表達牛乳鐵蛋白肽的羅伊氏乳桿菌分泌型信號肽的篩選及鑒定

摘 要： 本研究旨在構建一株高效表達牛乳鐵蛋白肽的重組羅伊氏乳桿菌，通過篩選不同信號肽的方式提高牛乳鐵蛋白肽的分泌表達水平，提高重組菌株的應用效率。對實驗室分離的一株羅伊氏乳桿菌進行全基因組測序，篩選分泌蛋白的信號肽基因，構建表達牛乳鐵蛋白肽（LFCA）的重組菌株，通過Western blot、ELISA、激光共聚焦等技術分析和比較信號肽分泌LFCA的效果，對重組菌分泌的LFCA對金黃色葡萄球菌增殖抑制作用及其半數最低抑菌濃度進行檢測。結果顯示，A2、A3、A4和A8信號肽能夠表達LFCA，其中A3和A8能夠使LFCA分泌到培養(yǎng)上清中，且A3信號肽使LFCA的分泌表達水平提高了近2倍，對宿主菌株的生長性能無顯著影響，重組菌株分泌的LFCA對金黃色葡萄球菌的半數最低抑菌濃度為97.50 μg·mL^－1。本研究成功篩選出能夠高效分泌牛乳鐵蛋白肽的信號肽，重組菌株的抑菌效率得到顯著提高。

關鍵詞： 牛乳鐵蛋白肽；羅伊氏乳桿菌；重組蛋白分泌表達信號肽；抑菌活性

中圖分類號：

S852.69"""" 文獻標志碼：A""" 文章編號： 0366-6964（2025）03-1431-10

收稿日期：2024-01-03

基金項目：國家重點研發(fā)計劃項目（2021YFD1800305）

作者簡介：趙文悅（1998-），女，黑龍江哈爾濱人，碩士生，主要從事動物微生物學與免疫學研究，E-mail： zwy1514@outlook.com

*通信作者：唐麗杰，主要從事動物微生物學與免疫學研究，E-mail：tanglijie@163.com；王曉娜，主要從事動物微生物學與免疫學研究，E-mail：xiaonawang0319@163.com

Screening and Identification of Secretory Signal Peptide of Lactobacillus reuteri Expressing Lactoferrin Peptide

ZHAO" Wenyue， YANG" Jing， SHAO" Yilan， LI" Jiaxuan， JIANG" Yanping， CUI" Wen， WANG" Xiaona^*， TANG" Lijie^*

（College of Veterinary Medicine， Northeast Agricultural University， Harbin 150030，" China）

Abstract：" The aim of this study was to construct a recombinant Lactobacillus reuteri expressing bovine lactoferrin peptides， and to enhance the secretion and expression of lactoferrin peptides by screening different signal peptides， thereby improving the application efficiency of the recombinant strains. A strain of Lactobacillus reuteri isolated in the laboratory was subjected to whole genome sequencing， the signal peptide gene for secreted proteins was screened， and recombinant strains expressing bovine lactoferrin peptides（LFCA）were constructed. The effect of LFCA secreted by the signal peptide was analyzed and compared by Western blot， ELISA， and laser confocal techniques， and the inhibition of proliferative activity of Staphylococcus aureus by LFCA secreted by the recombinant bacteria as well as the half-minimum inhibitory concentration were identified. The results showed that A2， A3， A4 and A8 signal peptides were able to express LFCA， of which A3 and A8 were able to successfully make them secreted into the culture supernatant， and A3 signal peptide increased the secretion and expression level of bovine lactoferrin peptides nearly 2-fold， which did not have significant effect on the growth performance of the strains， and the half-minimum inhibitory concentration of LFCA secreted by the strains was 97.50 μg·mL^-1 against Staphylococcus aureus. This study successfully screened the signal peptide which could secrete lactoferrin peptide efficiently， and the bacteriostatic and antiviral efficiency of the recombinant strain was significantly improved.

Keywords： bovine lactoferrin; Lactobacillus reuteri; the recombinant protein secreted signal peptide; antibacterial activity

*Corresponding authors：" TANG Lijie， E-mail： tanglijie@163.com; WANG Xiaona， E-mail： xiaonawang0319@163.com

牛乳鐵蛋白肽是由牛乳鐵蛋白經胃蛋白酶水解后產生的，具有抗細菌^［1-2］、抗真菌^［3］、抗病毒^［4］和抗腫瘤活性^［5-6］的小肽，對機體免疫功能具有調節(jié)作用^［7］。目前牛乳鐵蛋白肽已經得到了廣泛的研究，是一種極具潛力的抗生素替代物，且已在實踐中得到了一定程度的應用^［8］。牛乳鐵蛋白的LFampin和Lfcin兩條肽段具有較高的抗菌活性^［9-10］，二者組成的嵌合肽（以下稱LFCA）可在多種系統(tǒng)進行表達，且均具有較強的抗菌活性^［11-14］。由于牛乳鐵蛋白肽對乳酸菌無抑制作用，且乳酸菌本身具有益生功能，因此利用乳酸菌進行表達具有更大的應用潛力。羅伊氏乳桿菌（Lactobacillus reuteri， L. reuteri）是脊椎動物腸道內一種常見的益生菌^［15］，具有耐酸、耐膽鹽和極強的定殖能力，對腸道菌群穩(wěn)態(tài)具有重要作用^［16-17］，也可有效抑制生物體受刺激時產生的炎癥反應^［18-20］。因此，利用羅伊氏乳桿菌分泌表達牛乳鐵蛋白肽能夠將二者的特性相結合，有效增強其抑菌能力和其他益生特性。

高效分泌表達牛乳鐵蛋白肽的重組菌株在生產應用中具有重要作用。有研究表明，細菌分泌重組蛋白的產量不僅與表達水平有關，還與易位效率有關，而信號肽是蛋白質易位的一個重要影響因素。信號肽是分泌蛋白N端的前25～30個氨基酸，在蛋白質的表達以及分泌過程中都發(fā)揮一定作用^［21-23］。原核生物蛋白的分泌大多依賴信號肽的功能^［24］，高效的信號肽能夠有效提高蛋白分泌到胞外的效率，但是信號肽對不同蛋白的分泌效率與二者翻譯后形成的結構相關，目前仍沒有更高效的方式預測信號肽對特定蛋白的分泌效率^［25］。為了提高牛乳鐵蛋白肽的表達量，本研究對課題組前期構建的重組羅伊氏乳桿菌LRco21/pPG-LFCA表達載體的副干酪乳桿菌肽聚糖水解酶信號肽（SP）進行替換和篩選鑒定，以期獲得能夠增強牛乳鐵蛋白肽分泌效率的信號肽，提高重組菌株在生產實踐中的應用效率。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

1.1.1 載體、菌（毒）株及主要試劑

S.aureus ATCC 43300、L. reuteri co21菌株、pPG-LFCA質粒由東北農業(yè)大學獸醫(yī)微生物與免疫學實驗室保存；限制性核酸內切酶、DNA Marker及蛋白Marker等購自寶生物工程（大連）有限公司；小量質粒DNA提取試劑盒購自天根生化科技（北京）有限公司；溶菌酶、EVANS BLUE等購自北京索萊寶生物公司；抗Myc標簽小鼠單克隆抗體購自Abmart醫(yī)藥科技（上海）有限公司；HRP標記的山羊抗鼠IgG及FITC標記的山羊抗鼠IgG購自北京中杉金橋生物技術有限公司；MonAmp^TM Universal ChemoHS Specificity Plus qPCR Mix及MonScript^TM RTIII All-in-One Mix with dsDNase購自莫納（蘇州）生物科技有限公司；總RNA極速抽提試劑盒購自上海飛捷生物技術有限公司。

1.1.2 主要設備

紫外分光光度計（Thermo Fisher Scientific）；凝膠成像系統(tǒng)（ChampGel^TM6000）；轉膜儀（Bio-Rad）；超聲波細胞粉碎機（寧波新芝生物科技股份有限公司）；酶標儀（BERTHOLD TECHNOLOGIES Centro XS 3 LB 960）。

1.1.3 基因序列獲取

根據信號肽疏水性等特性選擇了10條信號肽，部分信號肽序列參考L. reuteri ATCC 55730菌株^［26-27］以及L. brevis ATCC 367菌株。L. reuteri co21菌株信號肽序列來自全基因組測序，測序結果由吉林省庫美生物科技有限公司提供，具體序列見表1。

1.2 試驗方法

1.2.1 信號肽序列的獲取及表達載體的構建

帶有不同信號肽的LFCA序列均由上海擎科生物科技有限公司合成，利用ApaI和SpeI限制性核酸內切酶對合成的質粒進行雙酶切，37℃作用1 h。酶切產物經1.2％瓊脂糖凝膠電泳后利用凝膠回收試劑盒進行純化。所有獲得的目的片段均通過T4連接酶與回收的pPG載體連接，轉化TG1大腸桿菌感受態(tài)細胞，提取質粒進行酶切鑒定，將陽性質粒送吉林省庫美生物科技有限公司進行測序鑒定，利用DNA MAN軟件對序列進行比對分析。將測序正確的陽性質粒電轉化進入L. reuteri co21感受態(tài)細胞，電轉化條件為2 200 V。將不含LFCA的pPG空載體以同樣條件電轉入L. reuteri co21感受態(tài)細胞構建對照菌LRcon。

1.2.2 牛乳鐵蛋白肽表達的鑒定

1.2.2.1 Western blot驗證蛋白表達：

將重組菌株在MRS培養(yǎng)基中培養(yǎng)18 h，離心分離培養(yǎng)上清和菌體沉淀。菌體沉淀加入溶菌酶37℃作用1 h，離心棄去溶菌酶，用pH=7.2～7.4的磷酸緩沖鹽溶液（PBS）重懸菌體細胞，超聲處理。超聲程序為300 W，30 min，工作4 s，關閉4 s。培養(yǎng)上清中的蛋白經TCA沉淀，用少量的PBS重懸，將培養(yǎng)上清濃縮200倍。將轉入pPG空載體的LRcon和帶有肽聚糖水解酶信號肽的LRco21/pPG-LFCA作為對照，通過18%的TRICINE-SDS-PAGE凝膠電泳進行表達產物的分離，以Myc標簽抗體（1∶5 000）作為一抗，HRP標記的山羊抗鼠IgG（1∶5 000）作為二抗進行Western blot檢測，ECL顯色檢測產物的表達。分別利用10和4.6 ku蛋白Marker作為對照對結果進行灰度分析。

1.2.2.2 激光共聚焦顯微鏡觀察牛乳鐵蛋白肽表達及其定位：

將表達牛乳鐵蛋白肽的重組菌株均勻涂布在載玻片上，4%多聚甲醛室溫固定30 min，去離子水沖洗涂片。0.1% Trition室溫作用7 min，沖洗涂片；2% BSA室溫封閉30 min；沖洗涂片；Myc標簽抗體（1∶2 000）37 ℃孵育1 h 30 min；二抗為0.01% EVANS BLUE染料稀釋的FITC標簽的山羊抗鼠IgG（1∶100），37 ℃孵育1 h；沖洗干凈涂片后利用抗熒光淬滅劑封片；激光共聚焦×100油鏡下觀察。

1.2.3 重組菌株的生長活性測定

將能夠分泌表達牛乳鐵蛋白肽的重組菌株按照1∶100的比例接種于加有氯霉素抗性的MRS培養(yǎng)基，37 ℃靜置培養(yǎng)，利用分光光度計每2 h測定OD600 nm值，繪制生長曲線。

1.2.4 牛乳鐵蛋白肽分泌表達量的檢測

利用帶有Myc標簽的牛乳鐵蛋白肽標準品1 000 ng·孔^－1包被ELISA微量反應板，4℃ 包被過夜，含有0.5% 吐溫20的 PBS（PBST）洗滌3次，5% 脫脂乳37℃封閉2 h，PBST洗滌3次，之后加入1∶10 000稀釋的Myc標簽抗體與倍比稀釋的牛乳鐵蛋白肽，37℃作用1 h，二抗為1∶5 000稀釋的HRP標記的山羊抗鼠IgG，37 ℃作用30 min，PBST洗滌3次，TMB顯色，ELISA終止液終止反應，酶標儀測定OD450 nm值。繪制標準曲線，利用同樣方法對培養(yǎng)上清中的牛乳鐵蛋白肽進行ELISA定量檢測。

1.2.5 不同重組菌株培養(yǎng)上清對金黃色葡萄球菌的抑菌能力的比較

利用牛津杯法檢測重組菌培養(yǎng)上清的抑菌能力，將S. aureus ATCC 43300培養(yǎng)至OD600 nm為0.6，利用傾注平板法在固體培養(yǎng)基中進行培養(yǎng)，牛津杯打孔，加入重組菌培養(yǎng)上清200 μL·孔^－1，37℃培養(yǎng)8～12 h，利用游標卡尺測量抑菌圈直徑。

1.2.6 牛乳鐵蛋白肽對金黃色葡萄球菌的半數最低抑菌濃度測定

分利用S. aureus ATCC 43300作為測試菌株，將菌液培養(yǎng)至OD600 nm為0.2。先將LRco21/pPG-A3-LFCA重組菌培養(yǎng)上清利用飽和硫酸銨沉淀法濃縮至200倍，4℃在透析袋中利用PBS透析過夜，之后將濃度倍比稀釋至9.84、19.68、39.36、78.72、157.44 μg·mL^－1。在96孔板中每孔加入50 μL測試菌，分別依次加入50 μL不同濃縮倍數的重組菌培養(yǎng)上清，對照孔加入50 μL培養(yǎng)基作為空對照，每個濃度做3個平行，37 ℃，200 r·min^－1振蕩培養(yǎng)4 h后，將每孔菌液取出并稀釋1×105倍，吸取100 μL涂布LB固體瓊脂平板進行活菌計數，按照公式：抑制率=［1-（CFU樣品/CFU對照）］×100%，計算不同濃度LFCA的抑菌率，并通過軟件計算半數最低抑菌濃度。

2 結 果

2.1 信號肽序列的獲取及牛乳鐵蛋白肽表達載體的構建

人工合成的帶有各信號肽基因的質粒pUC57-SPs-LFCA（SPs代表A1～A10）經ApaI和SpeI雙酶切，1.2%瓊脂糖凝膠電泳切膠回收約400 bp的目的片段。回收片段連接到pPG載體中，重組質粒經ApaI單酶切獲得約5 000 bp的片段，ApaI和SpeI雙酶切獲得大小約4 500 bp和400 bp的兩條片段，酶切結果與與其相符，測序結果正確，證實A1～A10信號肽序列均成功連入表達載體（圖1）。

2.2 不同信號肽重組菌株表達牛乳鐵蛋白肽的鑒定

2.2.1 Western blot檢測牛乳鐵蛋白肽的表達

重組菌株的菌體沉淀和培養(yǎng)上清處理后，利用Myc標簽抗體進行Western blot檢測。如圖2所示，菌體沉淀在10～15 ku之間有特異性條帶，培養(yǎng)上清在7 ku附近有特異性條帶，與預計的相對分子質量大小相符。連有A2、A3、A4、A8信號肽的重組質粒能夠順利在LRco21菌株中表達牛乳鐵蛋白肽，但僅有A3和A8信號肽能夠順利將牛乳鐵蛋白肽分泌到培養(yǎng)上清中，其余信號肽未能表達。對結果進行灰度分析，表達A2和A4信號肽的重組菌菌體沉淀中牛乳鐵蛋白肽含量高于其他重組菌40%左右，A3和A8信號肽的重組菌則與LRco21/pPG-LFCA的含量無明顯差異。對培養(yǎng)上清的結果進行灰度分析，與原肽聚糖水解酶信號肽相比，表達A3和A8信號肽的重組菌培養(yǎng)上清中牛乳鐵蛋白肽的含量分別提高了117%和58%。結果表明，更換A3和A8信號肽可以使LFCA的整體表達量提高1～2倍，后續(xù)將對能夠分泌表達LFCA的LRco21/pPG-A3-LFCA和LRco21/pPG-A8-LFCA兩株重組菌進行進一步的試驗。

2.2.2 激光共聚焦顯微鏡檢測重組菌牛乳鐵蛋白肽的表達

利用激光共聚焦顯微鏡觀察重組菌中牛乳鐵蛋白肽的表達，如圖3所示，LRcon空菌對照組無綠色熒光，五株重組菌LRco21/pPG-A2-""" LFCA、LRco21/pPG-A3-LFCA、LRco21/pPG-A4-LFCA、LRco21/pPG-A8-LFCA、LRco21/pPG-LFCA均能檢測到綠色熒光，表明牛乳鐵蛋白肽在菌體內獲得表達。

2.3 分泌表達牛乳鐵蛋白肽的重組菌株的生長曲線測定

以LRcon作為對照，測定能夠分泌表達牛乳鐵蛋白肽的重組菌20 h內的OD600 nm值，發(fā)現各重組菌之間沒有顯著差異（圖4）。結果表明更換不同的信號肽對菌株的生長無明顯影響。

2.4 重組菌分泌表達牛乳鐵蛋白肽的定量檢測

將LRco21/pPG-A3-LFCA，LRco21/pPG-A8-LFCA，pPG-LFCA/LRco21以及LRcon的培養(yǎng)上清濃縮5倍，以LRcon的培養(yǎng)上清作為對照，利用ELISA方法測定其中牛乳鐵蛋白肽的含量。如圖5所示，發(fā)現LRco21/pPG-A3-LFCA上清牛乳鐵蛋白肽含量為1.23 μg·mL^－1，LRco21/pPG-A8-LFCA上清含量為0.91 μg·mL^－1，pPG-LFCA/LRco21含量為0.69 μg·mL^－1，與原信號肽相比A3信號肽使牛乳鐵蛋白肽的分泌量提高了近2倍。

2.5 不同信號肽重組菌株培養(yǎng)上清對金黃色葡萄球菌抑菌效果的比較

將OD600 nm值相同的重組菌培養(yǎng)上清濃縮100倍，調pH至7.0，加入事先打好的孔中，37 ℃培養(yǎng)8～12 h后測量抑菌直徑。如圖6所示，利用A3信號肽分泌牛乳鐵蛋白肽的重組菌培養(yǎng)上清抑菌效果明顯高于原信號肽的菌株，可見更換信號肽后分泌的牛乳鐵蛋白肽由于表達量有增加而提高了抑菌率。

2.6 牛乳鐵蛋白肽對金黃色葡萄球菌的半數最低抑菌濃度

進一步驗證LRco21/pPG-A3-LFCA分泌出的LFCA對金黃色葡萄球菌的半數最低抑菌濃度，將重組菌培養(yǎng)上清進行濃縮，梯度稀釋至不同濃度，與指示菌混勻后培養(yǎng)，進行活菌計數，按照抑制率=［1-（CFU 樣品/CFU 對照）］×100%的公式計算不同濃度LFCA的抑菌率。如圖7，在濃度達到78.72 μg·mL^－1時LFCA的抑菌率提高至40.7%，在濃度達到157.44 μg·mL^－1時抑菌率達到63.9%，利用軟件對數據進行分析，結果顯示其半數最低抑菌濃度為97.50 μg·mL^－1。

3 討 論

牛乳鐵蛋白肽是一種有極大潛力的抗生素替代物，在各個領域都有所應用。由于化學合成成本高昂，因此大多圍繞基因工程的方法對牛乳鐵蛋白肽的生產進行研究。羅伊氏乳桿菌作為益生菌的一種，本身具有一定的抑制致病菌的能力，并且能夠調節(jié)免疫功能。已有研究表明，羅伊氏乳桿菌對鼠傷寒沙門菌致病作用有影響^［28］。

構建能夠分泌表達牛乳鐵蛋白肽的羅伊氏乳桿菌能夠在一定程度上提高菌株對致病菌的抑菌能力^［29］以及對病毒感染的保護作用^［30］，從而提高在生產應用上的價值。大量研究表明，細菌對異源信號肽的識別能力不強，也有研究提出同源信號肽對異源蛋白的表達具有一定優(yōu)勢^［31］。Liang 等^［32］在2013年成功利用內源信號肽在畢赤酵母中高效分泌表達重組蛋白，并且證明了內源性信號肽比畢赤酵母表達系統(tǒng)常用的a因子信號肽分泌表達的效率更高。在此之前，也有研究對同源和異源信號肽在植物乳桿菌中分泌異源蛋白的能力進行比較，結果證明同源信號肽所分泌的報告蛋白具有更高的生物活性^［31］。

本實驗室前期構建的利用副干酪乳桿菌信號肽分泌表達LFCA的pPG-LFCA/LRco21在培養(yǎng)上清中LFCA的分泌量僅有0.69 μg·mL^－1，其分泌水平較低可能是由于信號肽的同源性較差且結構與LFCA不夠匹配導致的。因此，本研究根據疏水性等理化特性選擇了10條信號肽，其中包括羅伊氏乳桿菌內源性信號肽以及本實驗室曾使用過的短乳桿菌的信號肽，對他們分泌LFCA的能力進行了比較。其中A2、A3、A4、A8可以在胞內表達，僅A3和A8可以成功分泌牛乳鐵蛋白肽到培養(yǎng)上清中，信號肽的分泌效率以及蛋白是否能夠表達與蛋白序列密切相關，其他重組菌未能表達可能是這些信號肽的序列不適用于LFCA序列導致的。這4條可以成功表達LFCA的信號肽均為L. reuteri ATCC 55730菌株序列，其中A2、A3、A4在L. reuteri co21菌株中有相似信號肽序列，A8在L. reuteri co21菌株中無相似序列存在。羅伊氏乳桿菌內源性的A3和A8信號肽能夠以較高水平分泌牛乳鐵蛋白肽，且遠高于副干酪乳桿菌的肽聚糖水解酶信號肽的分泌水平。這些結果顯示，同源信號肽也無法保證能夠成功在菌株中表達異源蛋白，信號肽的效果依舊與異源蛋白的結構特異性相關，但是在能夠表達異源蛋白的前提下，同源信號肽對異源蛋白的分泌效率相較于異源信號肽可能有一定程度的提高。

本研究成功篩選獲得了能夠提高LFCA分泌表達水平的羅伊氏乳桿菌內源性信號肽，獲得了提高LFCA表達量的重組羅伊氏乳桿菌，鑒定了其對金黃色葡萄球菌的抑制活性，加之前期研究^{［29-30，33-35］}證實的對其他病原的抑制作用，表明重組菌株將在生產實踐中具有一定的應用潛力，為其進一步的應用研究奠定基礎。

4 結 論

篩選了高效分泌牛乳鐵蛋白肽的乳酸菌信號肽并利用其構建重組菌株，A3 信號肽可使牛乳鐵蛋白肽的分泌水平提高至 1.23 μg·mL^－1，提高了近 2倍，并且所表達的 LFCA 具有良好的抗菌活性。

參考文獻（References）：

［1］ RAMAMOURTHY G，VOGEL H J.Antibiofilm activity of lactoferrin-derived synthetic peptides against Pseudomonas aeruginosa PAO1［J］.Biochem Cell Biol，2021，99（1）：138-148.

［2］ PUKNUN A，BOLSCHER J G M，NAZMI K，et al.A heterodimer comprised of two bovine lactoferrin antimicrobial peptides exhibits powerful bactericidal activity against Burkholderia pseudomallei［J］.World J Microbiol Biotechnol，2013，29（7）：1217-1224.

［3］ UETA E，TANIDA T，OSAKI T.A novel bovine lactoferrin peptide，FKCRRWQWRM，suppresses Candida cell growth and activates neutrophils［J］.J Pept Res，2001，57（3）：240-249.

［4］ MCCANN K B，LEE A，WAN J，et al.The effect of bovine lactoferrin and lactoferricin B on the ability of feline calicivirus （a norovirus surrogate） and poliovirus to infect cell cultures［J］.J Appl Microbiol 2003，95（5）：1026-1033.

［5］ ARIAS M，HILCHIE A L，HANEY E F，et al.Anticancer activities of bovine and human lactoferricin-derived peptides［J］.Biochem Cell Biol，2017，95（1）：91-98.

［6］ RAM REZ-SNCHEZ D A，ARREDONDO-BELTRN I G，CANIZALEZ-ROMAN A，et al.Bovine lactoferrin and lactoferrin peptides affect endometrial and cervical cancer cell lines［J］.Biochem Cell Biol，2021，99（1）：149-158.

［7］ DRAGO-SERRANO M E，CAMPOS-RODRIGUEZ R，CARRERO J C，et al.Lactoferrin and peptide-derivatives：Antimicrobial agents with potential use in nonspecific immunity modulation［J］.Curr Pharm Des，2018，24（10）：1067-1078.

［8］ WANG B，TIMILSENA Y P，BLANCH E，et al.Lactoferrin：structure，function，denaturation and digestion［J］.Crit Rev Food Sci Nutr，2019，59（4）：580-596.

［9］ LE N-SICAIROS N，ANGULO-ZAMUDIO U A，VIDAL J E，et al.Bactericidal effect of bovine lactoferrin and synthetic peptide lactoferrin chimera in Streptococcus pneumoniae and the decrease in luxS gene expression by lactoferrin［J］.Biometals，2014，27（5）：969-980.

［10］ BOLSCHER J G M，VAN DER KRAAN M I A，NAZMI K，et al.A one-enzyme strategy to release an antimicrobial peptide from the LFampin-domain of bovine lactoferrin［J］.Peptides，2006，27（1）：1-9.

［11］ BOLSCHER J，NAZMI K，VAN MARLE J，et al.Chimerization of lactoferricin and lactoferrampin peptides strongly potentiates the killing activity against Candida albicans［J］.Biochem Cell Biol，2012，90（3）：378-388.

［12］ BOLSCHER J G M，ADO R，NAZMI K，et al.Bactericidal activity of LFchimera is stronger and less sensitive to ionic strength than its constituent lactoferricin and lactoferrampin peptides［J］.Biochimie，2009，91（1）：123-132.

［13］ CHAHARDOLI M，FAZELI A，GHABOOLI M.Recombinant production of bovine Lactoferrin-derived antimicrobial peptide in tobacco hairy roots expression system［J］.Plant Physiol Biochem，2018，123：414-421.

［14］ WANG L，WANG Y L，LV Z L，et al.Design of bovine lactoferricin-derived peptide and its expression and activity in Pichia pastoris［J］.Biochem Biophys Res Commun，2021，534：822-829.

［15］ YU Z H，CHEN J H，LIU Y X，et al.The role of potential probiotic strains Lactobacillus reuteri in various intestinal diseases：New roles for an old player［J］.Front Microbiol，2023，14：1095555.

［16］ HU M X，HE F，GUO Y X，et al.Lactobacillus reuteri biofilms inhibit pathogens and regulate microbiota in in vitro fecal fermentation［J］.J Agric Food Chem，2022，70（38）：11935-11943.

［17］ SAVIANO A，BRIGIDA M，MIGNECO A，et al.Lactobacillus reuteri DSM 17938 （Limosilactobacillus reuteri） in diarrhea and constipation：two sides of the same coin？［J］.Medicina （Kaunas），2021，57（7）：643.

［18］ LIN Z S，WU J M，WANG J P，et al.Dietary Lactobacillus reuteri prevent from inflammation mediated apoptosis of liver via improving intestinal microbiota and bile acid metabolism［J］.Food Chem，2023，404：134643.

［19］ SZAJEWSKA H，URBAN＇SKA M，CHMIELEWSKA A，et al.Meta-analysis：Lactobacillus reuteri strain DSM 17938 （and the original strain ATCC 55730） for treating acute gastroenteritis in children［J］.Benef Microbes，2014，5（3）：285-293.

［20］ DIAS A M M，DOUHARD R，HERMETET F，et al.Lactobacillus stress protein GroEL prevents colonic inflammation［J］.J Gastroenterol，2021，56（5）：442-455.

［21］ GOURIDIS G，KARAMANOU S，GELIS I，et al.Signal peptides are allosteric activators of the protein translocase［J］.Nature，2009，462（7271）：363-367.

［22］ IZARD J W，KENDALL D A.Signal peptides：exquisitely designed transport promoters［J］.Mol Microbiol，1994，13（5）：765-773.

［23］ OWJI H，NEZAFAT N，NEGAHDARIPOUR M，et al.A comprehensive review of signal peptides：structure，roles，and applications［J］.Eur J Cell Biol，2018，97（6）：422-441.

［24］ RUSCH S L，KENDALL D A.Interactions that drive Sec-dependent bacterial protein transport［J］.Biochemistry，2007，46（34）：9665-9673.

［25］ FREUDL R.Signal peptides for recombinant protein secretion in bacterial expression systems［J］.Microb Cell Fact，2018，17（1）：52.

［26］ BTH K，ROOS S，WALL T，et al.The cell surface of Lactobacillus reuteri ATCC 55730 highlighted by identification of 126 extracellular proteins from the genome sequence［J］.FEMS Microbiol Lett，2005，253（1）：75-82.

［27］ LIU F X，MALAPHAN W，XING F G，et al.Biodetoxification of fungal mycotoxins zearalenone by engineered probiotic bacterium Lactobacillus reuteri with surface-displayed lactonohydrolase［J］.Appl Microbiol Biotechnol，2019，103（21-22）：8813-8824.

［28］ KIOV Z，TKACˇGIKOV L’，MUDRONˇOV D，et al.Immunomodulatory effect of Lactobacillus reuteri （Limosilactobacillus reuteri） and its exopolysaccharides investigated on epithelial cell line IPEC-J2 challenged with salmonella typhimurium［J］.Life （Basel），2022，12（12）：1955.

［29］ 宋麗影，邵怡嵐，李雪純，等.表達牛乳鐵蛋白肽的重組乳酸乳球菌對雛雞抗雞白痢沙門氏菌感染的效果研究［J］.中國預防獸醫(yī)學報，2017，39（3）：206-209.

SONG L Y，SHAO Y L，LI X C，et al.Effect of recombinant Lactococcus lactis expressing bovine lactoferrin peptide against Salmonella pullorum infection in chicken［J］.Chinese Journal of Preventive Veterinary Medicine，2017，39（3）：206-209.（in Chinese）

［30］ 汪昭睿，王雪瑩，解偉純，等.重組豬源羅伊氏乳酸桿菌分泌表達牛乳鐵蛋白肽對新生仔豬生長性能的影響以及抗腹瀉病毒感染的保護作用研究［J］.動物營養(yǎng)學報，2022，34（1）：159-176.

WANG Z R，WANG X Y，XIE W C，et al.Effects of recombinant porcine Lactobacillus reuteri secreting expression of bovine lactoferrin peptides on growth performance of newborn piglets and protective effect against diarrhea virus infection［J］.Chinese Journal of Animal Nutrition，2022，34（1）：159-176.（in Chinese）

［31］ MATHIESEN G，SVEEN A，PIARD J C，et al.Heterologous protein secretion by Lactobacillus plantarum using homologous signal peptides［J］.J Appl Microbiol，2008，105（1）：215-226.

［32］ LIANG S L，LI C，YE Y R，et al.Endogenous signal peptides efficiently mediate the secretion of recombinant proteins in Pichia pastoris［J］.Biotechnol Lett，2013，35（1）：97-105.

［33］ 于淑媛，冀禹彤，陳秋艷，等.乳酸乳球菌表達重組牛乳鐵蛋白肽的抑菌活性分析［J］.微生物學報，2021，61（2）：428-443.

YU S Y，JI Y T，CHEN Q Y，et al.Antibacterial activity of the recombinant bovine lactoferrin peptide expressed by Lactococcus lactis［J］.Acta Microbiologica Sinica，2021，61（2）：428-443.（in Chinese）

［34］ 王雪瑩，高 亢，蔡吉垚，等.表達乳鐵蛋白肽的豬源羅伊氏乳酸桿菌對斷乳仔豬抗霍亂沙門菌感染的效果分析［J］.畜牧獸醫(yī)學報，2021，52（10）：2874-2886.

WANG X Y，GAO K，CAI J Y，et al.Analysis of effects of Lactobacillus reuteri from piglets secreting lactoferrin peptides against Salmonella choleraesuis infection of weaned piglets［J］.Acta Veterinaria et Zootechnica Sinica，2021，52（10）：2874-2886.（in Chinese）

［35］ 解偉純，王玉峰，皮若冰，等.表達豬乳鐵蛋白肽重組屎腸球菌對斷奶仔豬生長性能的影響及其抗ETEC感染效果研究［J］.中國畜牧獸醫(yī)，2018，45（12）：3408-3418.

XIE W C，WANG Y F，PI R B，et al.Effect of recombinant Enterococcus faecium expressing porcine lactoferrin peptide on growth performances and its protection activity aganist ETEC of weaned piglets［J］.China Animal Husbandry amp; Veterinary Medicine，2018，45（12）：3408-3418.（in Chinese）

（編輯 范子娟）