基于熒光定量PCR檢測(cè)和原位雜交技術(shù)分析湖北省蛋雞滑液支原體的感染情況

摘 要： 近年來(lái)，滑液支原體（Mycoplasma synoviae， MS）在雞群中的感染率日益上升。湖北省蛋雞存欄規(guī)模較大，各蛋雞品種均有飼養(yǎng)，目前湖北省蛋雞群MS感染情況尚不清楚。因此，本研究開展湖北省規(guī)模蛋雞養(yǎng)殖場(chǎng)雞群MS感染情況的調(diào)查并探究MS在產(chǎn)蛋殼頂端異常（eggshell apex abnormality，EAA）蛋雞輸卵管中的分布。采集湖北省36個(gè)規(guī)模蛋雞養(yǎng)殖場(chǎng)82個(gè)雞群血清和氣管棉拭子各1 637份，利用建立的熒光定量PCR（real-time qPCR）方法檢測(cè)MS載量，ELISA試劑盒檢測(cè)免疫雞群和非免疫雞群血清抗體，并對(duì)產(chǎn)EAA蛋的蛋雞輸卵管進(jìn)行MS載量、病理切片和MS定位分析。結(jié)果顯示，臨床樣本中，喉氣管拭子MS陽(yáng)性率9.41%；血清抗體陽(yáng)性率92.24%，其中非免疫雞群抗體陽(yáng)性率89.04%，且6月齡抗體達(dá)100%陽(yáng)性，免疫雞群抗體陽(yáng)性率95%；36個(gè)規(guī)模場(chǎng)中有26個(gè)（72.22%）MS感染陽(yáng)性場(chǎng)，82個(gè)雞群中有61個(gè)（74.39%）感染陽(yáng)性群；10個(gè)蛋雞品種均有MS感染。產(chǎn)EAA蛋的雞輸卵管部位檢出MS且膨大部的載量極顯著高于子宮部、峽部和漏斗部（P＜0.01），子宮部顯著高于峽部和漏斗部（P＜0.05）；在產(chǎn)EAA蛋的蛋雞輸卵管中，峽部和子宮部出現(xiàn)黏膜上皮細(xì)胞變性和腺體腫大以及膨大部出現(xiàn)腺體上皮細(xì)胞脫落和壞死，子宮部和峽部的黏膜上皮以及膨大部的黏膜上皮和管狀腺周圍都有MS陽(yáng)性信號(hào)檢出，其中膨大部和子宮部陽(yáng)性信號(hào)最強(qiáng)。綜上，湖北省蛋雞場(chǎng)MS感染嚴(yán)重，不同品種均有感染，MS主要定植在蛋雞輸卵管子宮部和膨大部中并造成病理?yè)p傷。本研究為湖北省蛋雞MS感染情況的認(rèn)識(shí)和MS引起EAA蛋的研究提供了數(shù)據(jù)支撐。

關(guān)鍵詞： 滑液支原體；蛋殼頂端異常；熒光定量PCR；原位雜交；組織分布

中圖分類號(hào)：

S858.31"""" 文獻(xiàn)標(biāo)志碼：A"""" 文章編號(hào)： 0366-6964（2025）03-1396-12

收稿日期：2024-04-11

基金項(xiàng)目：國(guó)家肉雞產(chǎn)業(yè)技術(shù)體系（CARS-41）；湖北省重點(diǎn)研發(fā)計(jì)劃項(xiàng)目（2021BBA252）

作者簡(jiǎn)介：王 純（1996-），女，江蘇東臺(tái)人，博士生，主要從事獸醫(yī)微生物學(xué)與免疫學(xué)研究，E-mail： wchun1101@webmail.hzau.edu.cn

*通信作者：周祖濤，主要從事獸醫(yī)微生物學(xué)與免疫學(xué)研究，E-mail： ztzhou@mail.hzau.edu.cn

Analysis of Mycoplasma synoviae Infection in the Laying Hens in Hubei Province based

on Fluorescence Quantitative PCR Detection and in situ Hybridization Technology

WANG" Chun1， WANG" Qing1， WU" Xiaoqian1， HU" Ting1， CUI" Weitao1， PEI" Jie2，

SONG" Tieping3， HU" Sishun1， ZHANG" Wanpo1， LI" Zili1， ZHOU" Zutao^1*

（1.College of Veterinary Medicine， Huazhong Agricultural University/Hubei Key

Laboratory of Preventive Veterinary Medicine， Wuhan 430070，" China; 2.Hubei

Provincial Center for Animal Disease Control and Prevention， Wuhan 430070，" China;

3.Yichang Tianyou Huamu Technology Co.， Ltd， Yichang 443000，" China）

Abstract：" In recent years， the infection rate of Mycoplasma synoviae （MS） in chicken flocks has been increasing. The inventory of laying hens in Hubei Province is relatively large， and all commodity breeds are raised. Currently， the situation of MS infection in laying hens in Hubei Province is not clear. Therefore， this study conducted an investigation into the infection status of MS in chicken flocks of large-scale laying hen farms in Hubei and explored the impact of MS infection on clinical eggshell apex abnormality （EAA）. One thousand six hundred and thirty-seven serum samples and tracheal cotton swabs were collected from 82 chicken flocks in 36 large-scale laying hen farms in Hubei Province. The MS load was detected using the established real-time qPCR method， and the serum antibodies of vaccinated and non-vaccinated chicken flocks were detected using ELISA kits. Perform MS loading， pathological sectioning， and MS localization analysis on the oviduct of EAA laying hens. The results showed that in clinical samples， the MS positive rate of tracheal swabs was 9.41%; The positivity rate of serum antibodies was 92.24%， among which the positivity rate of antibodies in non-vaccinated chicken flocks was 89.04%， and the positivity rate of antibodies in 6-month-old chickens was 100%， while the positivity rate of antibodies in vaccinated chicken flocks was 95%; Out of 36 large-scale farms， 26 （72.22%） were infected with MS， and out of 82 chicken flocks， 61 （74.39%） were infected; All 10 breeds of laying hens were infected with MS. MS was detected in the oviduct of EAA laying hens， and the load in the magnum was significantly higher than that in the uterus， isthmus and infundibulum （P＜0.01）， the uterus was higher than that in the isthmus and infundibulum （P＜0.05）. In the oviduct of EAA laying hens， mucosal epithelial cell degeneration and glandular enlargement occur in the isthmus and uterus， as well as shedding and necrosis of glandular epithelial cells in the magnum. Moreover， MS positive signals were detected in the mucosal epithelium of the uterus and isthmus， as well as in the mucosal epithelium and surrounding tubular glands of the magnum， and among them， the magnum and uterus had the strongest positive signals. The infection of MS in laying hens in Hubei Province is severe， and different breeds are infected. MS mainly colonizes in the uterus and magnum of the laying hens’ oviduct， causing pathological damage. This study provides data support for understanding the situation of MS infection in laying hens in Hubei Province and the study of MS induced EAA eggs.

Keywords： Mycoplasma synoviae; eggshell apex abnormality; real-time qPCR; in situ hybridization; tissue distribution

*Corresponding author：" ZHOU Zutao， E-mail： ztzhou@mail.hzau.edu.cn

雞滑液支原體（Mycoplasma synoviae，MS）是一種大小介于細(xì)菌和病毒之間沒(méi)有細(xì)胞壁的原核微生物^［1］，主要感染雞、火雞和珍珠雞。 MS感染一年四季均可發(fā)生，但冬春季多發(fā)^［2-5］，該病可經(jīng)水平傳播和垂直傳播^［6］。在雞群感染MS的初期可以觀察到關(guān)節(jié)發(fā)生腫脹并伴隨著炎癥的表現(xiàn)，爪墊腫大，呼吸時(shí)有啰音，也可能出現(xiàn)無(wú)癥狀感染^［7］，后期可見生長(zhǎng)發(fā)育遲緩^［8］，產(chǎn)蛋期的蛋雞則可觀察到產(chǎn)蛋量下降、畸形蛋增多、蛋殼頂端異常（eggshell apex abnormalities， EAA）等情況^［9］。MS還常與一些疾病混合感染，如禽流感、新城疫、雞傳染性支氣管炎、大腸桿菌病等，加重呼吸道癥狀或全身癥狀、蛋殼頂端異常^［10］，給養(yǎng)殖場(chǎng)帶來(lái)嚴(yán)重的經(jīng)濟(jì)損失。MS感染在世界范圍流行，其中商品化雞場(chǎng)和蛋雞感染尤其嚴(yán)重。

為了解湖北省蛋雞群MS的感染情況，探究MS感染與臨床EAA蛋的關(guān)系，本研究建立了MS SYBR Green Ⅰ real-time qPCR和組織原位雜交定位的檢測(cè)方法，對(duì)湖北省36個(gè)規(guī)模蛋雞養(yǎng)殖場(chǎng)（產(chǎn)蛋雞和青年雞）進(jìn)行了MS感染情況調(diào)查，并對(duì)產(chǎn)EAA蛋的蛋雞輸卵管進(jìn)行了MS載量、病理切片和MS定位分析。研究結(jié)果豐富了湖北省蛋雞群的MS流行情況數(shù)據(jù)，且證實(shí)了MS可以定植于蛋雞的輸卵管，并與EAA蛋的產(chǎn)生相關(guān)，為后續(xù)MS感染引起蛋雞產(chǎn)蛋異常的研究提供了數(shù)據(jù)支撐。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

MSXS株分離自湖北浠水病雞跗關(guān)節(jié)^［11］，由本實(shí)驗(yàn)室保存；禽大腸桿菌O78（Escherichia coli，E. coli）、新城疫病毒（Newcastle disease virus， NDV）、禽流感病毒H9N2（avian influenza virus， AIV）、傳染性支氣管炎病毒（infectious bronchitis virus， IBV）和雞毒支原體（Mycoplasma galloseccium， MG）S6株均由華中農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物醫(yī)學(xué)院獸醫(yī)微生物與免疫學(xué)實(shí)驗(yàn)室保存；SYBR Green Pro Taq HS預(yù)混型qPCR試劑盒和基因組提取試劑盒購(gòu)于艾科瑞生物科技有限公司；荷蘭百測(cè)（BioChek）MS抗體檢測(cè)試劑盒購(gòu)于北京天之泰生物科技有限公司；原位雜交試劑盒（DIG-High Prime DNA Labeling and Detection Starter Kit I）購(gòu)于上海羅氏制藥有限公司。

1.2 臨床樣本采集和處理

從湖北36家蛋雞規(guī)模養(yǎng)殖場(chǎng)的82個(gè)雞群隨機(jī)采集喉氣管棉拭子和血清各1 637份。棉拭子在采樣前后進(jìn)行單個(gè)稱重，精確到0.000 1 g，前后差值視為棉拭子的黏液攝取量（g），并假設(shè)洗滌過(guò)程中棉拭子的黏液釋放量為100%^［12］。

喉氣管棉拭子置于1 mL PBS中，振蕩渦旋成懸液，將懸液以2 000 r·min^-1轉(zhuǎn)速離心5 min；去上清液置于1.5 mL離心管中，12 000 r·min^-1，4 ℃離心30 min；棄上清，將沉淀采用水煮法提取基因組DNA。在沉淀中加入50 μL PBS重懸沉淀，封口膜封住EP管口，100 ℃水浴15 min后，立即冰浴10 min；12 000 r·min^-1，4 ℃離心10 min，上清即為基因組DNA，-20 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

使用真空采血管采集翅下靜脈血，室溫自然凝集30～60 min，待血液凝固后，3 000 r·min^-1離心5 min，上清即為血清，-80 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

連續(xù)3 d對(duì)產(chǎn)EAA蛋的目標(biāo)蛋雞養(yǎng)殖場(chǎng)觀察，挑選10只產(chǎn)EAA蛋和10只產(chǎn)蛋正常的雞作為試驗(yàn)對(duì)象。將這些雞處死后解剖，采集輸卵管漏斗部、膨大部、峽部和子宮部于4%多聚甲醛固定；用無(wú)菌手術(shù)刀刮取輸卵管各部位黏膜于液氮速凍，使用組織DNA提取試劑盒提取輸卵管黏膜（50 mg）基因組，-20 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.3 SYBR Green I real-time qPCR檢測(cè)方法的建立

1.3.1 real-time qPCR標(biāo)準(zhǔn)曲線的建立

MSXS分離株用于制備陽(yáng)性標(biāo)準(zhǔn)品?；贛SXS vlhA基因的高度保守區(qū)，設(shè)計(jì)引物（vlhA-F：5′-TTAGCAGCTAGTGCAGTGCC-3′；vlhA-R：5′-ACCTGGATTTCCTGATTGGTTTTGAGG-3′），片段大小為135 bp，用于常規(guī)PCR和real-time qPCR檢測(cè)MS。

將MS分離株使用特異性引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增，回收目的條帶并純化；將膠回收產(chǎn)物連接至pMD18-T載體；連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化DH5α感受態(tài)細(xì)胞中，挑取單菌落，經(jīng)測(cè)序驗(yàn)證，使用質(zhì)粒小提試劑盒提取質(zhì)粒，該質(zhì)粒即為標(biāo)準(zhǔn)曲線的陽(yáng)性標(biāo)準(zhǔn)品，測(cè)定質(zhì)粒濃度，根據(jù)摩爾定律計(jì)算質(zhì)?？截悢?shù)：質(zhì)?？截悢?shù)=［質(zhì)粒濃度（ng·μL^-1）×6.02×10²³×10^-9］/［總片段長(zhǎng)度（bp）×660］，總片段長(zhǎng)度=載體長(zhǎng)度+片段長(zhǎng)度（bp）。

根據(jù)計(jì)算的拷貝數(shù)，制備10倍稀釋的定量質(zhì)粒，標(biāo)準(zhǔn)品濃度梯度為10¹⁰～101 copies·μL^-1。使用兩步法PCR反應(yīng)程序，反應(yīng)體系為20 μL：SYBR qPCR Master Mix（2×）10 μL，上下游引物各0.4 μL，ddH2O 7.2 μL，模板2 μL。反應(yīng)程序：95 ℃預(yù)變性30 s；95 ℃ 5 s，60 ℃ 30 s，40個(gè)循環(huán)；熔解曲線采集使用儀器默認(rèn)熔解曲線采集程序。擴(kuò)增后收集數(shù)據(jù)，根據(jù)擴(kuò)增曲線圖、Ct值等情況，選擇最佳檢測(cè)區(qū)域，以起始拷貝數(shù)的對(duì)數(shù)為x軸和Ct值為y軸繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。

1.3.2 real-time qPCR的檢測(cè)方法靈敏度、特異性和重復(fù)性試驗(yàn)

將10個(gè)濃度梯度標(biāo)準(zhǔn)品使用特異性引物進(jìn)行普通PCR和real-time qPCR擴(kuò)增，PCR產(chǎn)物用1.5%瓊脂糖凝膠電泳鑒定，real-time qPCR擴(kuò)增曲線檢測(cè)其靈敏度。

以禽大腸桿菌（Escherichia coli，E. coli）O78、新城疫病毒（Newcastle disease virus， NDV）、H9N2亞型禽流感病毒（avian influenza virus， AIV）、傳染性支氣管炎病毒（infectious bronchitis virus， IBV）和雞毒支原體（Mycoplasma galloseccium， MG）S6株核酸為模板，進(jìn)行real-time qPCR方法的特異性檢測(cè)。

選取106、105和10⁴ copies·μL^-1梯度的標(biāo)準(zhǔn)質(zhì)粒進(jìn)行real-time qPCR方法的重復(fù)性和敏感性檢測(cè)。批內(nèi)重復(fù)試驗(yàn)：3個(gè)濃度樣品同一批次進(jìn)行3次重復(fù)試驗(yàn)。批間重復(fù)試驗(yàn)：在不同時(shí)間點(diǎn)對(duì)上述樣品進(jìn)行3次熒光定量檢測(cè)。根據(jù)反應(yīng)結(jié)果的Ct值，計(jì)算組內(nèi)和組間變異系數(shù)。

1.4 MS核酸和血清抗體檢測(cè)

棉拭子和組織黏膜基因組使用建立的real-time qPCR方法和標(biāo)準(zhǔn)曲線進(jìn)行MS核酸定量檢測(cè)，根據(jù)每個(gè)樣品3次重復(fù)試驗(yàn)計(jì)算氣管黏液^［12］和黏膜平均拷貝數(shù)（copies·g^-1）。

按照MS ELISA抗體檢測(cè)試劑盒說(shuō)明書對(duì)采集的雞血清樣品進(jìn)行MS抗體檢測(cè)，用酶標(biāo)儀測(cè)定405 nm處的吸光度值，并根據(jù)吸光度值計(jì)算S/P值，其中S=樣本吸光度值-陰性標(biāo)準(zhǔn)品吸光度值，P=陽(yáng)性標(biāo)準(zhǔn)品吸光度值-陰性標(biāo)準(zhǔn)品吸光度值，S/P≤0.499判定為MS抗體陰性，S/P≥0.500判定為MS抗體陽(yáng)性，滴度≥594判定為MS抗體陽(yáng)性。

1.5 病理切片

將固定的輸卵管二次取材固定后，進(jìn)行包埋切片，經(jīng)酒精脫水、透明、浸蠟、包埋、切片、常規(guī)蘇木精-伊紅染色法（Hematoxylin-Eosin staining，HE）染色，脫水、透明和封固后，在光鏡下觀察病理?yè)p傷情況。

1.6 原位雜交

取“1.3.1”回收產(chǎn)物1 μg沸水浴10 min變性DNA，并迅速冰浴，加入4 μL DIG-High Prime，混合并低速離心，37 ℃孵育16 h后，加入2 μL 0.2 mol·L^-1" EDTA，標(biāo)記完成后DNA探針置于-20 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

組織石蠟切片經(jīng)二甲苯脫蠟和乙醇梯度水化后，超純水洗滌5 min；置于0.2 mol·L^-1 HCl避光20 min后，取出切片，超純水洗滌2次；切片置于超純水中，水浴加熱，85～95 ℃維持20 min；取出切片，室溫冷卻干燥后，滴加15 ng·μL^-1蛋白酶K，37 ℃反應(yīng)8 min；2×SSC緩沖液洗滌、酒精脫水后進(jìn)行預(yù)雜交，加入雜交緩沖液，37 ℃反應(yīng)30 min；2×SSC緩沖液洗滌、酒精脫水；自然晾干后滴加6 μL，6 ng·μL^-1的DNA探針，蓋上蓋玻片，橡膠水泥封口。將切片置于雜交儀中雜交，雜交條件：95 ℃ 7 min，37 ℃ 13 h。依次用37 ℃的2×SSC緩沖液、2×SSC（含0.3% SDS）緩沖液和55 ℃的0.5×SSC（含0.3% SDS）緩沖液洗滌；馬來(lái)酸平衡緩沖液平衡pH后封閉液封閉，37 ℃作用45 min；甩去封閉液，滴加AP標(biāo)記的羊抗地高辛二抗，37 ℃作用45 min；洗滌緩沖液洗滌8 min×4次，檢測(cè)緩沖液平衡pH后，用NBT-BCIP（1∶30稀釋）滴加組織上，避光反應(yīng)20～30 min。顯微鏡下觀察顯色效果，陽(yáng)性信號(hào)呈現(xiàn)為紫色點(diǎn)狀分布，而背景無(wú)紫色或呈淡紫色。取出切片置于TE緩沖液中終止反應(yīng)；55 ℃烘箱烘烤20 min，中性樹膠封片。

1.7 統(tǒng)計(jì)分析

試驗(yàn)數(shù)據(jù)經(jīng)SPSS 23.0進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，使用卡方檢驗(yàn)（Chi-squared test）分析臨床樣品MS核酸和抗體的檢出率，輸卵管各部位MS載量進(jìn)行單因素方差分析（one way ANOVA），結(jié)果表示為“平均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（x±s）”，以P＜0.05為差異顯著，P＜0.01為差異極顯著。

2 結(jié) 果

2.1 SYBR GREEN I real-time qPCR檢測(cè)方法的建立

2.1.1 real-time qPCR標(biāo)準(zhǔn)曲線的建立

以MSXS的DNA為模板，對(duì)vlhA基因保守片段進(jìn)行擴(kuò)增，結(jié)果（圖1A）顯示，擴(kuò)增出約135 bp的條帶，與預(yù)期大小一致。將PCR產(chǎn)物純化后，克隆至pMD-18T載體，構(gòu)建了重組質(zhì)粒。對(duì)此重組質(zhì)粒進(jìn)行PCR擴(kuò)增，通過(guò)凝膠電泳和測(cè)序?qū)ζ溥M(jìn)行驗(yàn)證，結(jié)果與目標(biāo)片段相吻合。提取質(zhì)粒后測(cè)的濃度為62.8 ng·μL^-1，根據(jù)公式得到拷貝數(shù)為1.91×10¹⁰ copies·μL^-1，對(duì)標(biāo)準(zhǔn)質(zhì)粒進(jìn)行十倍梯度稀釋，得到1.91×10¹⁰～1.91×101 copies·μL^-1梯度濃度的質(zhì)粒作為建標(biāo)準(zhǔn)曲線的模板。

用10倍連續(xù)稀釋的標(biāo)準(zhǔn)質(zhì)粒進(jìn)行real-time qPCR，得到擴(kuò)增曲線（圖1B），并建立標(biāo)準(zhǔn)曲線。初始拷貝數(shù)的對(duì)數(shù)與Ct值表達(dá)式為y=-3.3x+37.733，相關(guān)系數(shù)R2為0.998，擴(kuò)增效率為100.9%。在1.91×109～1.91×102copies·μL^-1有良好的線性關(guān)系（圖1C）。熔解曲線結(jié)果顯示，單一峰值（圖1D），證明反應(yīng)不存在非特異性擴(kuò)增。

2.1.2 real-time qPCR的檢測(cè)方法的靈敏度、特異性和重復(fù)性試驗(yàn)

采用常規(guī)PCR和本研究建立的實(shí)時(shí)熒光定量PCR分別對(duì)不同稀釋度的標(biāo)準(zhǔn)品質(zhì)粒進(jìn)行擴(kuò)增，結(jié)果顯示，real-time qPCR最低檢測(cè)限能達(dá)到1.91×10² copies·μL^-1（圖2A），而常規(guī)PCR所能檢測(cè)到的最低限位1.91×104 copies·μL^-1（圖2B）。因此，real-time qPCR的靈敏度比常規(guī)PCR的高100倍。采用建立的real-time qPCR方法對(duì)包括MS、E. coli、NDV、AIV、IBV和MG的核酸進(jìn)行檢測(cè)。結(jié)果顯示（圖2C），除了MS以外，其他病原體核酸均無(wú)擴(kuò)增信號(hào)，表明該方法具有良好的特異性。用3個(gè)稀釋度的質(zhì)粒標(biāo)準(zhǔn)品分別進(jìn)行3次批內(nèi)重復(fù)性試驗(yàn)和3次批間重復(fù)性試驗(yàn)，并對(duì)結(jié)果進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。批內(nèi)變異系數(shù)為0.16%～0.61%，批間變異系數(shù)為0.51%～4.10%（表1），表明所建立的方法具有良好的重復(fù)性和穩(wěn)定性。

2.2 MS核酸和血清抗體陽(yáng)性率分析

采用real-time qPCR方法對(duì)不同雞群1 637份喉氣管拭子樣品檢測(cè)，結(jié)果顯示，總樣品MS核酸陽(yáng)性率為9.41%（154/1 637），其中免疫雞群880個(gè)樣本，陽(yáng)性率為10.68%（94/880），和非免疫雞群的7.93%（60/757）陽(yáng)性率比不存在顯著差異（P＞0.05）（表2）。在免疫雞群和非免疫雞群的各個(gè)月齡都有陽(yáng)性檢出（圖3A、B），表明日齡不影響MS的感染。

使用ELISA抗體檢測(cè)試劑盒檢測(cè)1 637份血清樣本，結(jié)果顯示，總抗體陽(yáng)性率為92.24%（1 510/1 637），其中免疫雞群陽(yáng)性率為95%（836/880），非免疫雞群陽(yáng)性率為89.04%（674/757），免疫雞群和非免疫雞群抗體水平存在極顯著差異（P＜0.01）。免疫雞群血清抗體隨著月齡增大而上升（圖3A），非免疫雞群1～2月齡抗體陽(yáng)性率呈現(xiàn)下降趨勢(shì)，并在3月齡后血清抗體陽(yáng)性率不斷上升，免疫雞群和非免疫雞群到5月齡左右抗體陽(yáng)性率達(dá)100%（圖3B）。

采樣雞群中有10個(gè)蛋雞品種，對(duì)不同品種的MS核酸和抗體陽(yáng)性檢出結(jié)果分析（圖3C），每種蛋雞都有核酸和抗體陽(yáng)性檢出，表明品種不影響MS的感染。將免疫雞群核酸陽(yáng)性檢出和非免疫雞群的核酸或抗體陽(yáng)性檢出視為臨床MS感染，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，36個(gè)養(yǎng)殖場(chǎng)中有26個(gè)養(yǎng)殖場(chǎng)（72.22%）是MS陽(yáng)性感染場(chǎng)（圖4A），82個(gè)雞群中有61個(gè)雞群

A. 十倍稀釋標(biāo)準(zhǔn)質(zhì)粒real-time qPCR的擴(kuò)增曲線（2～10. 1.91×109～1.91×101copies·μL^-1的標(biāo)準(zhǔn)品質(zhì)粒）；B. 十倍稀釋標(biāo)準(zhǔn)質(zhì)粒的PCR擴(kuò)增（M. DNA相對(duì)分子質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)；1～10. 1.91×10¹⁰～1.91×101copies·μL^-1的標(biāo)準(zhǔn)品質(zhì)粒）；C. real-time qPCR特異性試驗(yàn)（+. 標(biāo)準(zhǔn)質(zhì)粒；Ⅰ～Ⅴ. MG、 E. coli、 NDV、 AIV和IBV）（74.39%）是MS陽(yáng)性感染雞群，其中免疫雞群占42.62%，非免疫雞群占57.38%（圖4B）。由此可見，湖北省蛋雞MS感染嚴(yán)重。

結(jié)合問(wèn)卷調(diào)查和檢測(cè)結(jié)果對(duì)核酸陽(yáng)性檢出率前十的雞群進(jìn)行分析（表3），陽(yáng)性率高檢出的雞群表現(xiàn)出低產(chǎn)蛋率和高蛋殼破損率，出現(xiàn)EAA蛋的雞場(chǎng)隨機(jī)樣品MS載量較均衡，抗體陽(yáng)性率100%。選擇核酸陽(yáng)性率最高（54.55%）且產(chǎn)EAA蛋的雞群進(jìn)行臨床病例分析。

2.3 組織MS載量的測(cè)定結(jié)果

參照標(biāo)準(zhǔn)曲線由Ct值計(jì)算得出每克黏膜的MS載量。從表4可以得出輸卵管子宮部、峽部、膨大部和漏斗部都檢測(cè)到MS，而且MS載量有一定的差異性，其中膨大部和子宮部、峽部、漏斗部差異極顯著（P＜0.01），峽部和漏斗部差異不顯著（P＞0.05），子宮和峽部、漏斗部差異顯著（P＜0.05）。

2.4 輸卵管病理組織學(xué)分析

圖5子宮部病理組織學(xué)變化顯示，子宮纖毛出現(xiàn)脫落的異?，F(xiàn)象（a），上皮細(xì)胞出現(xiàn)空泡（b），絨毛上皮增厚（c）和腺體上皮細(xì)胞脫落，部分腺體溶解壞死（d）。峽部出現(xiàn)纖毛脫落（a），上皮細(xì)胞空泡化（b），腺體上皮細(xì)胞脫落，輪廓不清（d），炎性細(xì)胞浸潤(rùn)（e）。膨大部出現(xiàn)上皮細(xì)胞空泡化變性（b），腺體腫脹，輪廓不清（f），炎性細(xì)胞浸潤(rùn)（e）。漏斗部顯示纖毛脫落（a），部分腺體溶解（d）和炎性細(xì)胞浸潤(rùn)（e）。

2.5 原位雜交分析MS在輸卵管中的定位

在產(chǎn)EAA蛋的蛋雞輸卵管中檢測(cè)到ISH陽(yáng)性信號(hào)（圖6），子宮上皮細(xì)胞內(nèi)的MS陽(yáng)性信號(hào)分布最為廣泛，均是規(guī)律的集聚性分布；峽部上皮細(xì)胞內(nèi)有均勻分布的陽(yáng)性信號(hào)；膨大部的陽(yáng)性信號(hào)均勻分布在上皮細(xì)胞內(nèi)和少量集聚在腺體內(nèi)或其周圍；漏斗部未檢出陽(yáng)性信號(hào)。

3 討 論

MS實(shí)驗(yàn)室診斷主要依靠病原的分離鑒定、血清學(xué)檢測(cè)和分子生物學(xué)方法。病原的分離培養(yǎng)是金標(biāo)準(zhǔn)，也是診斷該疾病最可靠的方法，研究前期從華中地區(qū)5個(gè)省份485份臨床疑似MS感染的樣本中，分離純化出52株MS，分離率為10.72%^［11］，但MS對(duì)培養(yǎng)基要求苛刻，自然生長(zhǎng)緩慢，病原分離難度大，分離周期長(zhǎng)，不適合進(jìn)行早期診斷^［13］。PCR 作為分子生物學(xué)常用的檢測(cè)方法之一，尤其是qPCR因其靈敏性高、特異性強(qiáng)、操作簡(jiǎn)便等優(yōu)點(diǎn)而被廣泛應(yīng)用。Raviv和Kleven^［14］利用MS 16S-23S ISR建立了MS TaqMan qPCR檢測(cè)方法，靈敏度為10 copies·μL^-1，Sprygin等^［15］利用MG mgc2和MS vlhA基因建立了雙重TaqMan qPCR檢測(cè)方法，其靈敏度為34和29 copies·μL^-1。本研究建立的MS SYBR Green Ⅰ real-time qPCR檢測(cè)方法比普通PCR檢測(cè)敏感性高出100倍，檢測(cè)靈敏度為102 copies·μL^-1，比已有探針?lè)`敏度低，這與學(xué)者比較發(fā)現(xiàn)SYBR Green Ⅰ real-time qPCR和TaqMan qPCR檢測(cè)靈敏度低的結(jié)果相符^［16］，但兩個(gè)方法都具有良好的重復(fù)性，高穩(wěn)定性，適用于臨床樣品檢測(cè)和分析流行病學(xué)調(diào)查。

研究采用棉拭子喉氣管采樣和水煮法提取基因組來(lái)進(jìn)行MS核酸檢測(cè)，棉拭子的吸附性和洗脫率不高以及水煮法提取基因組操作過(guò)程都會(huì)降低DNA濃度和純度，導(dǎo)致臨床喉氣管拭子MS檢出率和載量偏低，檢出量在每克黏液103～104copies，實(shí)驗(yàn)室后期使用吸附釋放率較高的植絨棉拭子和基因組提取試劑盒來(lái)進(jìn)行檢測(cè)，臨床檢測(cè)MS核酸陽(yáng)性率和載量有極大提高，檢出量在每克黏液103～107copies。因此本研究的拭子MS核酸檢測(cè)結(jié)果僅用于臨床產(chǎn)EAA蛋病例評(píng)價(jià)和篩選。

2009年，F(xiàn)eberwee等^［17］首次報(bào)道了一種新的MS分離物，該分離物與產(chǎn)蛋量下降、產(chǎn)EAA蛋和蛋殼強(qiáng)度降低有關(guān)。隨后，越來(lái)越多的報(bào)告涉及MS引起的蛋殼質(zhì)量下降、畸形蛋和EAA蛋^{［9，18-23］}。Catania等^［24］發(fā)現(xiàn)MS可以在輸卵管中定植，蛋雞感染會(huì)導(dǎo)致產(chǎn)蛋量和孵化率下降，從而增加了家禽行業(yè)對(duì)控制滑液支原體病的關(guān)注。姜蘭蘭等^［25］對(duì)北京不同雞群血清樣本進(jìn)行抗體檢測(cè)，發(fā)現(xiàn)蛋雞MS陽(yáng)性率均高于肉雞，血清抗體陽(yáng)性率隨月齡增大呈上升趨勢(shì)。國(guó)內(nèi)對(duì)蛋雞MS感染情況的調(diào)查數(shù)據(jù)尚不完善，本研究對(duì)湖北部分地區(qū)的蛋雞免疫雞群和非免疫雞群開展MS感染情況調(diào)查，免疫雞群2～3月齡抗體陽(yáng)性率較高，這可能是由接種疫苗或感染所導(dǎo)致；非免疫雞群1～3月齡抗體陽(yáng)性檢出可能是因?yàn)橐岸靖腥净蚰冈纯贵w的存在。免疫雞群和非免疫雞群在5月齡左右抗體陽(yáng)性率達(dá)到100%，且都有MS核酸檢出，不同品種和各日齡均有感染，這表明湖北省蛋雞MS感染嚴(yán)重。

MS會(huì)嚴(yán)重影響蛋雞和種雞鈣代謝，引起蛋品質(zhì)下降，出現(xiàn)蛋殼頂端異常^［20］。MS能導(dǎo)致輸卵管黏膜上皮細(xì)胞變性、壞死、脫落及腺體水腫，管內(nèi)纖維蛋白分泌物增多，巨噬細(xì)胞和異嗜性細(xì)胞顯著浸潤(rùn)^［26］。本研究針對(duì)拭子MS核酸陽(yáng)性率檢出前十的雞群進(jìn)行信息統(tǒng)計(jì)，陽(yáng)性率為20.00%～54.55%，發(fā)現(xiàn)高日齡產(chǎn)蛋雞感染MS更容易產(chǎn)生EAA蛋。通過(guò)對(duì)輸卵管子宮部、峽部、膨大部和漏斗部的MS載量檢測(cè)分析，膨大部和子宮部的MS載量顯著高于峽部和漏斗部（P＜0.05）。病理切片結(jié)果顯示（圖5），輸卵管主要病變?cè)趰{部和子宮部的黏膜上皮細(xì)胞變性、腺體水腫以及膨大部腺體上皮細(xì)胞的脫落、壞死等損傷。此外，原位雜交結(jié)果顯示MS主要定植在輸卵管的子宮部和峽部的黏膜上皮細(xì)胞、膨大部的黏膜上皮細(xì)胞和腺體周圍（圖6），與病理切片表現(xiàn)的損傷具有一定的位置相似性。蛋雞的峽部和子宮部分別形成內(nèi)外殼膜和蛋殼，其損傷會(huì)導(dǎo)致蛋殼及殼膜形成異常，這可能是蛋雞感染MS后產(chǎn)軟殼蛋和EAA蛋等劣質(zhì)蛋的原因之一。

4 結(jié) 論

本研究結(jié)果表明，湖北省蛋雞MS感染嚴(yán)重，臨床產(chǎn)EAA蛋的產(chǎn)蛋雞輸卵管不同部位結(jié)合real-time qPCR檢測(cè)，HE染色與原位雜交檢測(cè)結(jié)果，發(fā)現(xiàn)MS載量檢出多的部位，原位雜交陽(yáng)性信號(hào)強(qiáng)，且發(fā)生明顯的組織病理學(xué)變化，即產(chǎn)蛋雞感染MS后輸卵管不同部位組織病理變化與MS載量存在明顯的正相關(guān)。蛋雞感染MS后，輸卵管中MS的侵入導(dǎo)致組織損傷，這可能是引起產(chǎn)蛋量下降和產(chǎn)異常蛋的一個(gè)重要原因。

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（編輯 白永平）