基于轉錄組測序技術挖掘燕山紅玉肉雞屠宰性狀功能基因

摘要：為了尋找燕山紅玉肉雞屠宰性狀相關基因，本研究以燕山紅玉肉雞為對象，通過對120只雞（公母各60只）進行解剖得到屠宰性狀指標，以胸肌重量高和低的兩組雞進行轉錄組測序及差異表達基因分析和KEGG富集分析，利用PCR擴增和測序技術進行多態(tài)位點篩查，并采用單因素方差分析對篩得的多態(tài)位點基因型與屠宰性狀指標進行關聯(lián)分析。結果表明：①顯著差異表達基因中有189個基因上調，40個基因下調；對上調基因集進行KEGG富集分析，發(fā)現PPAR信號通路對個體肝臟的脂質發(fā)育有重要影響，PLIN1基因參與該通路，最終影響脂肪細胞分化。②擴增PLIN1基因第8外顯子序列，篩查到一處多態(tài)位點c.258G＞A（rs731147932）．產生GG、AG、AA三種基因型，不同基因型公雞肝重和母雞心重差異顯著（P＜0.05）。綜上，PLIN1基因影響燕山紅玉肉雞屠宰性狀，其第8外顯子中c.258G＞A多態(tài)位點可作為燕山紅玉肉雞屠宰性狀改良的遺傳位點。

關鍵詞：燕山紅玉肉雞；轉錄組測序；PLIN1基因；多態(tài)位點；屠宰性狀

中圖分類號：S831.92：Q781 文獻標識號：A 文章編號：1001-4942（2025） 03-0166-07

長久以來，自有品種的匱乏使我國白羽肉雞種源主要依賴進口，另外我國對黃羽肉雞及屠宰加工型品種的需求呈上升趨勢，急需肉雞種業(yè)方面的科技創(chuàng)新進行支撐。肉雞種業(yè)作為肉雞產業(yè)鏈的頂端，扮演著肉雞科技創(chuàng)新的最前沿角色，是推動肉雞產業(yè)發(fā)展的核心要素。燕山紅玉肉雞是用安卡紅父母代公雞與巴布考克B380商品代母雞雜交出的肉雜雞，生長性能優(yōu)異、生長速度快、抗病能力強，自誕生以來飼養(yǎng)規(guī)模越來越大。本研究旨在尋找與燕山紅玉肉雞屠宰性狀相關的功能基因及分子標記，為更好地對其進行性能改良提供依據。

轉錄組測序（RNA - seq）是利用深度測序進行基因轉錄組分析的技術手段，屬于第二代測序技術在生命科學領域的應用，是研究基因表達和鑒定新型RNA種類的首選方法，在畜禽研究中已廣泛應用。袁茂等通過對不同時期藏雞腿肌組織轉錄組測序，鑒定出一些影響其肌肉發(fā)育的差異基因。

脂滴是細胞內儲存中性脂肪的主要部位，脂滴的不斷變化可維持脂質代謝活動的穩(wěn)定。1991年，Greenberg等發(fā)現一種蛋白質，存在于脂滴的表面，將其命名為圍脂滴蛋白，又稱脂滴包被蛋白（Peripilin，PLIN）。PLIN1蛋白在調控脂解和促進脂滴融合方面具有重要作用，研究表明PLIN1在成熟的脂肪細胞中高度表達；此外，在脂肪細胞分化為成熟狀態(tài)的過程中，PLIN1逐漸進入含有小脂滴的未成熟前脂肪細胞中，這表示PLIN1可能在脂滴的形成中發(fā)揮了作用。

本試驗對燕山紅玉肉雞胸肌重量高和重量低的兩組樣本進行轉錄組測序，通過差異表達基因篩選和KEGG富集分析篩選出影響其脂質發(fā)育的關鍵基因，旨在尋找到與該種肉雞生長及屠宰性狀相關的分子標記，對其基因和性能改良提供一定的理論和試驗基礎，并為更全面地利用這一遺傳資源提供可靠的理論依據。

1 材料與方法

1.1 試驗動物處理與分組

試驗雞為河北振志家禽育種有限公司培育的500只燕山紅玉肉雞，飼養(yǎng)場地為河北省唐山市曹妃甸區(qū)八農場基地。在4月齡時隨機選取120只雞（公母各60只）進行解剖，記錄活體重、放血重、屠體重、全凈膛重、半凈膛重、胸肌重、腿肌重、翅膀重、頭重、腳重、腺胃重、肌胃重、心重、肝重等屠宰數據，并采集各雞只的胸肌組織超低溫保存。根據胸肌重量高低分為兩組，每組各采集3只雞，編號XJG1、XJG2、XJG3的為胸肌重量高的一組（XJG組），編號XJD1、XJD2、XJD3的為胸肌重量低的一組（XJD組），胸肌組織送天津諾禾致源生物信息科技有限公司進行轉錄組測序。試驗樣品分組具體情況見表1。

1.2 RNA提取及轉錄組測序

使用Trizol法進行樣品總RNA提取，利用Nan-oDrop 2000分光光度計測定RNA濃度，使用Agilent5400片段分析儀系統(tǒng)評價RNA完整性和純度。RNA樣品檢測合格后，基于Illumina 1.8版本測序平臺建立轉錄本文庫，進行有參轉錄組測序。

1.3 轉錄組數據的處理與分析

采用DESeq2 1.20.0軟件，以Padj＜0.05且|log2（Fold Change）|＞1作為標準篩選差異表達基因；采用clusterProfiler 3.8.1軟件以Padj＜0.05作為標準進行富集分析，并采用R 3.5.0軟件的ggplot2包繪制差異基因火山圖。

1.4 基因多態(tài)性分析

根據GenBank收錄的雞PLIN1基因（登錄號：NC_052541）序列使用Primer Premier 3.0軟件設計引物，擴增PLIN1基因第8外顯子序列。引物由生工生物工程（上海）股份有限公司（下文稱生工公司）合成，引物信息見表2。使用生工公司試劑盒提取120只樣本胸肌組織DNA保存。以提取的DNA為模板，用上述引物進行PCR擴增。擴增體系（20μL）：2.5× Taq PCR mix 10 μL，10μmol/L上、下游引物各1μL，DNA模板1μL，超純水7μL。反應程序：94℃10 min；94℃40 s，60℃400 s，72℃40 s，35個循環(huán)；72℃ 10 min。PCR產物連同樣本DNA送生工公司測序。

1.5 數據處理與分析

采用Microsoft Excel軟件整理數據，采用SPSS 26.0軟件的單因素方差分析對各分組屠體指標進行分析，數據均以“平均值±標準差”表示。序列對比采用SnapGene 6.0.2軟件進行。

2 結果與分析

2.1 燕山紅玉肉雞轉錄組測序分析

通過對燕山紅玉肉雞胸肌組織RNA的上機測序，共構建6個轉錄組文庫，分為XJG組（XJG1、XJG2、XJG3）和XJD組（XJD1、XJD2、XJD3）。經過原始數據的過濾、測序錯誤率的檢查以及GC含量的分析，獲取了用于后續(xù)分析的高質量數據。具體數據匯總如表3所示。測序數據符合要求。

差異表達基因分析結果（圖1）顯示，XJG組和XJD組樣品間的顯著差異表達的基因中有189個基因上調表達，40個基因下調表達。

對上調表達基因進行KEGG富集分析，顯著性前20的通路如圖2所示，涉及Lysosome（溶酶體）、Phagosome（吞噬體）、Cytokine-cytokine recep-tor interaction（細胞因子—細胞因子受體相互作用）等通路。查閱KEGG數據庫發(fā)現，富集的基因主要參與PPAR信號通路，包含PLTP、FABP、LPL、PLIN1基因（圖3）。研究表明PPAR信號通路對個體骨骼肌和肝臟脂肪的發(fā)育有重要影響，其作用后期均有PLIN1基因參與，最終影響脂肪細胞分化，推測PLIN1基因在燕山紅玉肉雞脂質代謝調節(jié)中具有重要意義。

2.2 燕山紅玉肉雞PLIN1基因多態(tài)性分析

對燕山紅玉肉雞PLIN1基因第8外顯子序列進行基因多態(tài)性分析，發(fā)現有一處多態(tài)位點，為c.258G＞A，涉及3種基因型，分別為GG型、AG型和AA型（圖4）。與UCSC數據庫（University ofCalifornia， Santa Cruz）對比發(fā)現該位點與rs731147932一致，染色體位置為chr10：13267212。多態(tài)位點在試驗燕山紅玉肉雞群體中的基因型和等位基因頻率以及Hardy - Weinberg平衡檢驗結果見表4。GG基因型在公、母雞群體中均為頻率最高者，其次為AG基因型，最低的為AA基因型，可見GG基因型和G等位基因優(yōu)勢較明顯；Hardy-Weinberg檢驗表明燕山紅玉肉雞公母群體在該多態(tài)位點均處于遺傳平衡狀態(tài)（P＞0.05）。

2.3 燕山紅玉肉雞屠宰性狀分析

對120只燕山紅玉肉雞各屠宰性狀指標進行描述統(tǒng)計，結果（表5）顯示，性別因素對各屠宰性狀指標均具有極顯著影響（P＜0.01），可知該品種雞生長性能受性別影響極大。

2.4 燕山紅玉肉雞PLIN1基因多態(tài)性與屠宰性狀關聯(lián)分析

對燕山紅玉肉雞PLIN1基因多態(tài)位點（c.258G＞A）3種基因型與各屠宰性狀進行單因素方差分析，結果（表6）表明，PLIN1基因多態(tài)位點c.258G＞A不同基因型對燕山紅玉肉雞公雞肝重和母雞心重有顯著影響（P＜0.05），對其他屠宰性狀均無顯著影響。

對差異顯著的肝重和心重進行多重比較，結果（表6）表明，在公雞群體中，AG基因型樣本的肝重顯著高于GG基因型樣本，且AA基因型樣本與AG基因型和GG基因型差異均不顯著：在母雞群體中，AA基因型樣本的心重顯著高于GG基因型和AG基因型樣本，且GG基因型和AG基因型樣本的心重差異不顯著。因此在公雞群體中可以將AG基因型視為有利基因型，母雞群體中可以將AA基因型視為有利基因型，可據此進行人工干預育種實現性狀改良。

3 討論與結論

轉錄組測序在畜禽研究中已廣泛應用。Li等通過轉錄組測序鑒定出參與新疆棕牛和哈薩克牛脂肪與肌肉生成相關的差異表達基因：McDaneld等通過對豬不同時期的肌肉組織轉錄組測序，鑒定出與肌肉發(fā)育相關的miRNA；Yal-cintan等通過對羔羊不同肌肉部位轉錄組測序鑒定出影響其肉質的候選基因。

研究發(fā)現PLIN主要在脂肪組織中表達，但PLIN的表達水平與人肥胖之間的關聯(lián)受多種因素的調節(jié)，具體關系目前尚未確定。在畜禽中，對豬、牛、羊、鵝、鴨的檢測結果均發(fā)現PLIN基因對脂肪相關部位的發(fā)育有顯著或極顯著影響。同時有研究表明，PLIN1基因的表觀遺傳修飾可能在雞脂肪發(fā)育中對脂肪細胞的肥大起著重要作用。趙小玲研究表明，雞PLIN基因的表達量與皮脂厚度和肌內脂肪含量密切相關。此外周艷等也發(fā)現，PLIN1基因與雞的屠宰性狀及脂肪沉積有關。以上研究表明，PLIN1基因的表達對雞個體生長及發(fā)育具有一定的影響。

本試驗對燕山紅玉肉雞胸肌重量高和低的兩組樣本進行轉錄組測序分析，通過差異表達基因篩選和KEGG富集分析確定PLIN1基因在燕山紅玉肉雞脂質代謝調節(jié)中具有重要意義。通過序列比對發(fā)現，PLIN1基因第8外顯子有一處與屠宰性狀顯著相關的多態(tài)位點c．258G＞A（rs731147932），產生GG、AG、AA三種基因型，公雞群體中可以將AG基因型視為有利基因型，母雞群體中可以將AA基因型視為有利基因型，該基因可作為改良燕山紅玉肉雞屠宰性狀的候選基因。

基金項目：河北省現代種業(yè)科技創(chuàng)新專項“雞現代種業(yè)科技創(chuàng)新團隊”（21326303D-5）