忍冬F(xiàn)lowering Locus T基因家族鑒定及在開花進程中的表達分析

摘要：為研究植物開花整合基因FT（Flowering Locus r）及其同源基因在忍冬（Lonicera japonica Thunb.）開花過程中的表達模式及功能，本研究通過生物信息學(xué)方法，利用忍冬品種“華金6號”基因組信息，篩選獲得7個LjFT及其同源基因，并對其進行了系統(tǒng)分析。利用實時熒光定量PCR（real-time quantitative PCR，RT-qPCR）分析LjFT及其同源基因的表達情況，發(fā)現(xiàn)LjFT基因的表達量在扦插苗和實生苗中隨日照時間的增加逐漸上升，表明其可能是忍冬開花的促進子；LjFTL2、LjFTL3、LjFTL4、LjFTL5和LjFTL6基因的表達量在扦插苗和實生苗中隨日照時間的增加逐漸下降，表明其可能是忍冬開花的抑制子。進一步利用異源表達擬南芥的方法對LjFT進行功能分析發(fā)現(xiàn)，與對照相比，LjFT過表達的擬南芥植株開花時間提前，說明LjFT具有促進植物提早開花的功能。本研究結(jié)果為解析忍冬開花時間的調(diào)控機制提供了重要線索，同時為不同花期忍冬新品種的選育提供了基因靶點。

關(guān)鍵詞：忍冬；FT及其同源基因：開花；表達分析；功能分析

中圖分類號：S567.79：Q78 文獻標識號：A 文章編號：1001-4942（2025） 03-0010-09

忍冬（Lonicera japonica Thunb.）是忍冬科忍冬屬多年生纏繞藤本植物，在中國各地均有分布，有兩千多年的栽培歷史。金銀花為忍冬的干燥花蕾或初開的花，主產(chǎn)于河南、河北和山東，具有疏散風(fēng)熱、清熱解毒的功效，以及抗菌、抗炎、抗病毒等多種藥理作用。

忍冬從幼蕾到花開放大體可以分為幼蕾、三青、二白、大白、銀花、金花、凋花七個階段，以花發(fā)育早期收獲的金銀花藥效成分含量較高，即以大白、二白和三青階段的金銀花藥材為佳，銀花、金花次之。其中大白期是每茬金銀花花蕾采收的最佳時期，如果采摘過早，金銀花花蕾幼小，會導(dǎo)致產(chǎn)量降低：如果采摘過晚，則花已開放，藥效降低。因此，適時采摘是提高金銀花產(chǎn)量和質(zhì)量的關(guān)鍵。但是忍冬常見品種的花期集中，只有6-8天，若遇到高溫年份，花期還會更短，需要雇傭勞動力采摘，而采摘期多在春耕大忙期，這不僅會導(dǎo)致人工成本增加，還會導(dǎo)致采摘的金銀花質(zhì)量難把控或出現(xiàn)因采摘不及時而導(dǎo)致花蕾開放的情況，降低經(jīng)濟效益。因此，選育不同花期的忍冬品種是金銀花種植業(yè)亟待解決的重要問題之一。研究表明植物的花期主要受開花時間基因調(diào)控網(wǎng)絡(luò)的控制，然而目前有關(guān)忍冬開花時間基因調(diào)控網(wǎng)絡(luò)及關(guān)鍵調(diào)控因子的研究較少，忍冬開花時間的調(diào)控機制尚不明確。

開花是植物從營養(yǎng)生長向生殖生長轉(zhuǎn)變的過程，開花相關(guān)基因的表達是實現(xiàn)這一轉(zhuǎn)變的基礎(chǔ)，環(huán)境因子以及細胞自身的生長狀況對這些基因的表達起著調(diào)控作用。根據(jù)對模式植物擬南芥（Arabidopsis thaliana）的研究，一般認為，植物的開花時間調(diào)控網(wǎng)絡(luò)由光周期途徑、春化途徑、自主途徑、溫度途徑、年齡途徑和赤霉素途徑組成。植物生長到一定的階段，經(jīng)過春化作用、光周期誘導(dǎo)等，在FLC（FLOWERING /O-CUS C）、CO（CONSTANS）、LFY（LEALY）、FT（FLOWERING LOCUS T）和AP1 （APETALA1）等多個基因的協(xié)同作用下誘導(dǎo)花芽的分化，最終形成花器官。在這個過程中，6條開花通路調(diào)節(jié)信號傳遞到開花整合基因FT，F(xiàn)T基因編碼的蛋白產(chǎn)物是可以長距離轉(zhuǎn)運的成花素，其通過整合復(fù)雜的調(diào)控信號傳遞到花分生組織，進而控制植物開花。因此，成花素基因FT是植物開花調(diào)控途徑中的匯集點，是決定植物開花時間的關(guān)鍵基因。目前，在許多植物中發(fā)現(xiàn)了FT及其家族成員的存在，如小麥（Triticum aestivum L．）的TaVRN3（Vernalization 3）、玉米（Zea mays L.）的ZmZCN8（ZEA CENTRORADIALIS 8）、大豆[Gly-czne max （L.） Merr.]的GmFT2a（Glyma.16G150700）和GmFT5a（Glyma. 16G044100）。及GmFT2b（Glyma. 16G151000）、園藝作物菊花[Chrysanthemum morifolium（Ramat.）Tzvel.]的CmFTL3（CmFT-Iikes3）等。FT及其同源基因在長、短日照和中性日照植物中廣泛存在，可能具有相似的功能，這為不同物種的開花時間調(diào)控研究提供了思路。

金銀花是我國傳統(tǒng)大宗中藥材，廣泛應(yīng)用于食品、醫(yī)藥、化妝品以及養(yǎng)殖等領(lǐng)域。不同花期的忍冬品種是金銀花種植產(chǎn)業(yè)中的重大需求。然而，目前忍冬F(xiàn)T及其同源基因尚未得到鑒定，基因功能尚不明確，阻礙了不同花期忍冬新品種的選育。因此，開展忍冬F(xiàn)T及其同源基因的克隆鑒定、表達分析及功能研究，可為解析忍冬開花時間的調(diào)控機制提供重要線索，同時為不同花期忍冬新品種的選育提供基因靶點。

1 材料與方法

1.1 供試材料

用于基因表達分析及基因克隆的植物材料取自山東中醫(yī)藥大學(xué)藥用植物園的忍冬植株，品種為“華金六號”。基因轉(zhuǎn)化所用的擬南芥為Col-O生態(tài)型。

1.2 忍冬F(xiàn)T及其同源基因的鑒定及理化性質(zhì)分析

利用“華金6號”忍冬基因組測序信息，通過基因注釋、Blast、PCR克隆等方法，篩選獲得7個LjFT及其同源基因。使用ExPASy server（ht-tps：//web. expasy.org/protparam/）在線網(wǎng)站預(yù)測LjFT及其同源蛋白的理化性質(zhì)，包括蛋白長度（protein length）、蛋白分子量（protein molecularweight，MW）、理論等電點（theoretical isoelectricpoint，pl）、不穩(wěn)定指數(shù)（instability index）和親水性：平均值（grand average of hydropathicity，GRA-VY）。使用Plant PLoc （http：//www. csbio. sjtu.edu.cn/bioinf/plant/#）在線網(wǎng)站預(yù)測LjFT及其同源蛋白亞細胞定位。

1.3 忍冬F(xiàn)T基因家族系統(tǒng)發(fā)育

從TAIR數(shù)據(jù)庫（http：//www. arabidopsis.org/）下載擬南芥FT及其同源蛋白序列，使用DNAMAN軟件對忍冬和擬南芥FT及其同源蛋白序列進行同源性比對。使用MEGA x軟件中的最大似然法（maximum likelihood，ML）對忍冬、擬南芥、玉米、大豆、毛果楊FT及其同源蛋白序列構(gòu)建進化樹，Bootstrap值設(shè)置為1 000。

1.4 忍冬F(xiàn)T及其同源基因的基因結(jié)構(gòu)及保守基序

使用Gene Structure Display Server（GSDS，http：//gsds. gao-lab. org/）在線網(wǎng)站分析基因結(jié)構(gòu)。使用Multiple EM for Motif Elicitation（MEME，https：//meme-suite. org/meme/）在線網(wǎng)站分析motif識別的motif總數(shù)限制為10個。

1.5 總RNA提取及cDNA合成

總RNA提取用試劑盒FastPure Plant TotalRNA Isolation Kit（Vazyme，南京），用超微量分光光度計檢測RNA濃度，用l070瓊脂糖凝膠電泳檢測RNA完整度。利用反轉(zhuǎn)錄試劑盒Primer-ScriptTM RT reagent Kit with gDNA Eraser（TaKa-Ra，大連）合成cDNA第一鏈，于-20℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.6 LjFT及其同源基因表達分析

選取種植于山東中醫(yī)藥大學(xué)藥用植物園的生長狀態(tài)一致的“華金6號”忍冬扦插苗（5月份開花）和一年生實生苗（當(dāng)年不開花）進行實時熒光定量PCR（RT-qPCR）分析，分別于2023年3月15日、4月14日、5月4日取葉片材料，設(shè)3個生物學(xué)重復(fù)，用于基因表達檢測：所有樣品材料均在上午10時左右采集，每次取5-8片葉，采后立即放入液氮中冷凍保存。RT-qPCR引物（表1）采用Primer Premier 5根據(jù)LiFT及其同源基因的CDS設(shè)計，Actin作為內(nèi)參基因，采用TB GreenPremix Ex TaqⅡ（TaKaRa，大連）和CFX96 Real-Time System（BIO-RAD，USA）進行RT-qPCR分析。利用2-ΔΔCt方法計算LjFT及其同源基因的相對表達量，每個樣品進行3次重復(fù)。

1.7 LjFT過表達載體的構(gòu)建與遺傳轉(zhuǎn)化

利用PCR方法克隆得到LjFT基因的CDS序列，將pGFPGUSplus質(zhì)粒用Xba I和Sac I進行雙酶切，切膠回收大片段，將LjFT基因的CDS序列利用同源重組方法連接到pGFPGUSplus載體，獲得pGFPGUSplus-/jFT重組過表達載體；將構(gòu)建好的過表達載體轉(zhuǎn)入農(nóng)桿菌GV3101，活化培養(yǎng)獲得侵染液；選取長勢良好的擬南芥植株，剪除角果及開放的花，利用花序侵染法侵染未開放的花，保濕培養(yǎng)1天，約1個月后收獲成熟的種子：收獲的擬南芥種子用75%乙醇消毒后撒在含有潮霉素的1/2 MS固體培養(yǎng)基上，篩選陽性植株。以AtTUB2作為內(nèi)參基因，采用TB Green Premix ExTaqⅡ（TaKaRa，大連）和CFX96 Real-Time Sys-tem（BIO-RAD，USA）進行RT-qPCR分析。利用2-ΔΔCt方法計算對照及過表達植株中LjFT的相對表達量。經(jīng)鑒定具有潮霉素抗性且LjFT超量表達的擬南芥株系，收獲其種子繼續(xù)種植培養(yǎng)，直至收獲T3代純合種子，用于后續(xù)分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 忍冬F(xiàn)T及其同源基因的鑒定

基于“華金6號”忍冬的基因組信息，共篩選獲得7個LjFT及其同源基因，分別命名為LjFT（Ljap00024631）、LjFTL1（LjFTlikel，Ljap000102410）、LjFTL2（Ljap00015789）、LjFTL3（Ljap00015953）、LjFTL4（Ljap00018074）、LjFTL5（Ljap00028125）、LjFTL6（Ljap00028946），其蛋白氨基酸序列長度在71 aa（LjFTL1）到174 aa（LjFT、LjFTL2）之間，平均長度為152 aa，分子量在8400.8 Da（LjFTL1）至19 675.16 Da（LjFT）之間，理論等電點在5.74（LjFTL6）至10.72（LjFTL1）之間，不穩(wěn)定指數(shù)均大于40，是不穩(wěn)定蛋白；親水性平均值均為負值，為親水性蛋白。亞細胞定位預(yù)測結(jié)果表明，LjFT、LjFTLI、LjFTL5定位于葉綠體，LjFTL4定位于過氧化物酶體，LjFTL2、LjFTL3、LjFTL6定位于細胞質(zhì)中（表2）。

2.2 忍冬F(xiàn)T及其同源蛋白的多序列比對及系統(tǒng)進化分析

利用DNAMAN軟件將忍冬和擬南芥FT及其同源蛋白的氨基酸序列進行多序列比對（圖1），發(fā)現(xiàn)LjFT及其同源蛋白之間片段同源性為45.79％，LjFT含有決定其功能的重要氨基酸位點Y（第84位的酪氨酸，Tyr）和Q（第139位的谷氨酸，Gln），另外，第137位的色氨酸（Trp，W）相對保守且是必需的。

本研究利用MEGA x中的最大似然法構(gòu)建了忍冬LjFT與擬南芥、大豆、玉米、毛果楊FT及其同源蛋白之間的系統(tǒng)進化樹（圖2）。參考擬南芥序列的分類依據(jù)，所有蛋白可分為3個亞組，分別是TEL1 - like、MFT - like、FT - likeoLjFTL1、LjFTL2、LjFTL3、LjFTL4位于TEL1 -like亞組，LjFTL5位于MFT-like亞組，LjFT、LjFT6位于FT - like亞組。其中LjFTL6與毛果楊PNS99216親緣關(guān)系最近。

2.3 忍冬F(xiàn)T及其同源基因的基因結(jié)構(gòu)與保守基序分析

利用GSDS 2.0在線網(wǎng)站對7個LjFT及其同源基因進行結(jié)構(gòu)分析，結(jié)果（圖3）發(fā)現(xiàn)，LjFT、LjFTL1、LjFTL2、LjFTL3、LjFT24、LjFTL5基因有4個外顯子、3個內(nèi)含子，LjFTL6只有2個外顯子和1個內(nèi)含子。進化樹形成了LjFTL2/LjFTL3基因?qū)?，兩者具有相似的結(jié)構(gòu)，說明它們可能具有相似的功能。

使用MEME在線網(wǎng)站分析了7個LjFT家族蛋白的保守基序（motif），發(fā)現(xiàn)有10個含有不同氨基酸序列的保守基序（圖4），各蛋白的保守基序數(shù)目在2-6個之間（圖5），其中LjFT含有5個保守基序（motif1、motif2、motif3、motif4、motif7），LjFTL1含有2個保守基序（motif5、motif6），LjFTL2含有5個保守基序（motif1、motif2、motif3、motif4、motif7），LjFTL3含有5個保守基序（motif1、motif2、motif3、motif7、motif10），LjFTL4含有4個保守基序（motif1、motif2、motif3、motif4），LjFTL5含有6個保守基序（mo-tif2、motif3、motif5、motif6、motif9、motif10），LjFTL6含有3個保守基序（motif5、motif8、motif9）。

2.4 忍冬F(xiàn)T及其同源基因的表達分析

利用RT-qPCR技術(shù)對“華金6號”扦插苗（5月份開花）和一年生實生苗（當(dāng)年不開花）中LjFT及其同源基因進行表達量分析，發(fā)現(xiàn)除了LjFTL1外，其他基因在扦插苗和實生苗中都有表達（圖6）。LjFT在扦插苗和實生苗中隨日照時間的增加，表達量逐漸上升，表明LjFT可能促進開花；而LjFTL2、LjFTL3、LjFT24、LjFTL5和LjFTL6的表達量隨日照時間的增加總體呈下降趨勢，表明LjFTL2-LjFTL6可能抑制開花。LjFT在扦插苗中的表達量明顯高于在實生苗中，而LjFTL5在扦插苗中的表達量明顯低于在實生苗中，這種差異可能是扦插苗和實生苗開花時間不同的重要內(nèi)在原因。

2.5 忍冬F(xiàn)T在擬南芥開花時間中的功能分析

為驗證LjFT的功能，構(gòu)建LjFT過表達載體pG-FPGUSplus-LjFT并轉(zhuǎn)化擬南芥，利用潮霉素篩選陽性植株，利用RT-qPCR對其LjFT表達量進行檢測，結(jié)果（圖7）發(fā)現(xiàn)，與對照（轉(zhuǎn)化pGFPGUSplus空載體）植株相比，轉(zhuǎn)基因陽性植株中LjFT處于超量表達狀態(tài)。選取LjFT過表達株系LjFT- OE3、LjFT-OE4及對照Mock株系進行開花時間統(tǒng)計發(fā)現(xiàn)，兩個過表達株系的開花時間顯著早于對照株系（P＜0.001），說明過表達LjFT促進擬南芥開花。

3 討論

開花是高等植物發(fā)育和繁衍后代中的一個關(guān)鍵過程，而FT基因在調(diào)控開花過程中起著重要作用。研究表明，F(xiàn)T同源基因在擬南芥、牽牛花（Ipomoea purpurea）、獼猴桃（Actinidia）、板栗（Castanea mollissima）等植物中均存在，且都具有促進植物開花的功能。將西紅花（Crocus sativus）的3個FT基因Csat FT1、Csat FT2、CsatFT3在煙草和擬南芥中過量表達，轉(zhuǎn)基因植株均表現(xiàn)為提早開花，說明西紅花的3個FT基因具有促進開花的功能。高羊茅（Festuca elata）的FaFT基因受光周期調(diào)控，表現(xiàn)出晝夜節(jié)律，在長日照條件下過表達FaFT的擬南芥植株比野生型提早開花。水稻（Oryza sativa）OsFTL4在根、莖、節(jié)、嫩葉、老葉、葉鞘等不同部位都有表達，在水稻節(jié)中的表達量最高：OsFTL4敲除突變體植株與野生型相比提早開花，并且OsFTI4還參與到了水稻的耐鹽和抗旱調(diào)控過程。

在本研究中，基于“華金6號”忍冬基因組信息，篩選獲得7個FT及其同源基因，通過與擬南芥FT同源基因進行比對發(fā)現(xiàn)，忍冬F(xiàn)T及其同源基因編碼蛋白具有保守的氨基酸位點；系統(tǒng)進化結(jié)果發(fā)現(xiàn)，LjFT與AtFT和AtTSF在同一亞組。TSF是擬南芥中與FT最接近的同源基因，二者均具有促進開花的功能，因此推測LjFT基因同樣具有促進開花的功能。此外，LjFT及其同源基因形成了LjFTL2/LjFTL3基因?qū)?，具有相似的基因結(jié)構(gòu)和保守基序，表明它們可能具有相似的功能。以上結(jié)果為進一步研究LjFT及其同源基因在忍冬開花時間調(diào)控中的功能提供了線索。

FT作為植物的成花素基因，主要功能是促進植物開花。研究發(fā)現(xiàn)，大豆GmFT5a過表達植株在長日照條件下提早開花，小麥TaFT-A3/B3/D3過表達植株在長短日照條件下呈現(xiàn)早花表型。本研究利用RT-qPCR檢測LjFT及其同源基因在忍冬扦插苗和一年生實生苗中的表達水平發(fā)現(xiàn)，除LjFTL1外，LjFT、LjFTL2-LjFTL6在扦插苗和實生苗中均有表達，其中LjFT的表達量隨日照時間增加逐漸上升，而LjFTL2-LjFTL6的表達量則隨日照時間的增加總體呈下降趨勢，表明LjFT可能是開花促進子，而LjFTL2-LjFTL6可能是開花抑制子。Ho等研究表明，擬南芥中W位點突變后能把FT促進開花功能轉(zhuǎn)變?yōu)橐种崎_花。因此，本研究中LjFT與LjFTL2-LjFTL6的表達及功能差異可能與其蛋白序列中W位點的變異相關(guān)。為了進一步驗證LjFT是否具有促進開花的功能，本研究利用同源重組的方法構(gòu)建了LjFT過表達載體，獲得LjFT過表達的轉(zhuǎn)基因擬南芥植株，與對照擬南芥植株相比，其開花時間明顯提前，說明LjFT具有促進植物開花的功能。結(jié)合LjFT在扦插苗和實生苗中的表達量變化，可得出結(jié)論：LjFT表達量隨日照時間的增加逐漸上升，促進了忍冬開花。

4 結(jié)論

本研究通過生物信息學(xué)方法從“華金6號”忍冬基因組中鑒定得到7個LjFT及其同源基因，系統(tǒng)分析發(fā)現(xiàn)它們分屬TEL1 -like、MFT -like、FT-like三個亞組。LjFT基因的表達量在扦插苗和實生苗中隨日照時間的增加逐漸上升，可能作為開花促進子發(fā)揮功能；LjFTL2、LjFTL3、LjFTL4、LjFTL5和LjFTL6基因的表達量在扦插苗和實生苗中隨日照時間的增加逐漸下降，可能作為開花抑制子發(fā)揮功能。與對照植株相比，LjFT過表達擬南芥植株的開花時間提前，說明LjFT具有促進植物提早開花的功能。本研究結(jié)果為解析忍冬開花時間的調(diào)控機制提供了重要線索，同時為不同花期忍冬新品種的選育提供了基因靶點。

基金項目：泰山學(xué)者工程專項經(jīng)費資助項目（tsqn202211135）；山東省高等學(xué)校青創(chuàng)人才引育計劃“中藥功能基因挖掘及基因組學(xué)研究創(chuàng)新團隊”項目；國家現(xiàn)代農(nóng)業(yè)產(chǎn)業(yè)技術(shù)體系項目（CARS-21）；國家自然科學(xué)基金項目（81872963，81903750）；山東中醫(yī)藥大學(xué)中藥資源可持續(xù)利用青年創(chuàng)新團隊項目