雞毒害艾美耳球蟲ROP30蛋白的原核表達及其對雞免疫保護效果的觀察

摘 要： 旨在克隆表達雞毒害艾美耳球蟲棒狀體EnROP30基因，并用重組蛋白rEnROP30免疫雛雞，評價其免疫保護效果。以毒害艾美耳球蟲第二代裂殖子（MZ-2）的總RNA為模板，RT-PCR擴增EnROP30基因，連接至pGEM-T-Easy載體，測序后構(gòu)建pET28a（+）-EnROP30表達載體，轉(zhuǎn)化至大腸桿菌BL21（DE3），重組菌經(jīng)測序鑒定后誘導(dǎo)表達，并純化重組蛋白。用重組蛋白免疫BALB/c小鼠，制備抗rEnROP30的多克隆抗體。利用多克隆抗體，分別用Western blot和間接免疫熒光試驗檢測子孢子（SZ）和MZ-2中的天然EnROP30蛋白及其定位。最后，應(yīng)用熒光定量PCR分析EnROP30基因在SZ和MZ-2中的轉(zhuǎn)錄水平。用重組蛋白按高劑量（200 μg·羽^-1）、中劑量（100 μg·羽^-1）和低劑量（50 μg·羽^-1）免疫雛雞，同時設(shè)置未免疫攻蟲組和未免疫未攻蟲組為對照，以成活率、平均增重、相對增重率、卵囊減少率、病變記分和抗球蟲指數(shù)（ACI）為指標(biāo)，評價重組蛋白的免疫保護力。結(jié)果顯示：該基因全長1 605 bp，編碼534個氨基酸，推導(dǎo)相對分子質(zhì)量為55.55 ku；重組蛋白大小約為65 ku，以可溶形式存在，能被小鼠抗His標(biāo)簽單抗和雞抗毒害艾美耳球蟲陽性血清特異性識別；在SZ和MZ-2中均檢測到天然EnROP30蛋白，其分子質(zhì)量大約為62 ku；EnROP30蛋白定位在SZ和MZ-2的頂端；MZ-2中EnROP30轉(zhuǎn)錄水平顯著高于SZ（Plt;0.05）。各試驗組的成活率均為100%；免疫組的平均增重增加，病變記分顯著降低（P＜0.05）；中劑量組的相對增重率（92.96%）、卵囊減少率（66.87%）和ACI值（158.96）均為最高。綜上：成功克隆表達了EnROP30基因，重組蛋白rEnROP30對毒害艾美耳球蟲具有一定的免疫保護力。

關(guān)鍵詞： 毒害艾美耳球蟲；EnROP30；克?。槐磉_；免疫保護力

中圖分類號：S852.723;S855.9

文獻標(biāo)志碼：A"""" 文章編號： 0366-6964（2025）03-1419-12

收稿日期：2024-05-15

基金項目：國家自然科學(xué)基金項目（31972698）；江蘇省高校優(yōu)勢學(xué)科建設(shè)四期工程項目（2021）；高等學(xué)校學(xué)科創(chuàng)新引智計劃資助（D18007）

作者簡介：李慧中（1998-），女，江蘇宿遷人，碩士生，主要從事雞球蟲病防治研究，E-mail： 1067253182@qq.com

*通信作者：陶建平，主要從事獸醫(yī)寄生蟲病及其防治技術(shù)的教學(xué)與研究，E-mail： yzjptao@126.com

Prokaryotic Expression of Eimeria necatrix ROP30 Protein and Its Immunoprotective

Efficacy in Chicken

LI" Huizhong "ZHANG" Chi "YAN" Danli "SONG" Penghui "WANG" Feiyan

FENG" Qianqian "LIU" Dandan "XUnbsp; Jinjun "TAO" Jianping^1，2*

（1.College of Veterinary Medicine， Yangzhou University， Yangzhou 225009，" China;

2.Jiangsu Co-innovation Center for Prevention and Control of Important Animal

Infectious Diseases and Zoonoses， Yangzhou 225009，" China）

Abstract：" This study aimed to clone and express EnROP30 gene of Eimeria necatrix， and to evaluate the immune protection of recombinant protein EnROP30 in chicken. EnROP30 gene was cloned from total RNA of the second generation merozoites （MZ-2） of E. necatrix by RT-PCR， and inserted into the pGEM-T-Easy vector by TA cloning. After sequencing analysis， EnROP30 cDNA was subcloned to the pET-28a（+） vector to obtain a recombinant prokaryotic plasmid. After transformed into E. coli BL21， the recombinant plasmid pET28a（+）-EnROP30 was induced to express by IPTG， and the recombinant protein rEnROP30 was identified and purified. BALB/c mice were immunized with the purified recombinant protein to prepare the anti-rEnROP30 polyclonal antibodies， which was used to detect the native protein EnROP30 and its localization in sporozoites （SZ） and MZ-2 of E. necatrix by Western blot and indirect immunofluorescence assay， respectively. Finally， the transcriptional level of EnROP30 in SZ and MZ-2 was analyzed by qRT-PCR. Three groups of chickens were immunized with rEnROP30 at three different doses （200 μg， 100 μg and 50 μg per chicken）， respectively. At the same time， two groups of chickens， namely the unimmunized and challenged （UC） group， and the unimmunized and unchallenged （UU） group， were used as the controls. The immune protective effects were evaluated based on the survival rate， weight gain， relative weight gain， oocyst reduction， lesion score and anticoccidial index （ACI） of each group. The results showed that the target gene was 1 605 bp， coding 534 amino acids with a predicted molecular weight of 55.55 ku. The recombinant protein was about 65 ku and predominantly expressed as soluble form. Western blot analysis showed that the recombinant protein could be specifically recognized by mouse anti-His monoclonal antibodies and the convalescent serum of the chickens infected with E. necatrix. Native protein EnROP30 was detected in SZ and MZ-2 and had a molecular weight of 62 ku. EnROP30 protein was located in the top of SZ and MZ-2. The transcription level of EnROP30 in MZ-2 was significantly higher than that in SZ （Plt;0.05）. The survival rate of all the groups was 100%. The weight gain of the immunized groups was higher than that of the UC group， but their lesion scores were significantly lower than that of the UC group （P＜0.05）. In the group immunized with 100 μg rEnROP30 per chicken， the relative weight gain （92.96%）， the oocyst reduction （66.87%） and ACI （158.96） were the highest. It was showed that EnROP30 gene was cloned and expressed successfully; rEnROP30 had a good protective efficacy against E. necatrix.

Keywords： Eimeria necatrix; EnROP30; cloning; expression; protective efficacy

*Corresponding author：" TAO Jianping， E-mail： yzjptao@126.com

雞球蟲病是由艾美耳球蟲寄生于雞腸道引起的一種寄生蟲病，其病原有7種，其中毒害艾美耳球蟲（Eimeria necatrix）主要危害8～18周齡的育成雞，可引起雞的急性小腸球蟲病，導(dǎo)致育成雞的大批死亡^［1］。迄今，防治雞球蟲病的措施仍然以藥物為主，但藥物長期使用導(dǎo)致球蟲耐藥性問題日益嚴(yán)重，因藥物殘留引起肉蛋安全問題也越來越受到關(guān)注。為此，雞球蟲病的防治趨勢由藥物轉(zhuǎn)向疫苗免疫預(yù)防^［2］。目前，臨床上免疫預(yù)防雞球蟲病的疫苗主要是活蟲苗，雖能產(chǎn)生較好的免疫保護力，但使用不當(dāng)會引起球蟲病發(fā)生。與活蟲苗相比，亞單位疫苗無此安全風(fēng)險。球蟲是專性細(xì)胞內(nèi)寄生蟲，蟲體成功入侵宿主細(xì)胞是建立感染的關(guān)鍵，而阻止蟲體入侵是防控球蟲感染的重要切入點。因此，入侵過程相關(guān)蛋白分子可能是潛在的靶抗原，可用于亞單位疫苗的研制。球蟲的棒狀體蛋白（rhoptry proteins，ROPs）是由棒狀體基部分泌的一類蟲體入侵相關(guān)蛋白，是球蟲入侵宿主細(xì)胞的關(guān)鍵分子^［3］。迄今，對毒害艾美耳球蟲棒狀體蛋白（EnROPs）的研究尚未見報道。本課題組在前期對毒害艾美耳球蟲未孢子化卵囊、子孢子和第二代裂殖子的轉(zhuǎn)錄組和蛋白組關(guān)聯(lián)分析時發(fā)現(xiàn)有68個蛋白與蟲體入侵相關(guān)，其中4個為EnROPs^［4］。本研究選擇其中的EnROP30，對其基因進行克隆表達，并用重組EnROP30蛋白免疫雛雞，評價其免疫保護效果，旨在為雞球蟲病亞單位疫苗研制提供實驗依據(jù)，也為探析EnROP30在蟲體入侵宿主細(xì)胞過程中的作用奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 蟲株、菌株、質(zhì)粒與試驗動物

毒害艾美耳球蟲，由本實驗室經(jīng)單卵囊分離建株后每年傳代保存；毒害艾美耳球蟲子孢子、第二代裂殖子，由本實驗室分離保存；大腸桿菌DH5α、BL21（DE3）購自全式金生物科技有限公司；克隆載體pGEM-T-Easy購自美國普洛麥格公司；表達載體pET28a（+）購自英杰公司；5周齡BALB/c雌鼠購自揚州大學(xué)比較醫(yī)學(xué)中心；剛出殼的黃羽雞購自江蘇省揚州市立華畜禽有限公司。本項研究中所有試驗方案符合揚州大學(xué)動物倫理、福利等相關(guān)條例規(guī)定，符合江蘇省科技廳動物福利保護條例，許可證編號：SCXK（蘇）2021-0013。

1.2 主要試劑

Taq DNA聚合酶、T4 DNA連接酶、SacⅠ和NotⅠ限制性DNA內(nèi)切酶、DL5000 DNA Marker、10×Loading Buffer均購自寶生物工程有限公司；RNA提取試劑盒、BCA蛋白定量試劑盒均購自南京諾唯贊生物科技公司；膠回收試劑盒、質(zhì)粒小提試劑盒均購自全式金生物科技有限公司；非預(yù)染蛋白Marker、預(yù)染蛋白Marker均購自賽默飛生物有限公司；Ni-NTA親和層析純化柱購自南京金斯瑞生物科技有限公司；Quick Antibody-Mouse 3W快速佐劑購自蘇州博奧龍科技有限公司；鼠源抗His標(biāo)簽單抗、FITC標(biāo)記羊抗鼠IgG、TMB顯色液均購自上海碧云天生物技術(shù)有限公司；HRP標(biāo)記的兔抗鼠IgG購自BIO BASIC公司；HRP標(biāo)記的羊抗雞IgG購自Abbkine公司；ECL化學(xué)發(fā)光試劑購自上海天能科技有限公司；NC膜購自默克公司；SYBR Green Master mix熒光定量試劑盒購自Roche公司；雞抗毒害艾美耳球蟲康復(fù)血清、雞抗球蟲陰性血清均由本實驗室制備；透析袋（MW：14 000）購自biosharp公司；弗氏完全佐劑、弗氏不完全佐劑均購自默克公司；PEG8000購自BBI公司；胃蛋白酶（Pepsin 1∶3 000）購自Biofroxx公司。

1.3 EnROP30基因的擴增與克隆

根據(jù)GenBank數(shù)據(jù)庫中所提供的毒害艾美耳球蟲Houghton株棒狀體的核苷酸序列信息（XM_013577274.1），用Primer5.0設(shè)計引物，上游引物：5′-ATGAGACTTCTTCTGTTTCTGGCGG-3′，下游引物：5′-TCAGGCCTCCGCCTTGG-3′，預(yù)計擴增片段為1 605 bp左右。引物由華大基因生物公司合成。根據(jù)RNA提取和反轉(zhuǎn)錄試劑盒說明書，提取第二代裂殖子總RNA并測定濃度，逆轉(zhuǎn)錄總RNA為cDNA，PCR擴增EnROP30基因。PCR產(chǎn)物經(jīng)1％瓊脂糖凝膠電泳后，用QIA quick瓊脂糖回收試劑盒回收，將目的片段與pGEM-T-Easy載體連接，用常規(guī)方法轉(zhuǎn)化感受態(tài)大腸桿菌DH5α，藍白斑法篩選陽性克隆。挑選陽性克隆菌落，提取重組質(zhì)粒，經(jīng)SacⅠ和NotⅠ雙酶切鑒定后送華大基因科技股份有限公司測序。

1.4 EnROP30基因的序列分析

用DNAStar的Editseq軟件翻譯EnROP30基因序列，用ProtParam在線分析EnROP30蛋白的理化性質(zhì)，用SignalP-5.0軟件預(yù)測EnROP30蛋白信號肽，用TMHMM-2.0在線分析EnROP30蛋白的跨膜區(qū)，用NCBI的CDD分析EnROP30蛋白的保守結(jié)構(gòu)域，用cNLS Mapper在線網(wǎng)站分析EnROP30蛋白的核定位序列，用SOPMA工具分析EnROP30蛋白的二級結(jié)構(gòu)，用WoLF PSORT在線網(wǎng)站預(yù)測EnROP30蛋白的亞細(xì)胞結(jié)構(gòu)定位，用MegAlign軟件對比EnROP30蛋白氨基酸序列與GenBank數(shù)據(jù)庫中關(guān)聯(lián)蛋白的同源性。

1.5 EnROP30基因原核表達載體的構(gòu)建

用SignalP-5.0在線預(yù)測EnROP30基因編碼的信號肽序列并去除。根據(jù)質(zhì)粒pET28a（+）上的多克隆位點，選擇Sac Ⅰ和Not Ⅰ兩個限制性DNA酶切位點，并設(shè)計合成用于擴增目的基因的特異性引物。上游引物：5′-CGCGGATCCGAATT-CGAGCTCATGCACCCACCGCCACAG-3′，下游引物：5′-TGGTGGTGCTCGAGTGCGGCCGCTC-AGGCCTCCGCCTTGGC-3′。下劃線處分別為Sac Ⅰ和Not Ⅰ酶切位點。將重組質(zhì)粒作為PCR擴增的模板，回收目的片段。同時對表達載體pET28a（+）和目的片段分別進行Sac Ⅰ和Not Ⅰ雙酶切。用T4 DNA連接酶于16 ℃過夜連接酶切后的目的片段和表達載體，構(gòu)建重組表達載體pET28a（+）-EnROP30并轉(zhuǎn)化至BL21（DE3）。經(jīng)過卡那霉素抗性篩選和Sac Ⅰ和Not Ⅰ雙酶切鑒定后，將陽性質(zhì)粒送華大基因科技股份有限公司測序。

1.6 重組蛋白rEnROP30的誘導(dǎo)表達、純化與鑒定

取過夜復(fù)蘇后的陽性克隆菌株，將其轉(zhuǎn)種至含100 μg·mL^-1卡那霉素的LB培養(yǎng)基中37 ℃培養(yǎng)2 h后，加入1 mmol·L^-1 IPTG，37 ℃誘導(dǎo)4 h。離心收集誘導(dǎo)后的菌體，加入PBS重懸后置于冰浴中超聲裂解，離心后取等量上清液和用PBS重懸后的沉淀液進行12% SDS-PAGE分析，檢測重組蛋白的表達情況。收集500 mL誘導(dǎo)后的重組菌液，洗滌并重懸菌體，經(jīng)超聲裂解，收集上清獲得大量重組蛋白。將上清轉(zhuǎn)移至Ni-NTA親和層析柱中，用洗脫液對重組蛋白進行純化，收集純化過程中不同操作下得到的蛋白溶液，用紫外分光光度計檢測蛋白濃度后，進行12% SDS-PAGE鑒定。

將誘導(dǎo)表達或純化的重組蛋白、轉(zhuǎn)化pET28a（+）空質(zhì)粒的菌體蛋白以及未轉(zhuǎn)化的BL21菌體蛋白進行12% SDS-PAGE電泳，將蛋白轉(zhuǎn)印至NC膜上，用5%脫脂奶37 ℃封閉2 h，以鼠抗His標(biāo)簽單抗（1∶10 000）和雞抗毒害艾美耳球蟲陽性血清（1∶200）為一抗，4 ℃過夜孵育，以HRP標(biāo)記的兔抗鼠IgG和羊抗雞IgG（1∶20 000）為二抗，37 ℃孵育1 h，在避光條件下向NC膜表面滴加ECL顯色1～2 min后，用天能52000化學(xué)發(fā)光成像系統(tǒng)觀察結(jié)果并掃描拍照。

1.7 重組蛋白rEnROP30多克隆抗體的制備

將純化的重組蛋白rEnROP30與佐劑Quick Antibody-Mouse 3W按體積比1∶1混勻，按每只鼠20 μg·（100 μL）^-1劑量注射6周齡BALB/c雌鼠的后肢小腿肌肉，同時設(shè)置未免疫小鼠作為陰性對照。首次免疫后第14天，按照相同方式和劑量進行加強免疫。二次免疫后第7天，通過小鼠眼眶后靜脈叢采集血液，分離血清。采用間接ELISA法測定血清抗體滴度，用酶標(biāo)儀測定OD450 nm吸光值，以陽性血清大于陰性血清2.1倍的最大稀釋倍數(shù)為血清的效價。

1.8 多克隆抗體檢測蟲體天然EnROP30蛋白及蟲體定位

用冰浴超聲裂解法分別提取子孢子和第二代裂殖子蛋白。用BCA蛋白定量試劑盒測定蛋白濃度后，按比例稀釋子孢子和第二代裂殖子總蛋白濃度至4.5 μg·μL^-1，然后以每泳道5 μL的上樣量進行12% SDS-PAGE電泳，再轉(zhuǎn)印到NC膜上，以鼠抗重組蛋白多克隆抗體為一抗（1∶150），以HRP標(biāo)記的兔抗鼠IgG（1∶20 000）為二抗，Western blot檢測蟲體天然EnROP30蛋白。

取適量的毒害艾美耳球蟲子孢子和第二代裂殖子分別涂布于載玻片，滴加40 mL·L^-1甲醇固定15 min；PBST洗滌3次后滴加20 mL·L^-1的Triton X-100，室溫作用10 min；用PBST洗滌3次后置于含30 g·L^-1 BSA的封閉液中，37 ℃封閉3 h；加鼠抗重組蛋白多克隆抗體（1∶100），在濕盒內(nèi)37 ℃孵育1 h；PBST洗5次后，滴加FITC標(biāo)記的山羊抗小鼠IgG（1∶100）二抗，在濕盒內(nèi)37 ℃孵育1 h；PBST洗3次后待載玻片自然晾干，滴加抗熒光淬滅封片液（含DAPI），蓋玻片封片；用超高分辨率激光共聚焦顯微鏡（Leica TCS SP8 STED，Germany）觀察結(jié)果并拍照保存。

1.9 EnROP30基因轉(zhuǎn)錄水平的分析

用qRT-PCR方法對EnROP30基因在子孢子和第二代裂殖子發(fā)育階段的轉(zhuǎn)錄水平進行檢測。用Oligo 7.0軟件設(shè)計引物，上游引物：5′-GACCAACAAGGCGGCGAAGAC-3′，下游引物：5′-CAAGCCAGTCACATCCACCACAC-3′。以毒害艾美耳球蟲5.8S rRNA作為內(nèi)參基因，設(shè)計特異性引物，上游引物：5′-TTCATACTGCGTCT-AATGCACC-3′；下游引物：5′-CGAGTCCCTACC-GCAGTACTA-3′。采用SYBR Green Master Mix熒光定量試劑盒進行定量分析。每個樣品設(shè)置3個重復(fù)，記錄每個基因在不同樣品中表達的Ct值，運用近似值法2^-ΔΔCt計算基因的轉(zhuǎn)錄水平差異。用t檢驗分析兩組間差異性（P＜0.01）。

1.10 重組蛋白rEnROP30的免疫保護力評價

1.10.1 試驗設(shè)計和免疫程序

試驗設(shè)計和免疫程序見表1。共設(shè)5個組，其中3個免疫組，2個對照組，即未免疫攻蟲組和未免疫未攻蟲組，每組10只雞。免疫組和未免疫攻蟲組分別感染毒害艾美耳球蟲孢子化卵囊2.5×104·只^-1，攻蟲后第8天結(jié)束試驗。攻蟲后144 h，用飽和鹽水漂浮法檢查糞便卵囊，出現(xiàn)卵囊后每隔12 h分別收集各試驗組雞的全部糞便進行卵囊計數(shù)，直至試驗結(jié)束；試驗結(jié)束時收集盲腸內(nèi)容物和刮取盲腸黏膜，用1.5%的胃蛋白酶溶液消化后進行卵囊計數(shù)。

1.10.2 免疫保護效果評價指標(biāo)

根據(jù)文獻［5-7］中方法，采用多個指標(biāo)來評價重組蛋白rEnROP30的免疫保護效果，包括成活率、平均增重、相對增重率、卵囊減少率、病變記分和抗球蟲指數(shù)（ACI）。ACI值的計算參考默克公司^［6］的方法，公式為ACI=（存活率+相對增重率）－（病變值+卵囊值）。其中，相對增重率為相對增重率2的數(shù)值。病變值為每組雞腸道病變記分的平均值×10。卵囊值的計算參考索勛、李國清^［7］的方法，即根據(jù)卵囊比值的不同范圍（0～1、1～25、26～50、51～75、76～100），分別賦值為0、5、10、20和40。

1.11 統(tǒng)計分析

使用IBM SPSS Statistics 26軟件對數(shù)據(jù)進行統(tǒng)計分析。首先對各試驗組的平均增重和病變記分進行單因素方差分析，以確定組間差異是否具有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）。然后對數(shù)據(jù)進行描述性統(tǒng)計分析，計算各組的均值和標(biāo)準(zhǔn)差。最后采用鄧肯氏新復(fù)極差法對組間均值進行多重比較，以確定具體的組間差異。所有數(shù)據(jù)均以“平均值±標(biāo)準(zhǔn)差”的形式表示。

2 結(jié) 果

2.1 EnROP30基因的序列及序列分析

以第二代裂殖子總RNA為模板，進行RT-PCR擴增。電泳結(jié)果顯示，擴增產(chǎn)物的片段大小約為1 605 bp，與預(yù)期相符（圖1）。測序與序列分析結(jié)果顯示，該基因全長1 605 bp，編碼534個氨基酸，相對分子質(zhì)量為55.55 ku，前18個氨基酸組成信號肽，無跨膜區(qū)，等電點為9.4，屬于堿性親水蛋白。

用NCBI的CDD數(shù)據(jù)庫和cNLS Mapper網(wǎng)站分別進行保守結(jié)構(gòu)域分析和核定位序列分析，發(fā)現(xiàn)該蛋白含有一個蛋白激酶催化結(jié)構(gòu)域（320～513 aa）和一個C末端的核定位信號序列（501～530 aa），在該結(jié)構(gòu)域中存在一個典型的“雙葉”蛋白激酶折疊結(jié)構(gòu)（337～461 aa）。二級結(jié)構(gòu)預(yù)測顯示，多肽鏈中存在α-螺旋、β-轉(zhuǎn)角、無規(guī)卷曲等結(jié)構(gòu)。用WoLF PSORT進行亞細(xì)胞結(jié)構(gòu)定位預(yù)測，結(jié)果顯示該蛋白極可能定位于細(xì)胞外基質(zhì)。獲得序列與GenBank中Houghton株的序列（XM_013 577 274.1）比對，相似性為99.5%。

2.2 原核表達載體的驗證

構(gòu)建的重組表達質(zhì)粒經(jīng)雙酶切鑒定（圖2）和測序分析，結(jié)果表明連接到載體上的基因片段大小與預(yù)期相符，證明重組表達質(zhì)粒pET28a（+）-EnROP30構(gòu)建成功，可用于后續(xù)蛋白表達。

2.3 重組蛋白rEnROP30的表達與純化

將成功構(gòu)建的重組表達質(zhì)粒pET28a（+）-EnROP30轉(zhuǎn)化至宿主菌BL21（DE3）中，重組菌經(jīng)IPTG誘導(dǎo)后進行12% SDS-PAGE分析，電泳結(jié)果顯示重組蛋白rEnROP30大小約為65 ku，與預(yù)期相符，主要以可溶形式表達（圖3）。

為了進一步確定蛋白表達的正確性，設(shè)置2個對照組：轉(zhuǎn)化pET28a（+）空載體的BL21菌和未轉(zhuǎn)化的BL21菌，在相同條件下誘導(dǎo)表達，結(jié)果在對照組的裂解物中均未檢測到與目的蛋白大小相符的特異性條帶。表達的重組蛋白經(jīng)Ni-NTA親和層析柱純化后達0.5 mg·mL^-1（圖4）。

2.4 重組蛋白rEnROP30的Western blot鑒定

Western blot檢測結(jié)果顯示，rEnROP30能被鼠抗His標(biāo)簽單抗和雞抗毒害艾美耳球蟲血清特異性識別（圖5），且大小與預(yù)期相符，顯示EnROP30基因在體外成功表達。

2.5 鼠抗重組蛋白的血清效價

采集BALB/c小鼠血清，用間接ELISA法測定多克隆抗體效價。當(dāng)陽性血清初始稀釋倍數(shù)為1∶200時，OD450 nm值可達2.1。隨著稀釋倍數(shù)的增加，在1∶102 400的稀釋度下，陽性血清的OD450 nm值仍為陰性血清2.1倍以上，故陽性血清抗體效價為1∶102 400，顯示重組蛋白有良好的免疫原性。

2.6 天然蛋白的檢測及蟲體定位

以重組蛋白rEnROP30小鼠多克隆抗體為一抗進行Western blot分析，在子孢子和第二代裂殖子中均出現(xiàn)一條相對分子質(zhì)量約為62 ku的特異性條帶，該條帶在子孢子中顯現(xiàn)微弱，表明EnROP30蛋白在這2個階段均有表達且表達量不同（圖6A）。以小鼠陰性血清為一抗未檢出相應(yīng)的條帶（圖6B）。

用重組蛋白rEnROP30小鼠多克隆抗體進行間接免疫熒光定位分析，結(jié)果顯示EnROP30蛋白主要分布在子孢子和第二代裂殖子的頂端（圖7）。

2.7 EnROP30基因轉(zhuǎn)錄水平的分析

qRT-PCR結(jié)果如圖8所示，EnROP30基因在第二代裂殖子階段的轉(zhuǎn)錄水平顯著高于子孢子（P＜0.05）。

2.8 重組蛋白的免疫保護力

2.8.1 臨床觀察與成活率

除未免疫未攻蟲組外，各組雞在攻蟲后約96 h，開始出現(xiàn)明顯的臨床癥狀，包括精神萎靡、食欲下降、羽毛松亂等。約120 h出現(xiàn)血便，144～180 h血便情況最嚴(yán)重，180 h后各組雞整體狀態(tài)開始好轉(zhuǎn)，血便減少。192 h剖殺時仍有血便排出，但整體數(shù)量不斷減少。未免疫未攻蟲組雞未出現(xiàn)任何癥狀。在整個試驗期間，各組均未出現(xiàn)雞只死亡的情況，成活率為100%。

2.8.2 平均增重與相對增重率

由表2可見，平均增重1結(jié)果顯示，各免疫組與對照組之間無統(tǒng)計學(xué)上的顯著差異（P＞0.05），表明疫苗免疫本身并未對雞只的正常生長發(fā)育產(chǎn)生明顯影響，免疫操作的安全性得到初步驗證。平均增重2結(jié)果顯示，各免疫組增重均高于未免疫攻蟲組，低于未免疫未攻蟲組。rEnROP30中劑量組相對增重率最高。

2.8.3 病變記分、卵囊產(chǎn)量與卵囊減少率

結(jié)果見表3。比較各組腸道剖檢結(jié)果，發(fā)現(xiàn)各免疫組的平均腸道病變記分普遍低于未免疫攻蟲組，其中rEnROP30高劑量組病變記分最低，且與未免疫攻蟲組之間存在統(tǒng)計學(xué)上的差異顯著（P＜0.05）。在卵囊產(chǎn)量方面，未免疫攻蟲組的總卵囊產(chǎn)量最高，平均每羽為3.59×106個卵囊。rEnROP30中劑量組總卵囊產(chǎn)量最低，平均每羽為1.18×106個卵囊，卵囊減少率為66.87%。

2.8.4 ACI值

結(jié)果見表4。rEnROP30中劑量組ACI值最高（158.96），接近抗球蟲中效水平。rEnROP30高劑量組與低劑量組的ACI值相近，屬抗球蟲低效水平。非免疫攻蟲組的ACI值為108.34，小于120。

3 討 論

ROPs是一類廣泛存在于頂復(fù)門原蟲中的重要蛋白，在蟲體入侵宿主細(xì)胞、形成納蟲空泡以及干擾宿主細(xì)胞功能等過程中發(fā)揮關(guān)鍵作用^［8-10］。Roger等^［11］發(fā)現(xiàn)惡性瘧原蟲棒狀體相關(guān)蛋白RAP1和RAP2位于棒狀體細(xì)胞器中，參與裂殖子入侵過程^［12］。大多數(shù)ROPs具有一個位于N端的分泌信號序列和一個蛋白激酶結(jié)構(gòu)域，其分子量通常為40～60 ku^［13-14］。ROPs在激酶結(jié)構(gòu)域中存在特異的保守模式，即在激酶底物結(jié)合區(qū)周圍具有一個“雙葉”結(jié)構(gòu)，該結(jié)構(gòu)能結(jié)合ATP或GTP供體分子，協(xié)助磷酸基團從ATP轉(zhuǎn)移到含有羥基的氨基酸側(cè)鏈上，從而調(diào)節(jié)蛋白激酶的催化活性，因此這一結(jié)構(gòu)特征是識別和鑒定ROPs家族成員的重要線索^［15］。此外，王炳祥^［16］發(fā)現(xiàn)EtROP30是唯一同時擁有分泌信號肽和核定位序列的柔嫩艾美耳球蟲ROPs，表明EtROP30蛋白可能是一種分泌蛋白，且能通過核定位序列介導(dǎo)進入宿主細(xì)胞核從而發(fā)揮調(diào)控宿主細(xì)胞的作用^［17］。弓形蟲的TgROP16和TgROP30蛋白序列中也存在核定位信號序列，進入宿主細(xì)胞核后能與STAT3和STAT6等轉(zhuǎn)錄因子互作并使后者發(fā)生磷酸化修飾，導(dǎo)致宿主細(xì)胞免疫反應(yīng)相關(guān)基因的表達下調(diào)，從而抑制宿主細(xì)胞的正常免疫功能^{［13，18］}。本文克隆的毒害艾美耳球蟲EnROP30基因全長為1 605 bp，編碼534個氨基酸，其蛋白結(jié)構(gòu)中含有一個蛋白激酶催化結(jié)構(gòu)域（320～513 aa）和一個位于C末端的核定位信號序列（501～530 aa），在該催化結(jié)構(gòu)域中存在一個典型的“雙葉”蛋白激酶折疊結(jié)構(gòu)（337～461 aa）。這些結(jié)構(gòu)特征表明EnROP30蛋白屬于ROPs家族中的蛋白激酶，但該蛋白能否進入宿主細(xì)胞核調(diào)控宿主細(xì)胞的功能還有待進一步研究。

EnROP30基因經(jīng)原核表達獲得的重組蛋白rEnROP30分子質(zhì)量大小約為65 ku，比預(yù)期大9 ku左右，其原因可能是重組蛋白包含了6個His標(biāo)簽肽段，加上重組蛋白存在α-螺旋于β-轉(zhuǎn)角等空間結(jié)構(gòu)，影響了其在SDS-PAGE中的遷移率。Western blot檢測子孢子和第二代裂殖子中的EnROP30天然蛋白，發(fā)現(xiàn)第二代裂殖子中的目的蛋白條帶比子孢子的明顯清晰，顯示該基因在蟲體不同發(fā)育階段呈差異表達，這與本課題組前期轉(zhuǎn)錄組和蛋白組關(guān)聯(lián)分析結(jié)果相一致^［4］。Western blot檢測出的EnROP30天然蛋白分子質(zhì)量為62 ku，較該基因的推導(dǎo)蛋白質(zhì)相對分子質(zhì)量（55.55 ku）要大6 ku左右，重復(fù)兩次試驗的結(jié)果一致，究其原因可能是蛋白質(zhì)在翻譯后發(fā)生了糖基化等化學(xué)修飾的結(jié)果。

ROPs是由棒狀體基部分泌的一類蟲體入侵相關(guān)蛋白，是球蟲入侵宿主細(xì)胞的關(guān)鍵分子，因此可作為候選抗原用于亞單位疫苗的研制。Sonaimuthu等^［19］用弓形蟲ROP1重組蛋白免疫BALB/c小鼠，隨后免疫小鼠經(jīng)腹腔感染RH株速殖子，結(jié)果顯示免疫小鼠的存活時間較未免疫對照組顯著延長，存活率明顯提高，顯示重組蛋白ROP1對小鼠急性弓形蟲感染具有一定的免疫保護作用。石凱^［20］用構(gòu)建的隱孢子蟲棒狀體cgd82530蛋白sushi片段亞單位疫苗和核酸疫苗免疫ICR小鼠，結(jié)果顯示亞單位疫苗可有效誘導(dǎo)小鼠產(chǎn)生Th1/Th2混合型細(xì)胞免疫反應(yīng)，免疫小鼠對攻蟲能產(chǎn)生良好的免疫保護效果，其排卵囊量明顯減少，卵囊減少率高達89%。王炳祥^［16］用柔嫩艾美耳球蟲重組蛋白rEtROP30免疫雛雞，結(jié)果顯示rEtROP30能顯著減少雞重?fù)p失、減輕盲腸病變、降低卵囊產(chǎn)量。本研究通過動物試驗觀察了rEnROP30的免疫保護力，結(jié)果顯示rEnROP30按100 μg·羽^-1劑量的免疫保護效果最好，其相對增重率、卵囊減少率和綜合指標(biāo)ACI值均為最高（92.96%、66.87%、158.96）。rEnROP30按200 μg·羽^-1劑量免疫的雞腸道病變程度略低于100 μg·羽^-1劑量組，但其相對增重率（79.79%）、卵囊減少率（57.22%）和綜合指標(biāo)ACI值（146.29）均低于100 μg·羽^-1劑量組，顯示其免疫保護效果不如100 μg·羽^-1劑量。究其原因可能是：過高的抗原負(fù)荷可能導(dǎo)致免疫系統(tǒng)過度活躍，甚至出現(xiàn)免疫耐受，從而降低免疫應(yīng)答效果；此外，過高的抗原負(fù)荷還可能引發(fā)免疫抑制或組織損傷，從而影響試驗雞的生長發(fā)育。因此，雖然動物試驗顯示rEnROP30蛋白是一種較為理想的疫苗候選抗原，但其免疫劑量還有待重復(fù)驗證或進一步篩選。

4 結(jié) 論

成功克隆與原核表達了毒害艾美耳球蟲EnROP30基因，該基因編碼534個氨基酸，具有信號肽、蛋白激酶催化結(jié)構(gòu)域、核定位信號序列和“雙葉”蛋白激酶折疊結(jié)構(gòu)，無跨膜區(qū)；天然EnROP30蛋白分子質(zhì)量約為62 ku，定位在子孢子和第二代裂殖子的頂端；該基因在第二代裂殖子轉(zhuǎn)錄水平顯著高于子孢子。重組蛋白rEnROP30以每羽100 μg免疫劑量的保護效果最好，接近抗球蟲中效水平。

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（編輯 白永平）