuǎn)錄因子NtWRKY65在抵御干旱脅迫中的功能，為培育耐旱的煙草新品種奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料、時(shí)間及地點(diǎn)

本試驗(yàn)所用的材料為普通栽培煙草品種K326（WT）和NtWRKY65過表達(dá)株系（OE-3、OE-6、OE-8、OE-11），由筆者所在實(shí)驗(yàn)室保存。其中，OE株系是通過農(nóng)桿菌介導(dǎo)的葉盤轉(zhuǎn)化法將構(gòu)建的pCAMBIA1305.1-WRKY65轉(zhuǎn)基因載體轉(zhuǎn)入普通栽培煙草K326中后，經(jīng)鑒定、篩選到獲得的純合穩(wěn)定遺傳的T3代株系。本試驗(yàn)于2023年3月初至2024年3月初在河南農(nóng)業(yè)大學(xué)龍子湖校區(qū)煙草學(xué)院煙草遺傳育種實(shí)驗(yàn)室進(jìn)行。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 植物培養(yǎng)方法

將各材料的種子用牙簽直接點(diǎn)播在盛有營(yíng)養(yǎng)土（基質(zhì) ∶蛭石體積比= 2 ∶1）的 10 cm×10 cm營(yíng)養(yǎng)缽中，放入人工氣候培養(yǎng)箱內(nèi)進(jìn)行培養(yǎng)，并設(shè)置環(huán)境參數(shù)為光照持續(xù)16 h，溫度設(shè)置為28 ℃，黑暗持續(xù)8 h，溫度設(shè)置為26 ℃，相對(duì)含水量為（56±2）%。生長(zhǎng)10 d后，選取生長(zhǎng)狀態(tài)良好、大小一致的小苗轉(zhuǎn)移到盛有營(yíng)養(yǎng)土（基質(zhì) ∶蛭石=2 ∶1）的7 cm×7 cm營(yíng)養(yǎng)缽中，每缽定植1株。

1.2.2 干旱脅迫處理和取樣

煙苗生長(zhǎng)45 d后，選取生長(zhǎng)狀態(tài)良好、大小一致的煙苗，采用自然干旱的方法進(jìn)行干旱脅迫處理，同時(shí)設(shè)置正常供水為對(duì)照處理。處理前將盛有不同材料的營(yíng)養(yǎng)缽浸入 3 cm 水層中靜置8 h，在充分吸收水分后使其處于飽和狀態(tài)，此后干旱脅迫處理組不再澆水，對(duì)照處理組每天測(cè)定土壤水分并確保土壤含水率保持在75%～85%。

自然干旱處理10 d出現(xiàn)葉片變黃、萎蔫癥狀時(shí)，對(duì)照處理和干旱處理的不同材料各取3株，用于生物量、含水率的測(cè)定；選取不同處理材料各3株自上至下第3張葉片用于相對(duì)電導(dǎo)率測(cè)定和相關(guān)基因表達(dá)分析；選取不同處理材料自上至下第4張葉各3張用于抗逆酶和激素含量測(cè)定。

1.3 指標(biāo)測(cè)定方法

1.3.1 表型指標(biāo)

將WT株系和4個(gè)OE株系按順序依次擺放整齊，并置于黑布上拍照。對(duì)照處理和干旱處理的不同材料各取3株，經(jīng)過去離子水徹底清洗干凈植株根系及葉片后，用吸水紙輕柔地吸干表面殘留的水分并稱重，用于生物量的測(cè)定。

1.3.2 生理指標(biāo)

每個(gè)材料各選取3株，使用去離子水沖洗煙株地上部和地下部，吸干水分稱重，記為FW，在105 ℃烘箱中殺青并在65 ℃下烘至恒重，稱量干物質(zhì)量值，記為DW，用于含水率的測(cè)定，每次測(cè)量重復(fù)3次。計(jì)算公式：含水率=（FW-DW）/FW×100%。分別選取不同處理材料各6株同一部位、同一朝向的煙葉，使用SPAD儀測(cè)定葉片葉綠素含量，每張葉片重復(fù)測(cè)定3次。使用直徑為0.5 cm的打孔器分別均勻打取8個(gè)孔，將其放在已加入5 mL蒸餾水的15 mL離心管中孵育，參照Xu等的方法［18］測(cè)定相對(duì)電導(dǎo)率。

抗逆酶參考李合生的方法［19］測(cè)定，丙二醛（MDA）含量通過硫代巴比妥酸法測(cè)定，過氧化氫（H2O2）含量通過碘化鉀還原法測(cè)定，超氧陰離子自由基（O-2·）含量采用羥胺氧化法測(cè)定，超氧化物歧化酶（SOD）活性采用核黃素-NBT法測(cè)定，過氧化物酶（POD）活性采用愈創(chuàng)木酚法測(cè)定，過氧化氫酶（CAT）活性采用紫外吸收法測(cè)定。使用植物ABA ELISA試劑盒（北京索萊寶科技有限公司）通過酶聯(lián)免疫法［20］測(cè)定脫落酸（ABA）含量。

1.3.3 相關(guān)基因表達(dá)量

取樣葉片經(jīng)液氮凍干磨粉后，通過Trizol法［21］進(jìn)行RNA的提取。確認(rèn)樣品合格后，依照5×All-In-One RT MasterMix試劑盒（ABM公司）提供的說明進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄反應(yīng)，得到cDNA。

實(shí)時(shí)熒光定量PCR（qRT-PCR）使用SYBR Green PCR Master Mix進(jìn)行，以NtL25為內(nèi)參基因，相對(duì)基因表達(dá)量采用2-△△CT方法計(jì)算。

1.4 數(shù)據(jù)分析

采用Microsoft Excel 2019進(jìn)行試驗(yàn)數(shù)據(jù)整理和

作圖，并通過SPSS 26.0軟件對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行單因素方差分析。采用鄧肯檢驗(yàn)判斷差異顯著性（α=0.05）。數(shù)據(jù)以3次獨(dú)立試驗(yàn)的平均值±標(biāo)準(zhǔn)差（x±s）表示。

2 結(jié)果與分析

2.1 干旱脅迫對(duì)過表達(dá)NtWRKY65株系表型的影響

由圖1-A可知，處理10 d后，正常澆水的各株系在外觀特征上沒有明顯差異；干旱脅迫處理下，WT和OE株系均表現(xiàn)萎蔫，但WT株系萎蔫得更明顯，說明OE株系比WT株系抗旱能力強(qiáng)。由圖1-B可知，正常澆水處理的各株系整株生物量差異不顯著（Pgt;0.05）；干旱脅迫處理后，OE株系的整株生物量顯著高于WT株系，約是WT株系的1.5倍。

由圖1-C可知，正常澆水條件下，WT株系和OE株系含水率沒有顯著差異；干旱脅迫處理后，WT株系和OE株系含水率均有所下降，且WT株系的葉片含水率顯著低于OE株系，說明干旱脅迫后轉(zhuǎn)基因株系在一定程度上能夠相對(duì)增加葉片含水率。不同處理株系的相對(duì)電導(dǎo)率結(jié)果如圖1-D所示，可以看出，正常澆水的OE株系相對(duì)電導(dǎo)率顯著低于WT株系；干旱脅迫處理組OE株系相對(duì)電導(dǎo)率平均比WT株系低41.88%，其中OE-6株系的相對(duì)電導(dǎo)率較其他OE株系更高。

對(duì)各處理根系活力的檢測(cè)結(jié)果如圖1 -E所示，可以看出，正常澆水條件下，WT株系和OE-3、OE-6株系沒有顯著差異，OE-8和OE-11株系較WT株系顯著增加；干旱脅迫處理下，各株系的根系活力均有不同程度的升高，其中OE株系相較于WT株系表現(xiàn)出更為顯著的根系活力提升，OE-3根系活力增幅為13.24%，OE-6株系增幅為21.53%。

由圖1-F可以看出，各處理葉片葉綠素含量有較大差異。正常澆水條件下，除OE-11株系的葉綠素含量較低外，其他株系葉綠素含量沒有顯著差異；干旱處理?xiàng)l件下，WT株系的葉綠素含量較OE-8和OE-11株系分別顯著降低31.06%和33.58%，OE-3和OE-6株系的葉綠素含量與WT株系沒有顯著差異，但較WT株系的葉綠素含量有小幅增加。說明干旱脅迫下過表達(dá)NtWRKY65能夠提高轉(zhuǎn)基因煙草葉片中葉綠素含量。

2.2 干旱脅迫對(duì)NtWRKY65過表達(dá)株系葉片抗氧化性能的影響

2.2.1 對(duì)葉片中MDA含量的影響

植物膜脂過氧化過程中伴隨著MDA的積累，故MDA含量可以作為反映植物葉片細(xì)胞膜受損程度的一個(gè)重要指標(biāo)［22］。由圖2-A可知，正常澆水條件下，WT株系的MDA含量顯著高于OE株系；干旱脅迫處理后，WT株系煙草葉片中MDA含量增加了105.93%，而OE株系平均升高了40.89%，且WT株系MDA含量顯著高于OE株系。表明過表達(dá)NtWRKY65能夠顯著減少干旱脅迫下轉(zhuǎn)基因煙草葉片中的MDA含量。

2.2.2 對(duì)葉片中H2O2和O-2·含量的影響

由圖 2-B可知，正常澆水條件下，WT株系H2O2含量顯著高于OE株系；干旱處理后，WT株系葉片中H2O2含量升高了80.59%，而OE株系平均升高了46.30%，WT株系增幅明顯高于OE株系。由圖 2-C 可知，正常澆水條件下，WT株系的O-2·含量與OE-3、OE-6株系沒有顯著差異，但顯著高于 OE-8 和OE-11株系；干旱處理后，WT株系葉片中O-2·含量大幅增加，達(dá)到對(duì)照處理的3.96倍，OE-3 葉片中O-2·含量較對(duì)照處理升高了 75.57%。表明過表達(dá)NtWRKY65能夠顯著降低干旱脅迫下轉(zhuǎn)基因煙草葉片中H2O2和O-2·的含量。

2.2.3 對(duì)葉片中抗氧化酶活性的影響

由圖2-D可知，正常澆水處理?xiàng)l件下，OE株系的SOD活性顯著高于WT株系；干旱脅迫處理下，各株系的SOD活性均表現(xiàn)出不同程度的升高，其中OE-3和 OE-8 株系的增幅大于WT株系。由圖2-E可知，正常澆水條件下，OE-11株系的POD活性顯著高于其他株系，且其他各株系POD活性間均沒有顯著差異；干旱脅迫處理后，各株系的POD活性大幅升高，且OE株系的平均POD活性是WT株系的1.31倍。由圖2-F可知，正常澆水條件下，OE株系CAT活性均顯著低于WT株系，干旱處理后OE株系的酶活性較對(duì)照分別升高了2.79倍、3.73倍、7.20倍和6.47倍，而WT株系的酶活性僅升高了1.38倍。結(jié)果表明，過表達(dá)NtWRKY65能夠提高抗氧化酶活性，增強(qiáng)轉(zhuǎn)基因株系在干旱脅迫下ROS清除能力，減少ROS的積累。

2.3 干旱脅迫對(duì)NtWRKY65過表達(dá)株系葉片中ABA含量的影響

由圖3可知，正常澆水條件下，OE株系的ABA含量均顯著高于WT株系； 干旱脅迫下，WT株系葉

片中ABA含量升高了15.25%，OE株系平均升高了38.35%。其中，OE-11株系葉片中ABA含量增幅較大，是對(duì)照處理的1.71倍。說明在受到干旱脅迫后，過表達(dá)NtWRKY65能夠提高轉(zhuǎn)基因株系葉片中ABA含量。

2.4 干旱脅迫對(duì)NtWRKY65過表達(dá)株系葉片中相關(guān)基因表達(dá)量的影響

2.4.1 對(duì)抗氧化相關(guān)基因表達(dá)量的影響

不同處理下抗氧化相關(guān)基因的相對(duì)表達(dá)量測(cè)定結(jié)果如圖 4-A、圖4-B、圖4-C所示，可以看出，在對(duì)照處理下，WT株系抗氧化相關(guān)基因的表達(dá)量均顯著低于OE株系；干旱脅迫處理后，OE株系的抗氧化相關(guān)基因的表達(dá)量大幅升高，其中OE-3株系的NtCAT1和NtSOD表達(dá)量分別是WT株系的9.72倍和5.28倍，OE-6和OE-8株系的NtAPX表達(dá)量大約是WT株系的7.5倍。說明干旱脅迫后，NtWRKY65通過提高抗氧化酶基因的表達(dá)，從而提高轉(zhuǎn)基因煙草抗氧化酶活性，提高其清除葉片中活性氧的能力，緩解葉片損傷。

2.4.2 對(duì)ABA相關(guān)基因表達(dá)量的影響

圖4-D、圖4-E、圖4-F為不同處理下ABA相關(guān)基因NtLTP、NtAREB1和NtDREB3基因的相對(duì)表達(dá)量測(cè)定結(jié)果。可以看出，對(duì)照處理下，WT株系的ABA相關(guān)基因表達(dá)量均低于OE株系；干旱脅迫處理后，OE株系A(chǔ)BA相關(guān)基因表達(dá)量均大幅升高，WT株系基因表達(dá)量雖有所升高，但仍明顯不如OE株系。對(duì)照處理下，各株系NtLTP、NtDREB3基因表達(dá)量均在10以下；干旱脅迫處理后，除OE-11株系外，各OE株系NtLTP基因表達(dá)量達(dá)到了60以上，除OE-6株系外，各OE株系NtDREB3基因表達(dá)量均達(dá)到55以上，而WT株系NtLTP基因表達(dá)量不到30，NtDREB3基因表達(dá)量仍在10以下。說明干旱脅迫下過表達(dá)NtWRKY65能夠激活A(yù)BA相關(guān)基因的表達(dá)。

2.4.3 對(duì)干旱應(yīng)激相關(guān)基因表達(dá)量的影響

對(duì)煙草干旱脅迫應(yīng)激相關(guān)基因NtLEA5、NtERD10c、NtCDPK2、NtTIP、NtCOR14a和NtDREB4的相對(duì)表達(dá)量進(jìn)行測(cè)定，結(jié)果如圖5所示。可以看出，在對(duì)照處理下，各株系的6個(gè)基因相對(duì)表達(dá)量均明顯低于干旱脅迫下的表達(dá)量，WT株系各基因表達(dá)量均較低且顯著低于OE株系；干旱處理下，WT株系各基因相對(duì)表達(dá)量雖有上調(diào)，但上調(diào)幅度遠(yuǎn)低于OE株系。OE-3株系受到干旱脅迫后，NtLEA5、NtERD10c、NtCDPK2、NtCOR15a基因上調(diào)幅度明顯高于WT株系。結(jié)果表明，過表達(dá)NtWRKY65能夠激活轉(zhuǎn)基因煙草葉片中干旱應(yīng)激相關(guān)基因的表達(dá)。

3 結(jié)論與討論

作為高等植物中規(guī)模最為龐大的轉(zhuǎn)錄因子家族之一，WRKY轉(zhuǎn)錄因子家族在調(diào)控植物生長(zhǎng)發(fā)育過程及抵御逆境脅迫中扮演著至關(guān)重要的角色。水稻、小麥、葡萄、陸地棉、苜蓿和番茄中的WRKY轉(zhuǎn)錄因子參與調(diào)控耐旱性的研究均有報(bào)道［23-28］，但NtWRKY65調(diào)控?zé)煵菽秃敌缘难芯肯鄬?duì)有限。本研究發(fā)現(xiàn)，在干旱脅迫處理10 d后，過表達(dá)NtWRKY65轉(zhuǎn)基因株系表現(xiàn)出較為良好的生長(zhǎng)狀態(tài)，葉片萎蔫程度顯著輕于WT株系，整株生物量較大，具有較高的葉片含水率和較低的相對(duì)電導(dǎo)率，說明過表達(dá)NtWRKY65能夠減小干旱脅迫對(duì)煙草生長(zhǎng)發(fā)育造成的影響。根系活力的高低對(duì)植物吸收利用土壤中水分和營(yíng)養(yǎng)元素等造成直接或間接的影響，是株系受到干旱脅迫后最先產(chǎn)生響應(yīng)的部位［29-30］。測(cè)定不同株系根系活力后發(fā)現(xiàn)，干旱脅迫處理后，轉(zhuǎn)基因株系在受到干旱脅迫后，根系活力均顯著高于WT

株系，說明NtWRKY65能夠使轉(zhuǎn)基因株系在受到脅迫后能夠保持相對(duì)較高的根系活力，這可能是NtWRKY65能夠提高株系耐旱性的一個(gè)重要原因。

在受到干旱等逆境脅迫后，植物體內(nèi)會(huì)積累過量的活性氧等物質(zhì)，導(dǎo)致細(xì)胞膜脂發(fā)生過氧化，從而使細(xì)胞膜的結(jié)構(gòu)和功能受損?？寡趸竿ㄟ^清除葉片中過剩的活性氧，在維持細(xì)胞正常生理功能中發(fā)揮關(guān)鍵作用［31］。本研究發(fā)現(xiàn)干旱脅迫處理后，與抗氧化過程相關(guān)的基因表達(dá)水平顯著上調(diào)，OE株系均顯著高于WT株系，測(cè)定抗氧化相關(guān)酶活性發(fā)現(xiàn)，OE株系抗氧化相關(guān)酶活性顯著高于WT株系，這與前人的研究結(jié)果［24-25，32］基本一致，表明干旱脅迫后，NtWRKY65可能促進(jìn)抗氧化相關(guān)基因的表達(dá)上調(diào)，進(jìn)而提高抗氧化酶活性，增強(qiáng)ROS的清除能力，減少干旱脅迫對(duì)株系造成的影響。干旱脅迫能夠使葉片中與脅迫相關(guān)基因表達(dá)發(fā)生改變，從而在分子水平上響應(yīng)脅迫。OE株系干旱脅迫相關(guān)基因的表達(dá)顯著高于WT株系，表明NtWRKY65可能通過上調(diào)干旱脅迫相關(guān)基因的表達(dá)水平從而提高煙草對(duì)干旱脅迫的抗性。

前人已在多種植物中發(fā)現(xiàn)WRKY轉(zhuǎn)錄因子通過ABA信號(hào)通路參與干旱脅迫，ZmWRKY79通過與玉米原生質(zhì)體中ZmAAO3基因啟動(dòng)子特異性結(jié)合，促進(jìn)ABA的生物合成從而提高玉米的抗旱性［33］。Liu等的研究結(jié)果表明，GmWRKY17直接與GmDREB1D和GmABA2的啟動(dòng)子結(jié)合，并在干旱脅迫下激活他們的表達(dá)，增強(qiáng)大豆的耐旱性［34］。本研究發(fā)現(xiàn)，OE株系在干旱條件下比WT株系具有更高的ABA含量。進(jìn)一步qRT-PCR研究發(fā)現(xiàn)，OE株系中參與脅迫相關(guān)的基因NtTIP、NtAREB1和NtDREB3顯著上調(diào)表達(dá)（圖5），該結(jié)果表明，NtWRKY65能夠調(diào)節(jié)轉(zhuǎn)基因煙草的耐旱性可能與ABA的合成有關(guān)。本研究對(duì)NtWRKY65提高轉(zhuǎn)基因煙草耐旱性的功能進(jìn)行分析，并對(duì)其響應(yīng)干旱脅迫的原因進(jìn)行初探，但并未深入研究其作用途徑。李滿證明了NtWRKY65蛋白具有轉(zhuǎn)錄激活活性［35］，后續(xù)可通過轉(zhuǎn)錄組測(cè)序技術(shù)和染色質(zhì)免疫沉淀測(cè)序技術(shù)尋找NtWRKY65的靶基因，并通過酵母單雜試驗(yàn)和雙熒光素酶試驗(yàn)等進(jìn)行驗(yàn)證。

在干旱脅迫下，過表達(dá)煙草轉(zhuǎn)錄因子NtWRKY65能夠降低葉片的相對(duì)電導(dǎo)率及MDA含量，上調(diào)抗氧化相關(guān)基因的表達(dá)，從而提高抗氧化酶活性，增強(qiáng)轉(zhuǎn)基因煙草抗氧化性能，提高ABA相關(guān)基因和應(yīng)激相關(guān)基因表達(dá)，促進(jìn)ABA的生物合成，增強(qiáng)轉(zhuǎn)基因煙草的耐旱性。NtWRKY65具有正調(diào)控?zé)煵菽秃敌缘墓δ?，可以作為煙草抗旱育種的候選基因資源。

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