洛島紅雞卵黃囊源性間充質(zhì)干細(xì)胞的分離培養(yǎng)及其分化潛能研究

摘 要： 旨在體外獲得并培養(yǎng)洛島紅雞卵黃囊間充質(zhì)干細(xì)胞（chicken yolk sac mesenchymal stem cell，cYS-MSCs），檢測其體外增殖能力和生物學(xué)特性。本研究選取已孵化12天的健康洛島紅雞受精蛋的卵黃囊進(jìn)行組織貼壁培養(yǎng)，選擇第5代cYS-MSCs進(jìn)行免疫熒光和RT-PCR檢測表面標(biāo)記基因；選擇第3代、第9代和第15代cYS-MSCs，每代次設(shè)置3個(gè)重復(fù)，繪制生長曲線、計(jì)算群體倍增時(shí)間和克隆形成率；通過核型分析檢測遺傳穩(wěn)定性；選擇第9代cYS-MSCs進(jìn)行成脂、成軟骨和成骨誘導(dǎo)，通過特異性染色和RT-PCR檢測多向分化能力。結(jié)果，分離培養(yǎng)的細(xì)胞為長梭形，呈漩渦狀或平行式生長；免疫熒光結(jié)果顯示CD29、CD73、CD90和CD166呈陽性表達(dá)，而造血干細(xì)胞標(biāo)記基因CD34和泛白細(xì)胞標(biāo)記基因CD45不表達(dá)；RT-PCR結(jié)果顯示CD29、CD44、CD73、CD90和CD166表達(dá)，而CD34和CD45不表達(dá)；cYS-MSCs呈“S”型增長，且第3代的群體倍增時(shí)間極顯著低于第9代（P＜0.001），第9代群體倍增時(shí)間極顯著低于第15代（P＜0.001），第3代的克隆形成率極顯著高于第9代（P＜0.001），第9代極顯著高于第15代（P＜0.001）；染色體核型分析結(jié)果顯示經(jīng)過連續(xù)傳代的cYS-MSCs染色體數(shù)量、形態(tài)正常（2n=78，zz）；誘導(dǎo)分化的cYS-MSCs，特異性染色和RT-PCR結(jié)果顯示cYS-MSCs可被成功誘導(dǎo)分化為成脂肪細(xì)胞、成軟骨細(xì)胞和成骨細(xì)胞。綜上，本研究成功從雞胚卵黃囊中分離獲得MSCs，且能在體外培養(yǎng)增殖，并且分離的cYS-MSCs具有MSCs的生物學(xué)特性和多向分化潛能，其多向分化潛能預(yù)示細(xì)胞移植的前景，可為洛島紅雞種質(zhì)資源保存提供依據(jù)和潛在可利用資源。

關(guān)鍵詞： 卵黃囊；間充質(zhì)干細(xì)胞；洛島紅雞；生物學(xué)特性；分化潛能

中圖分類號：

S831.3"""" 文獻(xiàn)標(biāo)志碼：A"""" 文章編號： 0366-6964（2025）03-1252-12

收稿日期：2024-06-26

基金項(xiàng)目：國家重點(diǎn)研發(fā)計(jì)劃（2021YFD1300100；2021YFD1200303）

作者簡介：閆 炎（1998-），女，山東濟(jì)寧人，碩士生，主要從事間充質(zhì)干細(xì)胞與動物生物技術(shù)研究，E-mail：17853651215@163.com;劉晏辰（1997-），男，黑龍江佳木斯人，博士生，主要從事畜牧相關(guān)研究，E-mail：401979899@qq.com。閆炎和劉晏辰為同等貢獻(xiàn)作者

*通信作者：姜運(yùn)良，主要從事動物分子遺傳育種與生物技術(shù)研究，E-mail：zhaojy@sdau.edu.cn; 關(guān)偉軍，主要從事畜禽遺傳資源保存與應(yīng)用研究，E-mail：guanweijun@caas.cn

Isolation， Culture and Differentiation Potential of Mesenchymal Stem Cells of Yolk

Sacs from Rhode Island Red Chicken

YAN" Yan "LIU Yanchen2， WANG Zhongfa2， LI Minjuan2， HE Yunan2， GUAN" Weijun^2*， JIANG" Yunliang^1*

（1.College of Animal Science and Technology， Shandong Agricultural University，

Taian 271000，" China;

2.Institute of Animal Science， Chinese Academy of

Agricultural Sciences， Beijing 100193，" China）

Abstract： The study aimed to obtain and cultivate Rhode Island Red yolk sac mesenchymal stem cells （cYS-MSCs）， then evaluate proliferative capacity and biological properties in vitro. The yolk sac of fertilized Rhode Island Red eggs， which had been incubated for 12 days， was selected for tissue adherent culture. The 5th generation of cYS-MSCs was chosen for immunofluorescence and RT-PCR analyses to detect surface marker genes. Additionally， the 3rd， 9th， and 15th generations of cYS-MSCs were selected， with 3 replicates established for each generation， to plot growth curves， calculate population doubling time， and assess colony formation rates. Genetic stability was evaluated through karyotyping. The 9th generation of cYS-MSCs was further selected for adipogenic and cartilage induction， with multidirectional differentiation capabilities assessed using specific staining and RT-PCR. The isolated cells were characterized by a long， spindle-shaped morphology， growing in either a swirling or parallel pattern. Immunofluorescence results indicated the expression of CD29， CD73， CD90， and CD166， while the hematopoietic stem cell marker gene CD34 and the panleukocyte marker gene CD45 were not expressed. Additionally， RT-PCR results confirmed the expression of CD29， CD44， CD73， CD90， and CD166， with CD34 and CD45 remaining unexpressed. The cYS-MSCs exhibited an ′S′ type growth pattern， with the population doubling time of the 3rd generation being extremely significantly lower than that of the 9th generation （Plt;0.001）. Furthermore， the population doubling time of the 9th generation was extremely significantly lower than the 15th generation （Plt;0.001）. The cloning rate of the 3rd generation was extremely significantly higher than the 9th generation （Plt;0.001）， and the cloning rate of 9th generation was also extremely significantly higher than the 15th generation （Plt;0.001）. Karyotype analysis revealed that the number and morphology of cYS-MSCs were normal （2n=78， zz）. Specific staining and RT-PCR results demonstrated that cYS-MSCs could be successfully induced to differentiate into adipoblasts， chondroblasts， and osteoblasts. In conclusion， MSCs were successfully isolated from the yolk sac of chicken embryos， demonstrating the ability to be cultured and proliferated in vitro. The isolated cYS-MSCs exhibited the biological characteristics and multidirectional differentiation potential typical of MSCs. This differentiation potential suggests promising prospects for cell transplantation， providing a foundation and potential resources for the conservation of Rhode Island Red germplasm resources.

Keywords： yolk sacs; mesenchymal stem cells; Rhode Island Red chicken; biological characteristics; differentiation potential

*Corresponding authors： JIANG Yunliang，E-mail： zhaojy@sdau.edu.cn; GUAN Weijun，E-mail：guanweijun@caas.cn

洛島紅雞育成于美國洛德島州，屬于兼用型雞種，羽毛呈深紅色，尾羽黑色，具有體軀各部肌肉發(fā)達(dá)，體質(zhì)強(qiáng)健，適應(yīng)性強(qiáng)等優(yōu)勢，洛島紅雞母雞的性成熟期約180 d，年產(chǎn)量為160～170個(gè)，高產(chǎn)者可達(dá)200個(gè)，現(xiàn)代禽業(yè)多用其作為父本與其他兼用型雞或白來航雞雜交，育成高產(chǎn)的褐殼蛋商品雞，因此洛島紅雞是禽業(yè)重要品種之一。我國擁有世界最大的畜禽種業(yè)市場，切實(shí)加強(qiáng)畜禽種質(zhì)資源保護(hù)，對于提高我國核心種源自給率、提升畜禽育種自主創(chuàng)新能力等方面意義重大。

卵黃囊（yolk sac， YS）是一種胚胎外組織，從大約第2胚齡開始從胚胎腸道逐漸包裹蛋黃，YS形成3層細(xì)胞有序排列，剛開始胚胎的外胚層細(xì)胞迅速擴(kuò)散到蛋黃表面，內(nèi)胚層細(xì)胞在蛋黃和外胚層細(xì)胞之間擴(kuò)散，形成與蛋黃接觸的上皮細(xì)胞層，對于吸收營養(yǎng)有重要作用^［1］，隨著卵黃被吸收，YS于孵化第20天全消失。YS是一種多功能器官， 發(fā)揮宿主免疫、營養(yǎng)攝取、碳水化合物和脂類代謝以及紅細(xì)胞生成等功能，因此YS是雞發(fā)育中胚胎生長、發(fā)育和健康的很重要器官^［2］。盡管卵生物種和胎生物種存在較大區(qū)別，但在胚胎發(fā)育和成熟時(shí)，YS發(fā)揮了多種相似功能。有研究使用RNA-seq比較了雞、人類和小鼠的YS，發(fā)現(xiàn)鳥類和哺乳動物的發(fā)育不同，但兩者YS的功能保守^［3-4］。雞YS是母體將營養(yǎng)輸送到胚胎的重要裝置，遠(yuǎn)早于胎盤發(fā)揮作用的時(shí)間^［5］。有報(bào)道關(guān)于靈長類動物胚胎發(fā)育期間強(qiáng)調(diào)了YS作為造血、生殖細(xì)胞發(fā)育和營養(yǎng)供應(yīng)的關(guān)鍵作用^［6］。同時(shí)有大量關(guān)于臍帶MSCs的相關(guān)報(bào)道，甚至已經(jīng)涉足臨床醫(yī)學(xué)領(lǐng)域^［7-9］。鑒于在鳥類胚胎發(fā)育中卵黃囊起到與哺乳動物臍帶相似的作用，即輸送營養(yǎng)、造血等功能，猜測鳥類胚胎發(fā)育時(shí)卵黃囊中有MSCs存在的可能。

間充質(zhì)干細(xì)胞（mesenchymal stem cells，MSCs）是存在于大多數(shù)組織中的多能細(xì)胞，如骨髓、胎盤、脂肪、肌肉、羊水、肝、肺、脾、臍帶、牙髓、華頓氏膠質(zhì)、真皮和軟骨膜等，MSCs最初被發(fā)現(xiàn)具有自我更新和多向誘導(dǎo)分化潛能（脂肪細(xì)胞、骨細(xì)胞、軟骨細(xì)胞、肌腱和肌肉）^［10-13］。據(jù)報(bào)道間質(zhì)干細(xì)胞樣細(xì)胞可被誘導(dǎo)為內(nèi)皮細(xì)胞、干細(xì)胞和神經(jīng)細(xì)胞^［14-18］。MSCs在生命科學(xué)的細(xì)胞修復(fù)、發(fā)育生物學(xué)、藥學(xué)等多領(lǐng)域有極為廣闊的應(yīng)用前景，目前研究最深入的MSCs來源于人骨髓，且多種來源的MSCs的使用已經(jīng)成為多種疾病有前途的療法^［19］。研究表明，通過細(xì)胞療法能使受損組織募集足夠的MSCs，以減輕炎癥、增強(qiáng)血管生成和促進(jìn)再生，靜脈注射的MSCs遷移到多種器官，有報(bào)道稱間充質(zhì)干細(xì)胞自主遷移到損傷或炎癥組織^［20-22］。在機(jī)制上，成纖維細(xì)胞和內(nèi)皮細(xì)胞可能是損傷修復(fù)過程中最常見的細(xì)胞類型，但有研究表明來自骨髓的MSCs可以遷移到受損組織部位并釋放多種生長因子，如成纖維細(xì)胞生長因子（FGF）、表皮生長因子（EGF）和血管內(nèi)皮生長因子（VEGF）等，都影響成纖維細(xì)胞和內(nèi)皮細(xì)胞的發(fā)育，猜測這是MSCs促進(jìn)各種損傷修復(fù)的機(jī)制^［23-25］。不同組織來源的MSCs作為種質(zhì)資源細(xì)胞，可為其品種進(jìn)行種質(zhì)資源保存、科學(xué)研究及臨床疾病治療提供物質(zhì)基礎(chǔ)。

前人對MSCs的研究大多集中于哺乳動物，對于禽類來源的MSCs研究相對較少，與哺乳動物相比，雞蛋來源豐富，容易采集，即雞胚胎可廣泛獲得，成本較低，故cYS-MSCs具有多種優(yōu)勢，可以輕易在體外分離、培養(yǎng)和增殖^［26-28］。本研究對洛島紅雞雞胚的卵黃囊進(jìn)行MSCs的分離培養(yǎng)及分化潛能研究，可降低MSCs的研究成本，試圖為研究家禽來源的MSCs提供了更多的組織來源，同時(shí)MSCs的多向分化潛能預(yù)示細(xì)胞移植的前景，可為家禽種質(zhì)資源保存提供依據(jù)和潛在可利用資源。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

1.1.1 試驗(yàn)動物

洛島紅雞受精蛋由中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院北京畜牧獸醫(yī)研究所昌平試驗(yàn)基地提供。

1.1.2 主要試劑

胰蛋白酶（Trypsin，Gibco），胎牛血清（FBS，Gibco），Dulbecco’s Modified Eagle Medium/Nutrient Mixture F12（DMEM/F12，Gibco），青霉素-鏈霉素混合溶液（Gibco），Ⅳ型膠原酶（Sigma），山羊血清（Bioss），CD29、CD73、CD90、CD166、CD34、CD45一抗（Abcam），F(xiàn)ITC標(biāo)記山羊抗兔二抗（Bioss），RNA逆轉(zhuǎn)錄試劑盒（TaKaRa），2×Fast Pfu PCR Master Mix試劑盒（Servicebio），50×TAE（Biotopped），瓊脂糖（BIOWEST），Gimesa染液（Solarbio），油紅O染色試劑盒（Solarbio），阿利新藍(lán)染色試劑盒（Solarbio），茜素紅S染色液（Solarbio）。

1.1.3 主要儀器

激光共聚焦顯微鏡（Nikon），TCS SP8激光共聚焦顯微系統(tǒng)（Leica），DMI6000B熒光微分干涉倒置顯微鏡（Leica），TH4-100倒置顯微鏡（Olympus），CO2培養(yǎng)箱（Heraeus），D1008小型離心機(jī)（DLAB），高速冷凍離心機(jī)（可成儀器），紫外分光光度計(jì)（Bio Drop），電泳儀（北京六一儀器廠），Veriti梯度PCR儀（Applied Biosystems），Gel Doc XR＋凝膠成像系統(tǒng)（Bio-Rad）。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 cYS-MSCs的分離培養(yǎng)" 將洛島紅雞受精蛋置于孵化箱中，設(shè)置38 ℃、50%濕度、5% CO2孵化。取出12胚齡受精蛋，用新潔爾滅浸泡、清洗，再用75%酒精擦拭，在無菌條件下輕敲開胚蛋，用組織剪分離并剪下卵黃囊，剝離血管，用含1%青霉素-鏈霉素混合溶液的PBS清洗3遍，再將其剪成體積為1 mm3大小的組織塊，PBS清洗后用細(xì)胞夾將組織塊轉(zhuǎn)移至60 mm培養(yǎng)皿中，待組織塊適度干燥并附著于培養(yǎng)皿底時(shí)用DMEM/F12添加10% FBS、1%青霉素-鏈霉素混合溶液置于37 ℃、5% CO2細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。3 d更換培養(yǎng)基，5 d左右可在顯微鏡下觀察到有大量細(xì)胞從組織周圍爬出，待細(xì)胞匯合度達(dá)到80%時(shí)傳代，傳代后的細(xì)胞為長梭形，呈平行式或漩渦式排列，是典型的成纖維樣細(xì)胞，具有間充質(zhì)干細(xì)胞表型，第3代即可獲得較高純度的cYS-MSCs，繼續(xù)傳代，進(jìn)行后續(xù)試驗(yàn)。

1.2.2 cYS-MSCs的體外增殖能力檢測" 選擇第3代、第9代和第15代cYS-MSCs進(jìn)行細(xì)胞計(jì)數(shù)，24孔板鋪板，每孔接種1×104個(gè)細(xì)胞，置于細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，每隔24 h計(jì)數(shù)1次，每次選取3個(gè)孔，每孔分別加入500 μL 0.25%胰蛋白酶消化后，再加入500 μL培養(yǎng)基終止，制成1 mL細(xì)胞懸液后進(jìn)行計(jì)數(shù)，計(jì)算出平均細(xì)胞數(shù)，連續(xù)計(jì)數(shù)7 d。根據(jù)每天平均值細(xì)胞數(shù)繪制生長曲線，根據(jù)公式（1）計(jì)算3個(gè)代次細(xì)胞的群體倍增時(shí)間（population doubling time，PDT）：

PDT=（t-t0） lg2/（lgNt-lgN0） （1）

式（1）中，t0為培養(yǎng)起始時(shí)間，t為培養(yǎng)終止時(shí)間，N0為培養(yǎng)起始細(xì)胞數(shù)，Nt為培養(yǎng)終止細(xì)胞數(shù)。

1.2.3 cYS-MSCs的克隆形成能力檢測" 選擇第3代、第9代和第15代的cYS-MSCs，選用6孔板鋪板，每孔接種100個(gè)細(xì)胞，每個(gè)代次分別鋪3個(gè)孔，置于細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，4 d換一次液，14 d后觀察到單個(gè)cYS-MSCs形成較大細(xì)胞克隆團(tuán)，吸出原培養(yǎng)基，用PBS清洗后，每孔加入1 mL 4%多聚甲醛固定30 min，吸出多聚甲醛，用PBS洗3遍以去除殘留多聚甲醛，再加入1 mL Gimesa工作液（Gimesa母液：Gimesa稀釋液=1∶9）染色25 min，用PBS洗3遍，加入1 mL PBS，在熒光倒置顯微鏡下觀察細(xì)胞克隆團(tuán)形態(tài)，拍照并計(jì)數(shù)克隆團(tuán)數(shù)量，計(jì)算3個(gè)代次cYS-MSCs克隆形成率的平均值：

克隆形成率（％）=克隆形成數(shù)/接種細(xì)胞數(shù)×100（2）

1.2.4 染色體核型分析

選擇細(xì)胞匯合度大于95%的cYS-MSCs，用0.25%胰蛋白酶消化，1 200 r·min^-1離心3 min，用1 mL 10%FBS的DMEM/F12完全培養(yǎng)基重懸細(xì)胞，將細(xì)胞懸液加入含2 mL 10% FBS的DMEM/F12完全培養(yǎng)基的培養(yǎng)皿中，放入細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，20 min后可在顯微鏡下觀察到大部分細(xì)胞圓而發(fā)亮，附著于培養(yǎng)皿底，此時(shí)添加秋水仙素10 μg·mL^-1，繼續(xù)放入細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h。用0.25%胰蛋白酶消化收集于15 mL離心管，1 200 r·min^-1離心8 min，用0.075 mol·L^-1氯化鉀溶液重懸細(xì)胞，37 ℃水浴，低滲處理30 min后加入1 mL固定液（冰醋酸：甲醇=1∶3），輕吹混勻。1 200 r·min^-1離心8 min，棄上清后加入5 mL固定液，輕吹混勻后室溫靜置30 min，重復(fù)1次，最后加入1 mL固定液重懸細(xì)胞，用一次性塑料滴管吸取細(xì)胞懸液在預(yù)冷的載玻片1.5 m上方均勻滴下，室溫干燥后，浸入含Gimesa工作液的染缸中染色25 min。水滴清洗多余染液，室溫風(fēng)干，置于顯微鏡下觀察染色體形態(tài)并拍照。

1.2.5 免疫熒光表型分析

將第5代細(xì)胞接種于6孔板中，在顯微鏡下觀察細(xì)胞匯合度達(dá)到70%時(shí)，PBS清洗細(xì)胞，4%多聚甲醛室溫固定30 min，PBS清洗，0.1% TritonX-100通透5 min，PBS清洗，山羊血清室溫封閉30 min，PBS洗3遍，一抗CD29、CD44、CD90、CD166、CD34和CD45，4 ℃孵育過夜，PBS清洗后，F(xiàn)ITC標(biāo)記的山羊抗兔IgG，室溫孵育1 h，最后采用DAPI進(jìn)行核染15 min，在倒置熒光顯微鏡下采用EZC1fFreeViewer軟件進(jìn)行可視化觀察并拍照。

1.2.6 RT-PCR檢測標(biāo)記基因

收集第5代細(xì)胞，用Trizol提取總RNA，用1%瓊脂糖凝膠電泳和紫外分光光度計(jì)測定RNA的質(zhì)量和濃度，使用PrimeScript^TMRT reagent Kit with gDNA Eraser（Perfect Real Time）逆轉(zhuǎn)錄1 μg總RNA，反應(yīng)體系及程序按照制造商的說明書執(zhí)行。使用2×Fast Pfu PCR Master Mix試劑盒于梯度PCR儀中進(jìn)行聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（RT-PCR），PCR反應(yīng)體系（20 μL）含有2×Fast Pfu PCR Master Mix 10 μL，0.8 μL cDNA，0.8 μL引物和8.4 μL ddH2O，反應(yīng)程序按照試劑說明書進(jìn)行。配制1%濃度的瓊脂糖凝膠，PCR產(chǎn)物在130 V，300 mA條件下電泳30 min，在瓊脂糖凝膠成像儀中進(jìn)行可視化分析。用于RT-PCR的GAPDH、CD29、CD44、CD73、CD90、CD166、CD34、CD45、LPL、PPAR-γ、ACAN、SOX9、osteopontin （OPN）和collagen type Ⅰ（COLⅠ）引物見表1。

1.2.7 cYS-MSCs多向分化能力鑒定" 在DMEM/F12中添加1.0 μmol·L^-1地塞米松、0.5 mmol·L^-1 3-異丁基-1-甲基黃嘌呤（IBMX）、9 mg·L^-1胰島素（INS）、180 μmol·L^-1吲哚美辛、10% FBS對cYS-MSCs進(jìn)行成脂誘導(dǎo)分化，cYS-MSCs接種于6孔板，當(dāng)長至100%匯合時(shí)，用成脂分化培養(yǎng)基替代完全培養(yǎng)基，3 d換1次液。在顯微鏡下觀察到cYS-MSCs出現(xiàn)脂滴時(shí)，使用油紅O試劑盒進(jìn)行染色，并對誘導(dǎo)后cYS-MSCs進(jìn)行RT-PCR檢測成脂特異性基因脂蛋白脂肪酶（LPL）和過氧化物酶體增殖物激活受體-γ（PPAR-γ）的表達(dá)情況。在DMEM/F12中添加50 mg·L^-1 L-脯氨酸、0.1 μmol·L^-1地塞米松、0.5 mol·L^-1丙酮酸 鈉、50 μg·L^-1 L-抗壞血酸、10 ng·L^-1 TGF-β3、10 μg·L^-1 TGF-1、10% FBS、1% ITS、1%青霉素-鏈霉素混合溶液對cYS-MSCs進(jìn)行成軟骨分化誘導(dǎo)，當(dāng)cYS-MSCs達(dá)到70%匯合時(shí)，用成軟骨誘導(dǎo)培養(yǎng)基替換完全培養(yǎng)基，3 d換1次液，在顯微鏡下觀察直至cYS-MSCs出現(xiàn)軟骨結(jié)節(jié)時(shí)，用阿利新蘭試劑盒染色，并對誘導(dǎo)后cYS-MSCs進(jìn)行RT-PCR檢測成軟骨特異性基因聚蛋白聚糖（ACAN）和性別決定區(qū)Y框蛋白9（SOX9）的表達(dá)情況。在DMEM/F12中添加0.1 μmol·L^-1地塞米松、10 nmol·L^-1 β-甘油磷酸鈉、50 mg·L^-1 L-抗壞血酸、15% FBS、1%青霉素-鏈霉素混合溶液對cYS-MSCs進(jìn)行成骨分化誘導(dǎo)，當(dāng)cYS-MSCs達(dá)到70%匯合時(shí)，用成骨誘導(dǎo)培養(yǎng)基替換完全培養(yǎng)基，3 d換1次液，在顯微鏡下觀察到鈣沉積或鈣結(jié)節(jié)，用茜素紅染液進(jìn)行染色，并對誘導(dǎo)后cYS-MSCs進(jìn)行RT-PCR檢測成骨特異性基因骨橋蛋白（OPN）和Ⅰ型膠原蛋白（COLⅠ）的表達(dá)情況。

1.3 數(shù)據(jù)處理

本研究對cYS-MSCs的生長曲線、群體倍增時(shí)間以及克隆形成率進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，采用SPSS進(jìn)行單因素方差分析檢測組內(nèi)和組間差異的顯著性，數(shù)據(jù)以“均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（mean±SD）”表示，用Graphpad Prism 7軟件對統(tǒng)計(jì)圖進(jìn)行分析。Plt;0.001表示差異極顯著。

2 結(jié) 果

2.1 cYS-MSCs的分離培養(yǎng)

采用組織貼壁法獲得細(xì)胞，3 d后細(xì)胞從組織塊周圍爬出，此時(shí)可能有多種細(xì)胞混合生長，換液后繼續(xù)培養(yǎng)，當(dāng)細(xì)胞匯合度達(dá)70%～80%進(jìn)行傳代，由于cYS-MSCs的塑料粘附力弱于其他貼壁細(xì)胞，通過控制胰蛋白酶的作用時(shí)間，對cYS-MSCs進(jìn)行純化。第3代細(xì)胞基本純化，均為長梭形，且呈漩渦狀或平行式生長。cYS-MSCs傳至第18代時(shí)，出現(xiàn)增殖減慢、空泡和黑色物質(zhì)等衰老跡象（圖1）。

2.2 熒光抗體檢測細(xì)胞表面抗原

為了確定目前培養(yǎng)的卵黃囊源性的新型細(xì)胞表型，通過免疫熒光檢測到間充質(zhì)干細(xì)胞的表面標(biāo)志物CD29、CD73、CD90和CD166呈陽性表達(dá)，而造血祖細(xì)胞標(biāo)志物CD34和泛白細(xì)胞標(biāo)志物CD45不表達(dá)，呈陰性（圖2）。

2.3 RT-PCR檢測細(xì)胞表面標(biāo)記基因

選擇純化后的第5代細(xì)胞進(jìn)行RT-PCR，結(jié)果顯示CD29、CD44、CD73、CD90和CD166均表達(dá)，而CD34和CD45不表達(dá)（圖3），由此確定體外分離獲得的細(xì)胞符合國際MSCs表型。

2.4 cYS-MSCs的體外增殖能力檢測

通過不同代次的生長曲線評估cYS-MSCs的增殖能力（圖4A）。第3代的增殖的能力極顯著高于第9代（P＜0.001）；第9代的增殖能力極顯著高于第15代的增殖能力（P＜0.001），大多數(shù)的cYS-"" MSCs在傳代第2天后從潛伏期進(jìn)入對數(shù)生長期，3個(gè)代次的cYS-MSCs均呈“S”型增長，包括潛伏期、對數(shù)生長期和平臺期3個(gè)時(shí)期（圖4A）。根據(jù)PDT計(jì)算公式可得第3代、第9代和第15代的PDT分別為39.78、40.72和45.02 h（圖4B）。

2.5 cYS-MSCs的克隆形成能力檢測

cYS-MSCs中單個(gè)細(xì)胞接種培養(yǎng)后，24 h部分細(xì)胞貼壁，貼壁細(xì)胞呈長梭形，10 d后觀察到cYS-MSCs呈放射狀向周圍擴(kuò)增，用Gimesa染色分析3個(gè)代次cYS-MSCs的集落形成情況。結(jié)果顯示，第3代、第9代和第15代的cYS-MSCs均有單細(xì)胞克隆團(tuán)形成，第3代cYS-MSCs的增殖能力極顯著高于第9代cYS-MSCs（P＜0.001），第9代cYS-MSCs的增殖能力極顯著高于第15代（P＜0.001）（圖5A）。根據(jù)克隆形成率計(jì)算出3個(gè)代次的克隆形成率分別為（42.67±3.79）%、（38.33±1.43）%和（19.00±2.48）%，結(jié)果表明隨著代次的增加cYS-MSCs的增殖能力逐漸減弱（圖5D）。

2.6 cYS-MSCs核型分析

為了檢驗(yàn)cYS-MSCs在傳代過程中是否會發(fā)生變異，對第3代和第15代的cYS-MSCs進(jìn)行了細(xì)胞遺傳學(xué)分析。母雞染色體核型為2 n=78，zw，公雞染色體核型為zz。第18代cYS-MSCs核型分析結(jié)果顯示，其染色體數(shù)目為2 n=78，包括一對性染色體zz，其中1～12號染色體著絲點(diǎn)相對容易分析，13～39號染色體均為粒狀，染色體未見異常，表明多次傳代后cYS-MSCs的染色體形態(tài)和數(shù)目維持正常，未發(fā)生變異等情況（圖6）。

2.7 cYS-MSCs多向分化能力鑒定

2.7.1 成脂誘導(dǎo)分化

cYS-MSCs在成脂分化培養(yǎng)基中培養(yǎng)，在顯微鏡下觀察，直到7 d后cYS-MSCs出現(xiàn)大量脂滴積累，呈具有強(qiáng)折光性的珠狀（圖7B），對形成脂滴的cYS-MSCs進(jìn)行油紅O染色，顯微鏡下觀察，可見細(xì)胞間脂滴被染為橙紅色（圖7C）。進(jìn)一步對誘導(dǎo)成功的cYS-MSCs進(jìn)行RT-PCR，結(jié)果顯示誘導(dǎo)分化后的cYS-MSCs表達(dá)LPL和PPAR-γ（圖7D），表明cYS-MSCs可經(jīng)過體外誘導(dǎo)分化為脂肪細(xì)胞。

2.7.2 成軟骨誘導(dǎo)分化

cYS-MSCs在成軟骨分化培養(yǎng)基中培養(yǎng)14 d后用阿利新藍(lán)試劑盒染色，顯微鏡下觀察誘導(dǎo)后的軟骨細(xì)胞呈藍(lán)色（圖8C），此外，RT-PCR結(jié)果顯示，成軟骨誘導(dǎo)分化后的cYS-MSCs表達(dá)ACAN和SOX9（圖8D），表明cYS-MSCs可在體外被誘導(dǎo)分化軟骨細(xì)胞。

2.7.3 成骨誘導(dǎo)分化

為了評估cYS-MSCs在體外向成骨細(xì)胞的分化潛能，其在成骨分化培養(yǎng)基中培養(yǎng)14 d后，在顯微鏡下觀察到多個(gè)明顯的礦化結(jié)節(jié)（圖9B），用茜素紅染液染色后，礦化結(jié)節(jié)呈紅"" 色（圖9C）。進(jìn)一步的RT-PCR結(jié)果顯示，成骨誘導(dǎo)分化后的cYS-MSCs表達(dá)OPN和COL Ⅰ（圖9D）。這些結(jié)果表明cYS-MSCs具有分化為成骨細(xì)胞的潛能。

3 討 論

國際間充質(zhì)和組織干細(xì)胞委員會提出定義MSCs的最低標(biāo)準(zhǔn)：第一，MSCs必須具有可塑性；第二，MSCs必須表達(dá)CD73和CD90，不表達(dá)CD45、CD34或CD14等；第三，必須在體外能誘導(dǎo)分化為成骨細(xì)胞、成軟骨細(xì)胞和脂肪細(xì)胞^［29-30］。cYS-MSCs分化為成脂、成軟骨和成骨細(xì)胞需要加入特定的分化誘導(dǎo)液。含3-異丁基-1-甲基黃嘌呤、胰島素、地塞米松和吲哚美辛的成脂分化誘導(dǎo)液具有將cYS-MSCs誘導(dǎo)為成脂細(xì)胞的能力，PPAR-γ是一種脂肪特異性轉(zhuǎn)錄因子，LPL是一種脂質(zhì)交換酶，主要參與脂類的合成和儲存，在本研究中PPAR-γ和LPL的表達(dá)水平在脂肪分化早期上調(diào)，進(jìn)一步證實(shí)了cYS-MSCs的成脂分化能力。油紅O是一種脂溶性偶氮染料，是很強(qiáng)的脂溶性試劑和脂肪染色劑，能特異性地使細(xì)胞或組織內(nèi)甘油三脂等中性脂質(zhì)等染色，細(xì)胞浸入油紅O染色液時(shí)，油紅O溶于細(xì)胞內(nèi)脂滴中，使其呈紅色或橙紅色。成軟骨細(xì)胞形成分化能力由阿利新蘭染色和標(biāo)記基因ACAN、SOX9來評估，SOX9是軟骨形成的早期標(biāo)志，是軟骨細(xì)胞特異性基因ECM的激活劑以及軟骨的主要結(jié)構(gòu)成分，cYS-MSCs在含有TGF-β3的軟骨分化誘導(dǎo)液中培養(yǎng)，首先收回突起，聚集成團(tuán)，團(tuán)中間的細(xì)胞再經(jīng)過分裂分化形成大而圓的成軟骨細(xì)胞，通過阿利新蘭染色，成軟骨細(xì)胞被染成藍(lán)色，后續(xù)的RT-PCR顯示誘導(dǎo)后的cYS-MSCs表達(dá)ACAN和SOX9，說明其具有分化為成軟骨細(xì)胞的能力。有研究建立了人類骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞成骨分化系統(tǒng)，將第2代或第2代的MSCs在含有地塞米松、L-抗壞血酸、β-甘油磷酸鈉的培養(yǎng)基中培養(yǎng)，雖然較高的初始接種密度不影響APase活性的細(xì)胞數(shù)量，但培養(yǎng)物中沉積了明顯更多的礦物質(zhì)，從而也暗示了經(jīng)歷成骨細(xì)胞譜系進(jìn)展的MSCs合成自分泌或旁分泌因子的作用^［31］，在本研究中，cYS-MSCs的成骨分化誘導(dǎo)過程中細(xì)胞迅速增殖。隨著誘導(dǎo)時(shí)間的延長，細(xì)胞逐漸出現(xiàn)礦鹽沉積，最終形成礦化結(jié)節(jié)，并表現(xiàn)出高遮光性。通過茜素紅S染色，礦化結(jié)節(jié)被染為橙紅色，說明cYS-MSCs具有分化為成骨細(xì)胞的潛力，可能適合骨再生醫(yī)學(xué)的應(yīng)用。本研究致力于對cYS-MSCs的成脂、成軟骨和成骨的多向分化能力鑒定，區(qū)別于前人對于cYS-MSCs的神細(xì)胞經(jīng)分化研究^［32］。此外，cYS-MSCs在經(jīng)過傳代培養(yǎng)后逐漸純化，cYS-MSCs呈長梭形，并以漩渦狀生長，符合MSCs表型，染色體隨著傳代次數(shù)的增加并未發(fā)生變異，與研究較成熟的骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞、臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞、脂肪間充質(zhì)干細(xì)胞等特性相似，與其他品種如白來航雞、羅曼鶴雞骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞特性相似^［33-34］。且MSCs低表達(dá)HLA-Ⅰ型抗原，不表達(dá)HLA-Ⅱ型抗原，具有免疫逃逸的能力，與其他干細(xì)胞相比，無醫(yī)學(xué)倫理爭議。

雞胚YS由內(nèi)胚層細(xì)胞組成，6胚齡后包圍整個(gè)卵黃，由卵黃囊蒂與雞胚連接，使?fàn)I養(yǎng)物質(zhì)通過膜上血管不斷吸入雞胚，隨著卵黃被吸收，YS在12～13胚齡之后易破，20日胚齡完全消失。YS具有重要的功能，包括產(chǎn)生和運(yùn)輸胚胎所需的蛋白質(zhì)，參與代謝物質(zhì)交換，促進(jìn)維生素，氨基酸和免疫球蛋白的轉(zhuǎn)移；參與第一批血細(xì)胞的形成等^［35-37］。有研究表明YS是MSCs的來源之一，cYS-MSCs已經(jīng)從人體中分離出來，這些細(xì)胞具有成纖維細(xì)胞樣形態(tài)，就其在中胚層的分化潛力而言，可以分化為脂肪細(xì)胞、軟骨細(xì)胞和成骨細(xì)胞^［38-39］。有研究采用酶消化法分離出雞胚cYS-MSCs，并成功進(jìn)行了神經(jīng)誘導(dǎo)分化，證明了cYS-MSCs的可塑性及其在神經(jīng)細(xì)胞治療中的潛能^［40］。相比于其他研究，本研究采用組織貼壁法分離cYS-MSCs，相對于胰蛋白酶消化法，此方法操作簡單、步驟少，試驗(yàn)處理時(shí)間短，不使用胰蛋白酶或膠原酶，分離成本較低；按照國際MSCs鑒定標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行成脂、成軟骨、成骨誘導(dǎo)來檢測cYS-MSCs多向誘導(dǎo)分化能力。雞胚成本低，來源廣泛，是經(jīng)典生物學(xué)熱門模型，成功分離洛島紅雞雞胚的cYS-MSCs作為種質(zhì)資源細(xì)胞，可為洛島紅雞進(jìn)行種質(zhì)資源保存、科學(xué)研究及臨床疾病治療提供物質(zhì)基礎(chǔ)。

4 結(jié) 論

本研究成功獲得了洛島紅雞雞胚cYS-MSCs，并在體外培養(yǎng)傳代，表現(xiàn)與其他MSCs相似的特性，具有強(qiáng)大的自我更新和復(fù)制能力，表達(dá)MSCs表面標(biāo)記基因CD29、CD44、CD73、CD90和CD166，不表達(dá)造血祖細(xì)胞標(biāo)志物CD34和泛白細(xì)胞標(biāo)志物CD45，可以向成脂、成軟骨、成骨細(xì)胞分化，具有多向分化潛能。cYS-MSCs通過分泌細(xì)胞因子和生長因子，促進(jìn)受損組織的愈合和再生，為禽類的創(chuàng)傷愈合和組織再生提供新的治療手段；可以用于建立疾病模型，以研究多種疾病的發(fā)病機(jī)制和治療方法；還可用于組織工程和細(xì)胞治療，在再生醫(yī)學(xué)或細(xì)胞移植方面有一定的潛能。cYS-MSCs可以用于保存洛島紅雞的遺傳資源，通過細(xì)胞培養(yǎng)和克隆技術(shù)可以將具有重要經(jīng)濟(jì)和生態(tài)價(jià)值的基因組信息保存下來，為未來的育種提供基礎(chǔ)；通過對cYS-MSCs的研究，可以建立基于間充質(zhì)干細(xì)胞的基因庫，這種基因庫不僅可以用于保護(hù)遺傳多樣性，還可以為基因工程和轉(zhuǎn)基因技術(shù)的應(yīng)用提供支持；可以與輔助繁殖技術(shù)相結(jié)合，這對于遺傳資源的保護(hù)和繁育具有重要意義。但對于cYS-MSCs的機(jī)制和實(shí)際應(yīng)用還需進(jìn)行更深入的研究。

參考文獻(xiàn)（References）：

［1］ WONG E A，UNI Z.Centennial Review：the chicken yolk sac is a multifunctional organ［J］.Poult Sci，2021，100（3）：100821.

［2］ MIAO X M，WU T，PAN H Y，et al.Integrative analysis of the ovarian metabolome and transcriptome of the Yaoshan chicken and its improved hybrids［J］.Front Genet，2024，15：1416283.

［3］ STARCK J M，STEWART J R，BLACKBURN D G.Phylogeny and evolutionary history of the amniote egg［J］.J Morphol，2021， 282（7）：1080-1122.

［4］ SHIBATA M，IWASAWA A，YAYOTA M.Gluconeogenesis in the Yolk sac membrane：enzyme activity，gene expression，and metabolites during layer chicken development［J］.J Poult Sci，2023，60（2）：2023020.

［5］ ORNOY A，MILLER R K.Yolk sac development，function and role in rodent pregnancy［J］.Birth Defects Res，2023，115（14）：1243-1254.

［6］ PANDE O，MAKARAM N，SWAMINATHAN R.Effect of extra-abdominal vein varix on the stress distribution in umbilical cord：a simulation study［J］.Annu Int Conf IEEE Eng Med Biol Soc，2023，2023：1-4.

［7］ ARUTYUNYAN I，ELCHANINOV A，MAKAROV A，et al.Umbilical cord as prospective source for mesenchymal stem cell-based therapy［J］.Stem Cells Int，2016，2016：6901286.

［8］ FARKHAD N K，SEDAGHAT A，REIHANI H，et al.Specific clinical and immunological changes following mesenchymal stem cell transplantation in COVID-19-induced acute respiratory distress syndrome patients：a phase-I clinical trial［J］.Iran J Allergy Asthma Immunol，2022，21（6）：687-703.

［9］ LEE J H，PARK J，LEE J W.Therapeutic use of mesenchymal stem cell-derived extracellular vesicles in acute lung injury［J］. Transfusion，2019，59（S1）：876-883.

［10］ SHI Y F，HU G Z，SU J J，et al.Mesenchymal stem cells：a new strategy for immunosuppression and tissue repair［J］.Cell Res，2010， 20（5）：510-518.

［11］ MAR N-LLERA J C，GARC A-GARC A D，GARAY-PACHECO E，et al.Commitment of human mesenchymal stromal cells to skeletal lineages is independent of their morphogenetic capacity［J］.World J Stem Cells，2023，15（7）：701-712.

［12］ BIANCO P，CAO X，F(xiàn)RENETTE P S，et al.The meaning，the sense and the significance：translating the science of mesenchymal stem cells into medicine［J］.Nat Med，2013，19（1）：35-42.

［13］ DEWHURST-TRIGG R，HOPKINSON J，RICHARDSON S，et al.Mesenchymal stromal cells and their secretory products reduce the inflammatory crosstalk between islets and endothelial cells［J］.Endocrine，2024，87：94-105.

［14］ FERNANDES K J L，MCKENZIE I A，MILL P，et al.A dermal niche for multipotent adult skin-derived precursor cells［J］.Nat Cell Biol，2004，6（11）：1082-1093.

［15］ JIANG Y H，JAHAGIRDAR B N，REINHARDT R L，et al. RETRACTED ARTICLE：pluripotency of mesenchymal stem cells derived from adult marrow［J］.Nature，2002，418（6893）：41-49.

［16］ MAHMOUD N N，HAMAD S，SHRAIM S.Inflammation-modulating biomedical interventions for diabetic wound healing：an overview of preclinical and clinical studies［J］.ACS Omega，2024，9（45）：44860-44875.

［17］ SCHWARTZ R E，REYES M，KOODIE L，et al.Multipotent adult progenitor cells from bone marrow differentiate into functional hepatocyte-like cells［J］.J Clin Invest，2002，109（10）：1291-1302.

［18］ NASKOU M C，COCHRAN A，DARZENTA N，et al.The characteristics and function of small extracellular vesicles derived from human bone marrow and umbilical cord mesenchymal stromal cells are influenced by cell culture conditions［J］.Stem Cells Dev，2024，33（5-6）：117-127.

［19］ SHAN Y L，ZHANG M Y，TAO E X，et al.Pharmacokinetic characteristics of mesenchymal stem cells in translational challenges［J］.Sig Transduct Target Ther，2024，9（1）：242.

［20］ SCHWARTZ R E，REYES M，KOODIE L，et al.Multipotent adult progenitor cells from bone marrow differentiate into functional hepatocyte-like cells［J］.J Clin Invest，2002，109（10）：1291-1302.

［21］ JUNG H，JUNG Y，SEO J，et al.Roles of extracellular vesicles from mesenchymal stem cells in regeneration［J］.Mol Cells，2024，47（12）：100151.

［22］ KLAYMOOK S，TIRAWANCHAI N，WICHITWIENGRAT S，et al.MSC secretome from amniotic fluid halts IL-1β and TNF-α inflammation via the ERK/MAPK pathway，promoting cartilage regeneration in OA in vitro［J］.J Stem Cells Regen Med，2024， 20（1）：3-13.

［23］ KINNAIRD T，STABILE E，BURNETT M S，et al.Local delivery of marrow-derived stromal cells augments collateral perfusion through paracrine mechanisms［J］.Circulation，2004，109（12）：1543-1549.

［24］ SIONOV R V，AHDUT-HACOHEN R.A supportive role of mesenchymal stem cells on insulin-producing langerhans islets with a specific emphasis on the secretome［J］.Biomedicines，2023，11（9）：2558.

［25］ ABDELHAKEEM F，MADKOUR F A.Descriptive embryological insights of the colorectum of quail embryos with concern to its functional morphology［J］.BMC Vet Res，2024，20（1）：508.

［26］ NIU H X，SONG H N，GUAN Y H，et al.Chicken bone marrow mesenchymal stem cells improve lung and distal organ injury［J］.Sci Rep，2021，11（1）：17937.

［27］ DOMINICI M，LE BLANC K，MUELLER I，et al.Minimal criteria for defining multipotent mesenchymal stromal cells.The International Society for Cellular Therapy position statement［J］.Cytotherapy，2006，8（4）：315-317.

［28］ CHEN Y，SHAO J Z，XIANG L X，et al.Mesenchymal stem cells：a promising candidate in regenerative medicine［J］.Int J Biochem Cell Biol，2008，40（5）：815-820.

［29］ JAISWAL N，HAYNESWORTH S E，CAPLAN A I，et al.Osteogenic differentiation of purified，culture-expanded human mesenchymal stem cells in vitro［J］.J Cell Biochem，1997，64（2）：295-312.

［30］ 紀(jì)洪兵，宋哈楠，趙詩宇，等.牛羊水間充質(zhì)干細(xì)胞對小鼠酒精性肝病的影響［J］.畜牧獸醫(yī)學(xué)報(bào)，2021， 52（10）：2905-2914.

JI H B，SONG H N，ZHAO S Y，et al.The effect of bovine amniotic fluid mesenchymal stem cells on alcoholic liver disease in mice［J］.Acta Veterinaria et Zootechnica Sinica，2021，52（10）：2905-2914.（in Chinese）

［31］ BRAMBELL F W R.The passive immunity of the young mammal［J］.Biol Rev，1958，33（4）：488-531.

［32］ GAO Y H，BAI C Y，WANG K F，et al.All-trans retinoic acid promotes nerve cell differentiation of yolk sac-derived mesenchymal stem cells［J］.Appl Biochem Biotechnol，2014，174（2）：682-692.

［33］ LV H J，WANG T，ZHAI S K，et al.Dynamic transcriptome changes during osteogenic differentiation of bone marrow-derived mesenchymal stem cells isolated from chicken［J］.Front Cell Dev Biol，2022，10：940248.

［34］ 李雙星，樸豐源，戚 媛，等.羅曼鶴雞骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞的分離培養(yǎng)和鑒定［J］.山東醫(yī)藥，2014，54（11）：1-4.

LI S X，PIAO F Y，QI Y，et al.Isolation，cultivation and identification of chicken bone marrow mesenchymal stem cells［J］. Shandong Medical Journal，2014，54（11）：1-4.（in Chinese）

［35］ WANG X Y，LAN Y，HE W Y，et al.Identification of mesenchymal stem cells in aorta-gonad-mesonephros and yolk sac of human embryos［J］.Blood，2008，111（4）：2436-2443.

［36］ BYDLOWSKI S P，DEBES A A，MASELLI L M F，et al.Características boil gicas das c lulas-tronco mesenquimais［J］.Rev Bras Hematol Hemoter，2009，31（S1）：25-35.

［37］ LI C C，LIU Y C，DENG M X，et al.Comparison of the therapeutic effects of mesenchymal stem cells derived from human dental pulp （DP），adipose tissue （AD），placental amniotic membrane （PM），and umbilical cord （UC） on postmenopausal osteoporosis［J］.Front Pharmacol，2024，15：1349199.

［38］ DEREN J J，PADYKULA H A，WILSON T H.Development of structure and function in the mammalian yolk sac：III.The development of amino acid transport by rabbit yolk sac［J］.Dev Biol，1966， 13（3）：370-384.

［39］ ANKRUM J A，ONG J F，KARP J M.Mesenchymal stem cells：immune evasive，not immune privileged［J］.Nat Biotechnol，2014，32（3）：252-260.

［40］ GAO Y H，BAI C Y，WANG K F，et al.All-trans retinoic acid promotes nerve cell differentiation of yolk sac-derived mesenchymal stem cells［J］.Appl Biochem Biotechnol，2014，174（2）：682-692.

（編輯 郭云雁）