紫花前胡苷對(duì)犬特應(yīng)性皮炎的療效分析

摘 要：" 犬特應(yīng)性皮炎（canine atopic dermatitis，CAD）是一種復(fù)雜的炎癥性皮膚病，與皮膚微生物組、免疫和皮膚屏障改變有關(guān)。紫花前胡苷（nodakenin，NK）是一種具有抗炎、抗菌、抗氧化等作用的香豆素類糖苷。本研究旨在探究紫花前胡苷對(duì)2，4-二硝基甲苯（DNCB）誘導(dǎo)的犬特應(yīng)性皮炎的干預(yù)效果以及皮膚菌群的影響。首先建立DNCB誘導(dǎo)的犬特應(yīng)性皮炎，給與紫花前胡苷 14 d局部涂抹治療，通過體重指標(biāo)、血常規(guī)檢測(cè)、血清生化檢測(cè)、血清免疫球蛋白E（immunoglobulin E，IgE）含量、皮膚病變和瘙癢程度以及皮膚菌群16S rRNA測(cè)序結(jié)果來評(píng)估紫花前胡苷治療效果。結(jié)果顯示：與DNCB組相比，經(jīng)紫花前胡苷治療后犬的體重明顯上升，血常規(guī)指標(biāo)中白細(xì)胞總數(shù)和中性粒細(xì)胞百分比顯著提高（P＜0.05），而血清生化相關(guān)指標(biāo)無顯著差異（P＞0.05），血清中IgE含量顯著下降（P＜0.05），皮膚病變和瘙癢程度均顯著改善（P＜0.01）。皮膚菌群中的α多樣性和β多樣性均存在顯著差異（P＜0.05），在門水平上，紫花前胡苷治療后顯著恢復(fù)了厚壁菌門（Firmicutes）的相對(duì)豐度（P＜0.01）。在屬水平上，紫花前胡苷治療后顯著增加了羅姆布茨菌屬（Romboutsia）、狹義梭菌屬（Clostridium_sensu_stricto_1）和土孢桿菌屬（Terrisporobacter）的相對(duì)豐度（P＜0.01，P＜0.05），顯著降低了莫拉菌屬（Moraxella）和葡萄球菌屬（Staphylococcus）相對(duì)豐度（P＜0.05）。涂抹紫花前胡苷能夠有效減輕犬皮損程度、緩解皮膚瘙癢情況、降低血清IgE含量以及調(diào)節(jié)皮膚菌群失衡，從而改善犬特應(yīng)性皮炎的癥狀，為CAD的藥物研發(fā)提供新思路。

關(guān)鍵詞： 紫花前胡苷；2，4-二硝基氯苯；犬特應(yīng)性皮炎；皮膚菌群

中圖分類號(hào)：S853.74

文獻(xiàn)標(biāo)志碼：A"""" 文章編號(hào)： 0366-6964（2025）03-1453-12

收稿日期：2024-04-24

基金項(xiàng)目：青島農(nóng)業(yè)大學(xué)高層次人才科研啟動(dòng)基金（1121021）

作者簡(jiǎn)介：王子姣（1998-），女，山東青島人，碩士生，主要從事寵物營(yíng)養(yǎng)與健康研究，E-mail：wzjdgg1022@163.com

*通信作者：李光玉，主要從事動(dòng)物營(yíng)養(yǎng)與健康研究，E-mail：tcslgy@126.com

Analysis of the Efficacy of Nodakenin in Canine Atopic Dermatitis

WANG" Zijiao， LIU" Chunxiao， LI" Guangyu^*

（College of Animal Science and Technology， Qingdao Agricultural University， Qingdao 266109，" China）

Abstract：" Canine atopic dermatitis （CAD） is a complex inflammatory skin disease associated with alterations in the skin microbiota， immunity and skin barrier. Nodakenin is a coumarin glycoside with anti-inflammatory， antimicrobial and antioxidant properties. The aim of this study was to investigate the intervention effect of Nodakenin on 2，4-dinitrotoluene （DNCB）-induced canine atopic dermatitis as well as the effect of skin microbiota. DNCB-induced canine atopic dermatitis was first established， and nodakenin was administered for 14 days as a topical application treatment. The effect of nodakenin treatment was assessed by body weight indexes， routine blood tests， serum biochemical tests， serum immunoglobulin E （IgE） levels， the degree of skin lesions and itching， and the results of 16S rRNA sequencing of skin microbiota. Compared with the DNCB group， the nodakenin group showed a significant increase in body weight， a significant increase in the total number of leukocytes and the percentage of neutrophils in the routine blood indexes （Plt;0.05）， while there was no significant difference in the serum biochemical related indexes （Pgt;0.05）， a significant decrease in the serum IgE content （Plt;0.05）， and a significant improvement in the degree of skin lesions and itching （Plt;0.01）. There were significant differences in both alpha diversity and beta diversity in the skin microbiota （Plt;0.05）， and at the phylum level， the relative abundance of the thick-walled phylum Firmicutes was significantly restored after nodakenin treatment （Plt;0.01）. At the genus level， nodakenin treatment significantly increased the relative abundance of Romboutsia， Clostridium_sensu_stricto_1， and Terrisporobacter （Plt;0.01 and Plt;0.05， respectively） and significantly decreased the relative abundance of Moraxella and Staphylococcus spp. relative abundance （Plt;0.05）. The application of nodakenin can effectively reduce the degree of skin lesions， alleviate itchy skin， reduce serum IgE levels， and regulate the imbalance of skin microbiota， thus improving the symptoms of canine atopic dermatitis and providing a new idea for drug development for CAD.

Keywords： nodakenin; 2，4-dinitrochlorobenzene（DNCB）; canine atopic dermatitis; skin microbiota

*Corresponding author：" LI Guangyu， E-mail： tcslgy@126.com

犬特應(yīng)性皮炎（canine atopic dermatitis，CAD）是一種主要由T細(xì)胞驅(qū)動(dòng)的復(fù)雜炎癥性皮膚病，具有遺傳性，涉及皮膚屏障異常、過敏原致敏和微生物菌群失調(diào)之間的相互作用^［1-2］。目前，CAD已經(jīng)成為最普遍、最令犬痛苦的慢性和過敏性皮膚病之一，影響20%～30%的犬^［3］。CAD在臨床診斷中十分常見，除了會(huì)損害犬的身體健康，還會(huì)增加其主人的精神壓力和經(jīng)濟(jì)負(fù)擔(dān)，對(duì)患病犬及其主人的生活質(zhì)量產(chǎn)生負(fù)面影響，并且通常需要終身治療^［4-5］。CAD常見且具有臨床意義的特征是中度至重度瘙癢，常伴有皮膚病學(xué)病變，如紅斑、自身脫發(fā)、脫皮、色素沉著過度和苔蘚樣變^［6-8］。CAD目前尚無治愈的基本方法，相關(guān)癥狀只能緩解，避免病情反復(fù)發(fā)作，市面上治療CAD的藥物主要包含皮質(zhì)類固醇、抗組胺藥、鈣調(diào)磷酸酶抑制劑和免疫抑制劑等，但長(zhǎng)時(shí)間使用這些藥物會(huì)產(chǎn)生多種不良反應(yīng)^［9-11］。因此，天然化合物因其安全性和對(duì)免疫系統(tǒng)的活性而作為現(xiàn)有治療劑的替代藥物而受到關(guān)注。天然產(chǎn)物紫花前胡苷（nodakenin，NK）是一種呋喃香豆素類糖苷，最初從中國(guó)傳統(tǒng)藥材獨(dú)活（Radix Angelicae biseratae）的根中分離出來，具有抗炎、抗氧化、抗菌的作用^［12-13］。先前的研究表明，紫花前胡苷改善了小鼠特應(yīng)性皮炎樣皮膚病變的癥狀，并通過激活NF-κB和Caspase-1抑制肥大細(xì)胞介導(dǎo)的過敏性炎癥^［14-15］。盡管有這些研究，但是尚未報(bào)道紫花前胡苷對(duì)CAD的作用及其對(duì)皮膚菌群的調(diào)節(jié)。因此本研究使用2，4-二硝基甲苯（DNCB）建立犬特應(yīng)性皮炎（CAD）模型來探究紫花前胡苷對(duì)CAD的治療效果以及對(duì)皮膚菌群的影響。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

12只2～3歲健康比格犬，來自中國(guó)青島即墨畜牧實(shí)驗(yàn)場(chǎng)。比格犬飼養(yǎng)在條件溫度（18～22 ℃）和濕度（40%～70%）相對(duì)穩(wěn)定，晝夜交替照明12 h的普通級(jí)動(dòng)物飼養(yǎng)室。由國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)顆粒飼料進(jìn)行喂養(yǎng)，比格犬自由采食，自由飲水、每天有專業(yè)飼養(yǎng)員打掃犬舍。

1.1.2 藥物與試劑

DNCB（Sigma公司，BCCJ4545）與基質(zhì)（丙酮∶橄欖油=3∶1）配成的5%、0.25%的DNCB溶液，常溫避光保存；DMSO（北京索萊寶生物科技有限公司）；卡波姆908（路博潤(rùn)公司）；脫毛膏（中國(guó)薇姿有限公司）；紫花前胡苷（純度≥98%，武漢天植生物技術(shù)有限公司）；血清生化試劑盒（蘇州格銳思生物科技有限公司）；IgE ELISA試劑盒（江蘇酶免實(shí)業(yè)有限公司）。

1.2 方法

1.2.1 分組與模型制備

適應(yīng)性喂養(yǎng)7 d，將12只比格犬分為對(duì)照組（Ctrl）、模型組（DNCB）、治療組（DNCB+NK），每組4只犬。

借鑒肖曉杰等^［16］的造模方法，并進(jìn)行了改良。采用DNCB半抗原反復(fù)刺激的方法建立犬AD模型。具體建模方法：于試驗(yàn)前1 d用電推剪在犬肩胛骨皮膚處剃毛，露出3塊“2 cm×2 cm”大小的皮膚，在3塊皮膚上涂少量脫毛膏，將絨毛褪凈，用紙巾擦拭干凈。試驗(yàn)第1天在每塊皮膚均勻皮下注射10 μL 5%DNCB，第5天再次在每塊皮膚均勻皮下注射10 μL 5%DNCB進(jìn)行二次致敏。第10、13、16、17、20、23天改用0.25%DNCB涂抹于每塊皮膚進(jìn)行激發(fā)，每塊皮膚60 μL，即隔2 d刺激一次，兩周6次。試驗(yàn)全程不為犬提供沐浴，本試驗(yàn)以3R原則為本，全程為犬提供人道主義關(guān)懷。本試驗(yàn)經(jīng)青島農(nóng)業(yè)大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物倫理委員會(huì)審批，倫理審查批號(hào)DKY20230817。

1.2.2 給藥方法

從第10天開始在犬3塊“2 cm×2 cm”皮膚區(qū)域以凝膠涂抹方式進(jìn)行為期14 d的治療。在第10、13、16、17、20、23天涂完DNCB 2 h之后再涂藥治療。紫花前胡苷使用濃度參考文獻(xiàn)［14］。將紫花前胡苷用DMSO稀釋為20 mmol·L^-1，取10 g 0.5%的卡波姆凝膠與40 μL 20 mmol·L^-1紫花前胡苷混合均勻。對(duì)照組和模型組給予同體積的卡波姆凝膠作為安慰劑。

1.2.3 體重變化

試驗(yàn)全程每隔7 d，在每只犬空腹?fàn)顟B(tài)下準(zhǔn)確稱重，并記錄。

1.2.4 血常規(guī)

試驗(yàn)結(jié)束時(shí)，于犬空腹?fàn)顟B(tài)下，在每只犬前肢靜脈采集2 mL血液置于含有EDTA的抗凝管中。利用全自動(dòng)血常規(guī)分析儀（桂林優(yōu)利特醫(yī)療電子有限公司）檢測(cè)血常規(guī)，檢測(cè)指標(biāo)：白細(xì)胞總數(shù)（WBC）、淋巴細(xì)胞數(shù)量（LYM）、單核細(xì)胞數(shù)量（MON）、中性粒細(xì)胞數(shù)量（NEU）、嗜酸性粒細(xì)胞數(shù)量（EOS）、嗜堿性粒細(xì)胞數(shù)量（BAS）、淋巴細(xì)胞百分比（LYM%）、單核細(xì)胞百分比（MON%）、中性粒細(xì)胞百分比（NEU%）、嗜酸性粒細(xì)胞百分比（EOS%）、嗜堿性粒細(xì)胞百分比（BAS%）、紅細(xì)胞總數(shù)（RBC）、血紅蛋白濃度（HGB）、紅細(xì)胞壓積（HCT）、平均紅細(xì)胞體積（MCV）、平均紅細(xì)胞血紅蛋白含量（MCH）、平均紅細(xì)胞血紅蛋白濃度（MCHC）、紅細(xì)胞體積分布寬度變異系數(shù)（RDWc）、血小板總數(shù)（PLT）。

1.2.5 血清生化指標(biāo)

試驗(yàn)結(jié)束時(shí)，在犬空腹?fàn)顟B(tài)下，于每只犬的前肢靜脈處采集5 mL血液于促凝管中，然后3 500 r·min^-1離心5 min取上層血清，-80 ℃條件下凍存待測(cè)。檢測(cè)丙氨酸氨基轉(zhuǎn)氨酶（ALT）、天冬氨酸氨基轉(zhuǎn)氨酶（AST）、肌酐（CRE）、白蛋白（ALB）、堿性磷酸酶（AKP）、葡萄糖（GLU）、血中γ-谷氨酰轉(zhuǎn)移酶（γ-GT）、鈣含量（Ca）指標(biāo)。

1.2.6 ELISA檢測(cè)犬血清IgE含量

從-80 ℃冰箱中取出血清于冰上解凍，全程嚴(yán)格按照IgE ELISA試劑盒說明書進(jìn)行操作，顯色終止后立即上酶標(biāo)儀進(jìn)行吸光度檢測(cè)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，利用標(biāo)準(zhǔn)曲線換算出IgE濃度。

1.2.7 犬皮膚病變程度評(píng)分和犬皮膚瘙癢評(píng)分

在第0、4、8、12、16、22天對(duì)每只犬皮膚進(jìn)行拍照觀察并評(píng)分，參考Bizikova等^［7］的方法對(duì)CAD皮膚病變進(jìn)行評(píng)分（表1）。借鑒肖曉杰等^［16］的方法在第0、4、8、12、16、22天對(duì)每只犬皮膚瘙癢次數(shù)進(jìn)行肉眼觀察并進(jìn)行評(píng)分（表2）。

1.2.8 皮膚菌群DNA提取和16S rRNA測(cè)序

試驗(yàn)第24天，將無菌拭子用0.9%氯化鈉溶液完全浸潤(rùn)，拭子與皮損部位成15°來回摩擦20 s，三組同一時(shí)間取樣，折取拭子頭置于凍存管中，擰緊蓋子，現(xiàn)場(chǎng)立即放入液氮中。皮膚菌群委托北京奧維森基因科技有限公司進(jìn)行16S rRNA生物多樣性測(cè)序，數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析在奧維森生信云平臺(tái)完成。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

數(shù)據(jù)采用Prism 8.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。計(jì)量資料以“平均值±標(biāo)準(zhǔn)差”表示，多組間比較采用單因素方差分析，兩組間比較采用t檢驗(yàn)。P＜0.05即認(rèn)為具有顯著差異，P＜0.01為極顯著。

2 結(jié) 果

2.1 紫花前胡苷治療犬的增重、血常規(guī)和血清生化指標(biāo)的變化

為了探究DNCB誘導(dǎo)的模型建立和紫花前胡苷治療對(duì)CAD體重的影響，比較了各組試驗(yàn)犬造模第0、7、14和21天時(shí)的體重。由表3結(jié)果顯示，"" 與0天的體重相比，試驗(yàn)第21天，Ctrl組犬體重呈上升趨勢(shì)，平均體重增加0.29 kg；DNCB組和DNCB+NK組犬體重分別減少0.41和0.26 kg，各組間無顯著性差異（P＞0.05）。

在試驗(yàn)最后一天，對(duì)各組犬采血并進(jìn)行血常規(guī)檢測(cè)，由表4可知，與Ctrl組相比，DNCB組白細(xì)胞總數(shù)極顯著下降（P＜0.01），中性粒細(xì)胞數(shù)量、中性粒細(xì)胞百分比顯著下降（P＜0.05）；單核細(xì)胞百分比極顯著升高（P＜0.01），經(jīng)紫花前胡苷治療后顯著提高了白細(xì)胞總數(shù)和中性粒細(xì)胞百分比（P＜0.05），且均在正常范圍內(nèi)。DNCB+NK組和DNCB組犬的紅細(xì)胞和血小板等其他血常規(guī)指標(biāo)無顯著差異（P＞0.05）如表5，與Ctrl組相比，DNCB組堿性磷酸酶（AKP）極顯著降低（P＜0.01），葡萄糖（GLU）含量顯著降低（P＜0.05）；經(jīng)紫花前胡苷治療后AKP和GLU含量均上升，但無顯著差異（P＞0.05）。

2.2 紫花前胡苷治療犬的血清IgE含量的變化

如圖1所示，與Ctrl組相比，DNCB組免疫球蛋白E（IgE）含量顯著升高（P＜0.05），升高了77.81%，提示機(jī)體發(fā)生過敏反應(yīng)。紫花前胡苷治療后，機(jī)體IgE含量顯著降低（P＜0.05），與DNCB組相比降低了85.22%。結(jié)果表明紫花前胡苷緩解了由DNCB誘導(dǎo)引起的機(jī)體過敏反應(yīng)。

2.3 紫花前胡苷治療犬的皮膚病變和瘙癢的變化

兩次致敏后DNCB組和DNCB+NK組皮膚均呈現(xiàn)明顯紅腫紅斑，并伴隨皮膚輕微糜爛。給藥第3天，DNCB組和DNCB+NK組皮膚持續(xù)性紅腫，苔蘚化逐漸加重，并伴有淡黃色炎性滲出物。與此同時(shí)，犬由于患處瘙癢，不斷抓撓刺激部位，誘發(fā)繼發(fā)感染，導(dǎo)致皮膚炎癥加重。給藥第7天時(shí)，DNCB組皮膚炎癥持續(xù)加重，部分皮膚流膿，DNCB+NK組部分區(qū)域結(jié)痂，癥狀相對(duì)減輕。給藥第14天時(shí)，與DNCB組相比，治療組癥狀明顯減輕（圖2）。皮膚病變?cè)u(píng)分和皮膚瘙癢評(píng)分由圖3所示，DNCB組在初次到最后一次激發(fā)，皮膚病變和皮膚瘙癢評(píng)分明顯升高，與Ctrl組相比具有極顯著差異（P＜0.001），給與紫花前胡苷治療第7和14天時(shí)，與DNCB組相比兩個(gè)評(píng)分均極顯著降低（P＜0.01）。

2.4 紫花前胡苷治療犬的皮膚菌群多樣性分析

皮膚菌群和宿主的動(dòng)態(tài)相互作用對(duì)宿主的健康至關(guān)重要。有研究表明，CAD通常會(huì)導(dǎo)致犬皮膚菌群失調(diào)，通過調(diào)節(jié)皮膚菌群可以改善CAD^［17-18］。通過對(duì)16S rRNA的數(shù)據(jù)進(jìn)行分析，由圖4所示，CTRL組和DNCB+NK組分別具有157和90個(gè)獨(dú)特的OTUs，而DNCB組具有249個(gè)獨(dú)特的OTUs。

Alpha多樣性通常用于反映微生物群落的豐富度和多樣性，指數(shù)一般包括Chao1、observed_species、PD whole tree和Shannon。Ctrl組、DNCB組和DNCB+NK組的皮膚菌群多樣性見圖5，與Ctrl組相比，DNCB組的PD whole tree指數(shù)顯著升高，表明DNCB組皮膚菌群豐富度增高，而與治療組相比，經(jīng)紫花前胡苷治療顯著降低了皮膚菌群豐富度。Chao1指數(shù)和observed_species指數(shù)顯示，與DNCB組相比，紫花前胡苷治療后顯著降低了皮膚微生物多樣性，均與Ctrl組趨于一致。結(jié)果表明紫花前胡苷可能通過影響皮膚微生物物種多樣性改善CAD皮膚菌群紊亂。Beta多樣性指生境間多樣性。主坐標(biāo)分析是一種非約束性的數(shù)據(jù)降維分析方法，可以用來研究樣本群落組成的相似性或差異性。由圖6所示，基于PCoA分析結(jié)果顯示DNCB組與Ctrl組及DNCB+NK組有明顯的差異。

2.5 紫花前胡苷治療犬的皮膚菌群組成的變化

根據(jù)分類學(xué)分析，為了分析皮膚微生物群的具體變化，本研究分析了門水平前10名和屬水平前20的相對(duì)豐度。如圖7，在門水平上分析發(fā)現(xiàn)，與Ctrl組相比，DNCB組厚壁菌門（Firmicutes）和變形菌門（Proteobacteria）相對(duì)豐度顯著降低，擬桿菌門（Bacteroidetes）和梭桿菌門（Fusobacteria）相對(duì)豐度顯著升高，經(jīng)紫花前胡苷治療后，極著提高Firmicutes相對(duì)豐度。

如圖8，在屬水平上分析發(fā)現(xiàn)，與Ctrl組相比，DNCB組顯著降低羅姆布茨菌屬（Romboutsia）、蘇黎世桿菌屬（Turicibacter）相對(duì)豐度，顯著增加葡萄球菌屬（Staphylococcus）相對(duì)豐度，經(jīng)紫花前胡苷給藥治療后極顯著增加Romboutsia、狹義梭菌屬（Clostridium_sensu_stricto_1）和土孢桿菌屬（Terrisporobacter）相對(duì)豐度，顯著降低莫拉菌屬（Moraxella）和葡萄球菌屬（Staphylococcus）相對(duì)豐度。此外，本研究進(jìn)一步進(jìn)行LEfSe分析（圖9）并生成分支圖。不同組細(xì)菌分類組成存在顯著差異。在NK組中，鑒定出c__Clostridia、o__Clostridiales、f__Peptostreptococcaceae、g__Romboutsia、p__Firmicutes、f__Clostridiaceae_1、g__Clostridium_sensu_stricto_1、c__Negativicutes、o__Selenomonadales作為紫花前胡苷治療CAD的關(guān)鍵生物標(biāo)志物。綜上所述，本研究結(jié)果表明紫花前胡苷可以調(diào)節(jié)CAD造成的犬皮膚菌群紊亂。

3 討 論

犬特應(yīng)性皮炎（CAD）模型通常采用半抗原DNCB作為致敏物質(zhì)來建立。Krawiec研究團(tuán)隊(duì)對(duì)健康犬進(jìn)行試驗(yàn)，每隔1 d給犬注射低濃度（0.1%）的DNCB，一共注射了10次，以致敏它們的皮膚。然后使用不同濃度（1%、5%、10%）的DNCB進(jìn)行貼斑試驗(yàn)。結(jié)果顯示，當(dāng)使用1%和5%的DNCB后，犬的皮膚貼斑處出現(xiàn)了嚴(yán)重的充血和水腫，還有很多丘疹。

而后研究人員通過病理組織學(xué)觀察發(fā)現(xiàn)，在貼斑3～4 d后，炎性細(xì)胞浸潤(rùn)達(dá)到峰值，然后在第7天開始顯著下降^［19］。有研究結(jié)果證實(shí)，反復(fù)采用低劑量DNCB皮膚暴露與少次高劑量DNCB皮膚暴露一致，同樣會(huì)增加致敏效力^［20］。因此在本次研究中，借鑒了前人建模方法并進(jìn)行改進(jìn)，旨在更加經(jīng)濟(jì)實(shí)用和提高造模成功率^［16］。CAD患犬的臨床表現(xiàn)主要為全身性瘙癢和皮膚炎癥，皮膚病變區(qū)域可見皮屑增多、皮膚增厚、皮膚異味、角質(zhì)層破壞等現(xiàn)象^［8］。本試驗(yàn)結(jié)果顯示，試驗(yàn)第8天時(shí)，皮膚出現(xiàn)明顯紅疹、水腫和損傷，皮膚病變?cè)u(píng)分和皮膚瘙癢評(píng)分逐漸升高，至第12天時(shí)達(dá)到峰值，隨后評(píng)分下降，這與先前報(bào)道的臨床觀察表現(xiàn)一致。

本研究通過檢測(cè)各組血常規(guī)還發(fā)現(xiàn)了DNCB組白細(xì)胞總數(shù)極顯著下降，中性粒細(xì)胞數(shù)量和比例顯著下降，這與DNCB刺激和造模成功傷口持續(xù)糜爛導(dǎo)致的機(jī)體免疫力下降有關(guān)；DNCB組單核細(xì)胞百分比極顯著升高，表明犬體內(nèi)存在炎癥^［21］，經(jīng)治療后顯著提高了白細(xì)胞總數(shù)和中性粒細(xì)胞百分比，單核細(xì)胞百分比也上升了，表明紫花前胡苷給藥增強(qiáng)了機(jī)體免疫，減緩了體內(nèi)炎癥。在血清生化指標(biāo)中顯示，DNCB組血清中堿性磷酸酶和葡萄糖均極顯著下降，這與DNCB刺激有關(guān)，食欲不振導(dǎo)致體重下降，生理性因素可能會(huì)導(dǎo)致堿性磷酸酶下降；有研究表明，動(dòng)物在發(fā)生應(yīng)激反應(yīng)時(shí)，血液中的葡萄糖濃度可能會(huì)發(fā)生變化，因此推測(cè)DNCB組葡萄糖指標(biāo)的下降是應(yīng)激導(dǎo)致的生理反應(yīng)^［22］。犬特應(yīng)性皮炎的一個(gè)主要標(biāo)志是血清 IgE 水平升高，IgE刺激肥大細(xì)胞脫顆粒并釋放組胺，從而引起AD的過敏反應(yīng)^［23］。相比Ctrl組，DNCB組血清IgE顯著提高，表明機(jī)體產(chǎn)生過敏反應(yīng)，經(jīng)治療后顯著降低，表明紫花前胡苷有效緩解了機(jī)體過敏反應(yīng)。DNCB組犬的臨床表現(xiàn)和病理特征與CAD基本一致，表明本研究使用的造模方法成功建立了CAD動(dòng)物模型。

皮膚菌群也是特應(yīng)性皮炎（AD）發(fā)病機(jī)制的關(guān)鍵組成部分^［24-25］。有研究結(jié)果表明，特應(yīng)性皮炎犬存在皮膚菌群失調(diào)現(xiàn)象^［26-28］。近期研究結(jié)果顯示AD患者的病變皮膚在門水平上顯示厚壁菌門豐度顯著增加，變形菌門豐度降低^［29］。此外，受CAD影響的犬接受奧拉替尼治療后變形菌門豐度顯著增加^［30］?；?6S RNA測(cè)序結(jié)果，在門水平上各組的厚壁菌門（Firmicutes）和變形菌門（Proteobacteria）是優(yōu)勢(shì)菌門，占比總和均在70%以上。與Ctrl組相比，DNCB組厚壁菌門（Firmicutes）和變形菌門（Proteobacteria）相對(duì)豐度均顯著下降，F(xiàn)irmicutes與先前研究的不一致，Proteobacteria 與先前研究的一致，紫花前胡苷治療后逆轉(zhuǎn)了占比，F(xiàn)irmicutes和Proteobacteria分別提高到68.48%和20.22%；擬桿菌門（Bacteroidetes）和梭桿菌門（Fusobacteria）相對(duì)豐度均顯著升高，經(jīng)紫花前胡苷治療后分別降低到4.98%和2.15%。紫花前胡苷可能通過提高Firmicutes和Proteobacteria相對(duì)豐度，降低Bacteroidetes和Fusobacteria相對(duì)豐度從而緩解特應(yīng)性皮炎。在屬水平上，已有研究發(fā)現(xiàn)發(fā)現(xiàn)AD患者羅姆布茨菌屬（Romboutsia）和狹義梭菌屬（Clostridium_sensu_stricto_1）的相對(duì)豐度降低，在正常人中Romboutsia和Clostridium_sensu_stricto_1的相對(duì)豐度偏高^［31］。本研究有相似的發(fā)現(xiàn)，與Ctrl組相比，DNCB組中Romboutsia相對(duì)豐度降低，而紫花前胡苷給藥治療后增加了Romboutsia和Clostridium_sensu_stricto_1相對(duì)豐度。莫拉菌屬（Moraxella）相關(guān)菌種與新生兒過敏呈正相關(guān)^［32］。本研究結(jié)果顯示，紫花前胡苷治療降低了Moraxella。有研究證實(shí)金黃色葡萄球菌皮膚定植與感染是CAD的典型特征之一，也是加劇這種疾病的重要因素^［33］。金黃色葡萄球菌表層分泌的中毒性休克綜合征毒素-1（TSST-1）、葡萄球菌腸毒素（SE）和剝脫性毒素是已知的參與皮膚感染的超抗原^［34］。據(jù)報(bào)道，將SE應(yīng)用于皮膚會(huì)導(dǎo)致T細(xì)胞的活化并在小鼠模型中引發(fā)了AD樣皮疹^［35］。本研究結(jié)果顯示，DNCB組中金黃色葡萄球菌屬豐度增加，而紫花前胡苷抑制了葡萄球菌屬（Staphylococcus）相對(duì)豐度。因此，紫花前胡苷治療可能通過增加Romboutsia和Clostridium_sensu_stricto_1相對(duì)豐度，降低Moraxella和Staphylococcus相對(duì)豐度以平衡皮膚菌群達(dá)到治療CAD的目的。

4 結(jié) 論

通過DNCB成功建立犬特應(yīng)性皮炎模型，并證實(shí)紫花前胡苷對(duì)犬特應(yīng)性皮炎（CAD）的治療效果。局部應(yīng)用紫花前胡苷通過下調(diào)IgE緩解了機(jī)體過敏反應(yīng)，改善了CAD病變的進(jìn)展，包括皮膚水腫、表皮增生、皮膚紅斑、苔蘚樣病變以及瘙癢程度等。此外，還發(fā)現(xiàn)紫花前胡苷可能通過增加羅姆布茨菌屬Romboutsia和 狹義梭菌屬Clostridium_sensu_stricto_1相對(duì)豐度，降低莫拉菌屬M(fèi)oraxella和葡萄球菌屬Staphylococcus相對(duì)豐度發(fā)揮抗特應(yīng)性作用。這些結(jié)果表明，紫花前胡苷可作為CAD潛在的藥物。

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（編輯 白永平）