賈第蟲(chóng)對(duì)長(zhǎng)爪沙鼠的致病性分析

摘 要： 十二指腸賈第蟲(chóng)（Giardia duodenalis）是一種重要的人獸共患寄生蟲(chóng)，可引起宿主腹痛、腹瀉、惡心、嘔吐與發(fā)育遲緩等癥狀。長(zhǎng)爪沙鼠（Mongolian gerbil）是多種腸道寄生蟲(chóng)穩(wěn)定可靠的動(dòng)物感染模型，之前有報(bào)道建立了賈第蟲(chóng)感染長(zhǎng)爪沙鼠模型，但缺乏系統(tǒng)的致病性評(píng)估。為進(jìn)一步探討賈第蟲(chóng)對(duì)長(zhǎng)爪沙鼠的致病性，本研究使用30只3周齡長(zhǎng)爪沙鼠，隨機(jī)分為正常對(duì)照組與感染組，感染組每只經(jīng)口感染5×106個(gè)賈第蟲(chóng)滋養(yǎng)體，成功建立動(dòng)物感染模型后在第3、7、14、21和28天每組隨機(jī)剖殺3只，分別統(tǒng)計(jì)體重，腸道荷蟲(chóng)量，腸道病理變化，腸道超微結(jié)構(gòu)變化，以及細(xì)胞因子含量變化來(lái)評(píng)估賈第蟲(chóng)的致病性，同時(shí)也觀察體內(nèi)外賈第蟲(chóng)滋養(yǎng)體分化成囊過(guò)程中的形態(tài)學(xué)變化。結(jié)果顯示：與正常對(duì)照組相比，沙鼠感染賈第蟲(chóng)后出現(xiàn)發(fā)育遲緩、體重增長(zhǎng)緩慢等癥狀；通過(guò)滋養(yǎng)體負(fù)荷計(jì)數(shù)、腸道病理切片與掃描電鏡觀察到腸道中有大量滋養(yǎng)體附著，感染后腸道絨毛萎縮變鈍、隱窩加深和腸道絨隱比下降；賈第蟲(chóng)感染后血清細(xì)胞因子IL-1β、IL-6、IL-17和TNF-α升高，IL-10降低；體內(nèi)外成囊結(jié)果發(fā)現(xiàn)賈第蟲(chóng)滋養(yǎng)體在pH與膽汁含量影響下形態(tài)變圓，鞭毛與吸盤(pán)退化等，最終形成包囊。本試驗(yàn)成功建立了賈第蟲(chóng)動(dòng)物感染模型，并系統(tǒng)評(píng)價(jià)了其致病性，為研究賈第蟲(chóng)的致病機(jī)制、免疫學(xué)以及藥物研發(fā)提供了基礎(chǔ)。

關(guān)鍵詞： 賈第蟲(chóng)；感染模型；致病性

中圖分類(lèi)號(hào)：S852.72;S855.99

文獻(xiàn)標(biāo)志碼：A"""" 文章編號(hào)： 0366-6964（2025）03-1408-11

收稿日期：2024-04-28

基金項(xiàng)目：河南省重點(diǎn)研發(fā)專項(xiàng)：高效替抗植物提取物產(chǎn)品創(chuàng)制及應(yīng)用（231111111600）；動(dòng)物源重要人獸共患病源頭防控措施與關(guān)鍵技術(shù)創(chuàng)新（231111111500）

作者簡(jiǎn)介：張營(yíng)營(yíng)（1998-），女，河南周口人，碩士生，主要從事人獸共患病學(xué)研究，E-mail：Yingyingzhang0829@163.com

*通信作者：張素梅，主要從事人獸共患病學(xué)研究，E-mail：smzhang2815@henau.edu.cn；李俊強(qiáng)，主要從事人獸共患病學(xué)研究，E-mail：lijunqiangcool@126.com

Analysis of the Pathogenicity of Giardia duodenalis to Mongolian gerbils

ZHANG" Yingying^{1， 2}， GUO" Jiaye^{1， 2}， XU" Huiyan^{1， 2}， WU" Yayun^{1， 2}， WU" Longfei^{1， 2}， SUN" Songying^{1， 2}， ZHAO" Wenchao^{1， 2}， ZHANG" Longxian^{1， 2}， ZHANG" Sumei^{1， 2*}， LI" Junqiang^{1， 2*}

（1.College of Veterinary Medicine， Henan Agricultural University， Zhengzhou 450046，" China;

2.International Joint Research Laboratory for Zoonotic Diseases of Henan， Zhengzhou 450046，" China）

Abstract：" Giardia duodenalis is one of the significant zoonotic enteric protozoan parasites instigating symptoms like abdominal pain， diarrhea， nausea， vomiting， and delayed development in the susceptible hosts. The Mongolian gerbil has long been employed as a stable and reliable animal model to establish infection and subsequently study pathogenic dynamics of various intestinal parasites. Although previous reports have established an infection model of G. duodenalis in Mongolian gerbils， a systematic assessment of its pathogenicity was lacking. With an aim to investigate the pathogenicity of G. duodenalis in Mongolian gerbils， this study meticulously used 30 three-week-old gerbils which were randomly divided into control and treatment （infected group）. An oral dose of 5×10⁶ G. duodenalis trophozoites were administered to each gerbil to establish intestinal infection. Three gerbils from each group were randomly euthanized at the 3rd， 7th， 14th， 21st and 28th day post-infection to evaluate changes in their body weight， overall pathogenicity of G. duodenalis including its infection burden， gross pathological and ultrastructural alterations in the intestine， and fluctuation in cytokine levels. Morphological changes during the encystation process of G. duodenalis were also observed both internally and externally. The results revealed that artificially infected gerbils by G. duodenalis manifested retarded development and slow weight gain. After counting trophozoite burden and scanning electron microscopy of pathological sections of intestine it was evident that myriad of trophozoites were attached to the intestine. Following infection significant villous atrophy was witnessed with blunting morphology accompanied by deepening crypts resulting in decreased villous： crypt ratio. Serum levels of pro-inflammatory cytokines IL-1β， IL-6， IL-17， and TNF-α were elevated following G. duodenalis infection while IL-10 decreased. Encystation results showed that pH and bile content influence the morphological changes like rounding off of trophozoites coupled with flagellar and adhesive disc degeneration ultimately leading to cyst formation. This study successfully established Mongolian gerbil as a suitable animal infection model for G. duodenalis， and systematic evaluation of its pathogenicity laid a foundation for further research pertaining to G. duodenalis pathogenicity， host’s immune responses and development of potential drug.

Keywords： Giardia duodenalis; infection model; pathogenicity

*Corresponding authors：" ZHANG Sumei， E-mail： smzhang2815@henau.edu.cn; LI Junqiang， E-mail： lijunqiangcool@126.com

十二指腸賈第蟲(chóng)（G. duodenalis，簡(jiǎn)稱賈第蟲(chóng)）是一種能在人和多種動(dòng)物腸道內(nèi)寄生的原蟲(chóng)，呈全球性分布，尤其在衛(wèi)生環(huán)境較差的發(fā)展中國(guó)家更為常見(jiàn)^［1］。目前賈第蟲(chóng)可分為八個(gè)集聚體A～H，其中集聚體A和B能感染人和多種哺乳動(dòng)物^［2］。賈第蟲(chóng)的生活史分為滋養(yǎng)體和包囊兩個(gè)階段，宿主攝入感染性包囊后會(huì)出現(xiàn)腹痛、腹瀉、惡心和營(yíng)養(yǎng)不良等癥狀^［3］。目前尚無(wú)特效藥物治療賈第蟲(chóng)病，臨床首選是甲硝唑，但近些年耐藥性的增加迫切需要研發(fā)新的藥物來(lái)防控賈第蟲(chóng)病的傳播^［4］。

目前，賈第蟲(chóng)的相關(guān)研究多停留在體外模型，無(wú)法進(jìn)行體內(nèi)驗(yàn)證，穩(wěn)定、可靠且持續(xù)的動(dòng)物感染模型是評(píng)估疫苗效果和藥物療效的基礎(chǔ)，也是研究病原體與宿主互作機(jī)制的重要平臺(tái)^［5］。國(guó)內(nèi)外學(xué)者已先后建立鼠、犬、家兔和貓等動(dòng)物模型，但多面臨感染難度大、感染失敗率高和臨床癥狀差異大等難題^［6］。

長(zhǎng)爪沙鼠已被報(bào)道對(duì)口服包囊或滋養(yǎng)體均具高度易感性，并且病理變化與人類(lèi)相似，是建立賈第蟲(chóng)感染模型的優(yōu)選動(dòng)物，然而，關(guān)于賈第蟲(chóng)感染模型致病性尚未有詳細(xì)報(bào)道^［7-8］。本研究建立賈第蟲(chóng)體內(nèi)感染長(zhǎng)爪沙鼠動(dòng)物模型，通過(guò)感染不同時(shí)間點(diǎn)體重變化、腸道滋養(yǎng)體負(fù)荷、腸道病理變化、腸道超微結(jié)構(gòu)變化、細(xì)胞因子變化和成囊變化來(lái)系統(tǒng)評(píng)估賈第蟲(chóng)的致病性，為今后研究賈第蟲(chóng)的致病機(jī)理、免疫機(jī)制以及藥物驗(yàn)證提供一定的基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)蟲(chóng)株及動(dòng)物

賈第蟲(chóng)WB株集聚體A（吉林大學(xué)張西臣教授饋贈(zèng)），保存于河南省人獸共患病國(guó)際聯(lián)合實(shí)驗(yàn)室；3周齡SPF級(jí)長(zhǎng)爪沙鼠（北京斯貝福生物技術(shù)有限公司），自繁自養(yǎng)于河南農(nóng)業(yè)大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物房，嚴(yán)格按照動(dòng)物實(shí)驗(yàn)規(guī)范進(jìn)行操作。

1.2 主要試劑及儀器

糞便全基因組DNA提取試劑盒（OMEGA）；電鏡固定液（武漢賽維爾生物科技有限公司）；多聚甲醛固定液（武漢賽維爾生物科技有限公司）；細(xì)胞因子試劑盒（上海酶聯(lián)生物科技有限公司）；倒置顯微鏡CX21（日本OLYPLUS公司）；雙人單面凈化工作臺(tái)SW-CJ-2D（蘇州凈化設(shè)備儀器廠）；恒溫培養(yǎng)箱（賽默飛世爾科技公司）；臺(tái)式低速離心機(jī)TGL-16B（湖南湘儀實(shí)驗(yàn)室儀器開(kāi)發(fā)有限公司）；PCR擴(kuò)增儀（Bio-Rad）；穩(wěn)壓穩(wěn)流電泳儀（北京市六一儀器廠）；凝膠電泳成像系統(tǒng)（上海天能科技有限公司）；渦旋震蕩儀（鄭州生元儀器有限公司）；pH計(jì)（上海儀電科學(xué)儀器股份有限公司）；掃描電鏡SU8100（武漢賽維爾生物科技有限公司）。

1.3 試驗(yàn)分組

30只雌性3周齡長(zhǎng)爪沙鼠，體重在10～12 g，感染前3 d每日收集小鼠糞便鏡檢，確定小鼠無(wú)寄生蟲(chóng)感染后，隨機(jī)分為對(duì)照組（n=15）、感染組（n=15），各組飼養(yǎng)在獨(dú)立的籠具之中，自由采食與飲水，每組分別在第3、7、14、21和28天5個(gè)時(shí)間點(diǎn)隨機(jī)剖殺3只小鼠評(píng)估賈第蟲(chóng)的致病性。

1.4 賈第蟲(chóng)感染沙鼠模型的建立

采用改良型TYI-S-33培養(yǎng)基進(jìn)行賈第蟲(chóng)滋養(yǎng)體的復(fù)蘇、傳代與凍存^［9］。取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的賈第蟲(chóng)滋養(yǎng)體，冰浴收集后，2 500 r·min^-1離心10 min棄上清，使用PBS清洗沉淀兩次，再用PBS重懸為2.5×107·mL^-1滋養(yǎng)體，每只沙鼠經(jīng)口灌胃200 μL，感染劑量為5.0×106·只^-1［10］。

1.5 臨床癥狀觀察與體重監(jiān)測(cè)

感染后每日對(duì)小鼠體重進(jìn)行記錄，并觀察小鼠精神狀態(tài)、飲食狀態(tài)和腹瀉情況，腹瀉情況按照以下評(píng)分方法：無(wú)腹瀉現(xiàn)象，糞便正常，0分；輕度腹瀉，糞便成型且輕微濕潤(rùn)，1分；中度腹瀉，糞便顏色偏黃，較濕潤(rùn)且不成型，2分；重度腹瀉，水樣狀糞便，3分。

1.6 糞便包囊鏡檢與分子生物學(xué)鑒定

感染后每天收集新鮮小鼠糞便，向糞便中加入單蒸水?dāng)噭?，?0孔目篩過(guò)濾，濾液3 500 r·min^-1離心5 min，棄上清，蘸取少量糞便沉淀在蓋玻片上，滴加少量盧戈氏碘液，在光學(xué)顯微鏡下鏡檢^［11］。糞便鏡檢到賈第蟲(chóng)包囊，利用OMEGA糞便全基因組DNA提取試劑盒說(shuō)明書(shū)提取DNA，利用巢式PCR擴(kuò)增賈第蟲(chóng)β-giardin（bg）基因進(jìn)行賈第蟲(chóng)基因型的鑒定，巢式PCR中所用引物、反應(yīng)體系和反應(yīng)條件參考文獻(xiàn)［12］。

1.7 十二指腸中賈第蟲(chóng)滋養(yǎng)體定植計(jì)數(shù)

采集整段十二指腸，縱向剖開(kāi)剪碎置于20 mL PBS中，冰浴15 min，渦旋震蕩5 min，2 500 r·min^-1離心10 min棄上清，加入5 mL PBS重懸，使用血球計(jì)數(shù)板進(jìn)行計(jì)數(shù)，每組重復(fù)計(jì)數(shù)3次^［13］。

1.8 病理切片、掃描電鏡與血清樣品采集

病理切片樣品采集：分別在第3、7、14、21和28天這5個(gè)時(shí)間點(diǎn)每組隨機(jī)剖殺3只沙鼠，剪取近端十二指腸1 cm后立即置于4%的多聚甲醛溶液中固定，進(jìn)行切片制作。按照以下評(píng)分方法進(jìn)行腸道組織損傷評(píng)分：組織結(jié)構(gòu)正常，0分；絨毛頂端上皮黏膜下出現(xiàn)間隙增寬，伴有毛細(xì)血管充血，1分；絨毛頂端上皮黏膜下間隙進(jìn)一步增寬，絨毛尖端上皮抬高，黏膜與黏膜下層分離，2分；腸上皮的黏膜與黏膜下層進(jìn)一步分離至絨毛兩端，絨毛上皮成塊脫落，3分；上皮完全脫落，僅剩固有層及其血管暴露，炎性細(xì)胞浸潤(rùn)，4分；固有層崩裂，出現(xiàn)出血與潰瘍，5分。在每張切片選取10個(gè)視野，測(cè)定絨毛高度（VH）和隱窩深度（CD），計(jì)算腸道絨隱比（VH/CD）。

掃描電鏡樣品采集：取近端十二指腸1 cm，在PBS溶液中輕輕漂洗后轉(zhuǎn)移入2.5%戊二醛電鏡固定液中進(jìn)行固定。

血清樣品采集：采用眼球采血方法，收集血液于1.5 mL滅菌離心管中，37 ℃培養(yǎng)箱放置1 h后轉(zhuǎn)移入4 ℃冰箱中靜置過(guò)夜，待血清析出，3 500 r·min^-1離心10 min轉(zhuǎn)移上清于新的EP管中，-80 ℃保存待測(cè)。

1.9 細(xì)胞因子含量檢測(cè)

使用上海酶聯(lián)細(xì)胞因子檢測(cè)試劑盒分別檢測(cè)血清樣本中IL-1β、IL-6、IL-10、IL-17、TNF-α、IFN-γ的含量，根據(jù)試劑盒說(shuō)明書(shū)進(jìn)行操作。

1.10 賈第蟲(chóng)滋養(yǎng)體體內(nèi)、外成囊

1.10.1 賈第蟲(chóng)滋養(yǎng)體體外誘導(dǎo)成囊

賈第蟲(chóng)滋養(yǎng)體可在體外通過(guò)不同pH與不同膽汁含量的成囊培養(yǎng)基中誘導(dǎo)成囊，賈第蟲(chóng)誘導(dǎo)成囊培養(yǎng)基主要分為兩種：pH 7.1誘導(dǎo)成囊培養(yǎng)基（牛膽粉為0.1 g）；pH 7.8成囊培養(yǎng)基（牛膽粉為2 g），其他成分同改良TYI-S-33培養(yǎng)基。取生長(zhǎng)狀態(tài)好的賈第蟲(chóng)滋養(yǎng)體5×106·管^-1，首先在pH 7.1誘導(dǎo)成囊培養(yǎng)基誘導(dǎo)24 h，棄掉培養(yǎng)液，加入pH 7.8成囊培養(yǎng)基再誘導(dǎo)24 h，棄掉培養(yǎng)液，再轉(zhuǎn)入pH 7.1培養(yǎng)基中誘導(dǎo)24 h后收集沉淀，使用去離子水裂解未成囊滋養(yǎng)體48 h^［14］。

1.10.2 賈第蟲(chóng)滋養(yǎng)體體內(nèi)成囊樣品采集

分別采集沙鼠十二指腸、空腸、回腸、盲腸、結(jié)腸、直腸腸段各1 cm，縱向剖開(kāi)后放入PBS中，渦旋震蕩5 min，2 500 r·min^-1離心10 min后取沉淀鏡檢。

1.11 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

用SPSS 21.0軟件對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，組間采用獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)（*.0.01＜P＜0.05；**.0.001＜P＜0.01；***.P＜0.001），用GraphPad Prism軟件進(jìn)行圖表繪制。

2 結(jié) 果

2.1 賈第蟲(chóng)感染長(zhǎng)爪沙鼠的臨床癥狀觀察

試驗(yàn)過(guò)程中沙鼠未出現(xiàn)死亡現(xiàn)象，與對(duì)照組相比，感染組在第7-14天精神沉郁、被毛凌亂、食欲不振、糞便稀軟；第14-21天精神狀況與食欲逐漸恢復(fù)正常、糞便略軟；第21-28天飲食正常、精神狀態(tài)正常、糞便較硬（圖1）。腹瀉評(píng)分見(jiàn)表1。

2.2 賈第蟲(chóng)感染長(zhǎng)爪沙鼠的體重變化

通過(guò)對(duì)沙鼠為期28 d體重監(jiān)測(cè)發(fā)現(xiàn)，與正常對(duì)照組相比，感染組沙鼠體重增長(zhǎng)緩慢，顯著低于正常對(duì)照組（P＜0.05），在第28天，正常對(duì)照組與感染組平均體重相差23.74%。數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析發(fā)現(xiàn)，感染第7-21天，沙鼠體重增長(zhǎng)趨勢(shì)顯著低于正常組（P＜0.01），第21-28天隨著日齡增加，體重增長(zhǎng)有所恢復(fù)（圖2）。

2.3 賈第蟲(chóng)感染長(zhǎng)爪沙鼠糞便中包囊鏡檢與分子生物學(xué)鑒定

賈第蟲(chóng)感染沙鼠3 d后開(kāi)始在糞便中鏡檢到少量包囊，第12-14天為排包囊高峰期，14 d后包囊數(shù)目迅速減少至顯微鏡檢測(cè)陰性，而消瘦明顯的小鼠會(huì)出現(xiàn)持續(xù)排出包囊的情況。對(duì)糞便包囊bg基因位點(diǎn)PCR陽(yáng)性產(chǎn)物進(jìn)行測(cè)序鑒定，結(jié)果顯示，感染后糞便包囊為WB株集聚體A，感染前后一致，表明感染模型成功建立（圖3）。

2.4 賈第蟲(chóng)感染長(zhǎng)爪沙鼠十二指腸滋養(yǎng)體負(fù)荷

賈第蟲(chóng)滋養(yǎng)體主要寄生于小腸前半段，嚴(yán)重感染時(shí)整段小腸中都可見(jiàn)滋養(yǎng)體。感染沙鼠腸道剖檢后，在顯微鏡下可見(jiàn)大量活躍賈第蟲(chóng)滋養(yǎng)體（圖4A、B）。與賈第蟲(chóng)感染后第3天腸道滋養(yǎng)體負(fù)荷相比，第7、14和28天的滋養(yǎng)體數(shù)目具有顯著差異（P＜0.01），感染后第21天差異不顯著（P＞0.05）（圖4C）。

2.5 賈第蟲(chóng)感染長(zhǎng)爪沙鼠不同時(shí)間點(diǎn)腸道病理學(xué)變化

通過(guò)腸道形態(tài)學(xué)觀察發(fā)現(xiàn)，賈第蟲(chóng)感染后近端十二指腸腫脹（圖5A），正常組與感染組腸道絨毛高度在第3和7天差異不顯著（P＞0.05）、第14和21天差異顯著（0.001＜P＜0.01）、第28天差異顯著（0.01＜P＜0.05）（圖5B）。隨著感染時(shí)間的延長(zhǎng)，沙鼠腸道隱窩深度不斷加深（P＜0.05）（圖5C），與正常對(duì)照組相比，感染組腸道絨隱比下降（P＜0.001）（圖5D）。通過(guò)賈第蟲(chóng)感染腸道組織病理學(xué)評(píng)分發(fā)現(xiàn)，正常組腸道結(jié)構(gòu)完整，絨毛隱窩完整，感染組沙鼠在第7和14天腸道完整性結(jié)構(gòu)破壞最為嚴(yán)重，腸腔中有大量的滋養(yǎng)體，絨毛萎縮變鈍、嚴(yán)重時(shí)頂端崩解、上皮細(xì)胞脫落而且隱窩持續(xù)加深（圖6）。

2.6 賈第蟲(chóng)感染長(zhǎng)爪沙鼠不同時(shí)間點(diǎn)十二指腸超微結(jié)構(gòu)

通過(guò)十二指腸超微結(jié)構(gòu)發(fā)現(xiàn)，正常組腸道絨毛排列整齊，密集排列且絨毛較長(zhǎng)；感染第3天后，腸道絨毛間隙出現(xiàn)滋養(yǎng)體附著，腸道絨毛與正常對(duì)照組相比未出現(xiàn)明顯萎縮變鈍情況；感染第7與14天，腸道破壞情況最為嚴(yán)重，腸道絨毛頂端皺縮甚至崩解，腸腔內(nèi)有大量滋養(yǎng)體；感染第21與28天，腸道絨毛持續(xù)萎縮，腸道滋養(yǎng)體數(shù)目較前顯著減少（圖7）。

2.7 賈第蟲(chóng)感染長(zhǎng)爪沙鼠不同時(shí)間點(diǎn)細(xì)胞因子含量

通過(guò)血清細(xì)胞因子含量檢測(cè)發(fā)現(xiàn)，與正常對(duì)照組相比，IL-1β和IL-6在第3和28天差異不顯著（P＞0.05），在第7、14和21天差異顯著（P＜0.05）（圖8A、B）；IL-10在第3、7、14和21天差異顯著（P＜0.05），第28天差異不顯著（P＞0.05）（圖8C）；IL-17在各個(gè)時(shí)間點(diǎn)均差異顯著（P＜0.05）（圖8D）；TNF-α在第3、7和14天差異顯著（P＜0.05），第21與28天差異不顯著（P＞0.05）（圖8E）；各個(gè)時(shí)間點(diǎn)的IFN-γ無(wú)顯著差異（P＞0.05）（圖8F）。

2.8 賈第蟲(chóng)體外誘導(dǎo)成囊與體內(nèi)成囊形態(tài)學(xué)觀察

在體外誘導(dǎo)賈第蟲(chóng)滋養(yǎng)體分化為包囊過(guò)程中發(fā)現(xiàn)，誘導(dǎo)后24 h少量滋養(yǎng)體開(kāi)始逐漸變圓；48 h滋養(yǎng)體鞭毛與腹部吸盤(pán)退化，出現(xiàn)包囊壁，滋養(yǎng)體逐漸從管壁脫落；72 h在培養(yǎng)管中可見(jiàn)誘導(dǎo)成功的包囊（圖9A、B）。在誘導(dǎo)成囊過(guò)程中，滋養(yǎng)體不會(huì)全部啟動(dòng)成囊機(jī)制，裂解收集時(shí)可見(jiàn)大量滋養(yǎng)體，誘導(dǎo)成囊計(jì)數(shù)發(fā)現(xiàn)，滋養(yǎng)體體外誘導(dǎo)成囊率在20%左右。

對(duì)賈第蟲(chóng)感染的沙鼠不同腸段內(nèi)容物進(jìn)行鏡檢，觀察賈第蟲(chóng)在體內(nèi)不同階段成囊形態(tài)，發(fā)現(xiàn)在十二指腸中，可觀察到大量賈第蟲(chóng)滋養(yǎng)體，隨著腸道運(yùn)動(dòng)滋養(yǎng)體受腸道環(huán)境的膽汁含量與酸堿度的變化，在小腸末端滋養(yǎng)體逐漸出現(xiàn)形態(tài)變圓和鞭毛吸盤(pán)退化等現(xiàn)象，在盲腸與結(jié)腸，鏡檢到橢圓形或者圓形包囊，賈第蟲(chóng)完成成囊階段，隨糞便通過(guò)直腸排出（圖9C）。

3 討 論

合適的動(dòng)物感染模型應(yīng)滿足持續(xù)感染、病原感染量適中、臨床癥狀明顯、模擬人類(lèi)病理學(xué)變化、成本低和便于操作等條件^［15］。賈第蟲(chóng)動(dòng)物感染模型的建立對(duì)于研究賈第蟲(chóng)致病機(jī)制、免疫學(xué)以及藥物篩選具有重要的推動(dòng)作用。Michaels等^［16］采用賈第蟲(chóng)WB株滋養(yǎng)體感染BALB/c小鼠，需要在感染前3 d給小鼠飼喂抗生素來(lái)促進(jìn)寄生蟲(chóng)定殖；朱鵬^［17］建立的賈第蟲(chóng)感染C57/BL6小鼠模型，需連續(xù)3 d灌胃小鼠賈第蟲(chóng)包囊。賈第蟲(chóng)滋養(yǎng)體體外易于培養(yǎng)，本試驗(yàn)采用5×106個(gè)賈第蟲(chóng)滋養(yǎng)體感染長(zhǎng)爪沙鼠，且只需經(jīng)口灌胃感染一次，未進(jìn)行重復(fù)灌胃或免疫抑制，所有沙鼠均表現(xiàn)出了高度的易感性，建立了簡(jiǎn)便快捷且穩(wěn)定可靠的感染模型。

賈第蟲(chóng)病分為急性與慢性感染，感染宿主往往伴有腹部疼痛，惡心與體重減輕癥狀^［18］。Rivero等^［19］使用賈第蟲(chóng)滋養(yǎng)體感染沙鼠模型研究了抗原變異的作用，在感染的第2周，受感染的沙鼠出現(xiàn)腹瀉與體重減輕癥狀，體重減輕比例約5%～6%，所有受感染的沙鼠在感染后30 d有自愈現(xiàn)象；Peckov等^［20］使用1.0×107個(gè)WB株滋養(yǎng)體感染沙鼠后出現(xiàn)腹瀉情況，感染的沙鼠體重減少10%左右。在本試驗(yàn)中，發(fā)現(xiàn)賈第蟲(chóng)感染顯著抑制沙鼠的生長(zhǎng)，延緩體重增長(zhǎng)，第28天感染組的體重與正常組相比減少了23.74%，試驗(yàn)過(guò)程中觀察到在第7-14天沙鼠糞便較為稀軟，但未出現(xiàn)嚴(yán)重腹瀉癥狀。Scorza等^［21］對(duì)犬賈第蟲(chóng)的研究中發(fā)現(xiàn)腹瀉與賈第蟲(chóng)感染并無(wú)直接關(guān)系，將來(lái)研究應(yīng)當(dāng)考慮其他因素在賈第蟲(chóng)致病中的作用，例如腸道菌群。

賈第蟲(chóng)滋養(yǎng)體在小腸中以非侵入的方式進(jìn)行定殖，附著在腸道絨毛上，通過(guò)腹吸盤(pán)來(lái)抵抗腸道蠕動(dòng)^［22］。本試驗(yàn)中賈第蟲(chóng)滋養(yǎng)體在前7 d達(dá)到峰值，從第14天后呈現(xiàn)迅速消減的趨勢(shì)，在第21和28天各有一只沙鼠未鏡檢到滋養(yǎng)體，與Serradell等^［8］報(bào)道的沙鼠感染后滋養(yǎng)體負(fù)荷在第7天達(dá)到最大數(shù)目然后快速下降，滋養(yǎng)體持續(xù)時(shí)間約28 d的結(jié)果一致，分析賈第蟲(chóng)滋養(yǎng)體的消減與與小鼠生長(zhǎng)過(guò)程中自身免疫調(diào)節(jié)、飲食狀況等相關(guān)。

賈第蟲(chóng)感染腸道的病理切片和超微結(jié)構(gòu)對(duì)于探究腸道病理變化至關(guān)重要，目前為止，賈第蟲(chóng)的致病機(jī)制尚未完全揭示，研究報(bào)道賈第蟲(chóng)感染誘發(fā)絨毛頂端上皮細(xì)胞凋亡、炎性細(xì)胞浸潤(rùn)、隱窩增生，杯狀細(xì)胞腫大等病變^［23］。Zoghroban等^［24］使用賈第蟲(chóng)感染小鼠后，腸道絨毛出現(xiàn)萎縮、縮短，局灶性融合，還檢測(cè)到上皮細(xì)胞脫落，固有層炎性細(xì)胞浸潤(rùn)等現(xiàn)象。本試驗(yàn)中，由腸道形態(tài)學(xué)觀察到賈第蟲(chóng)感染后第3、7和14天腸道上半段明顯腫脹、腸壁變薄和黏液分泌增多，第21和28天腸道腫脹程度有所減輕，在腸道病理切片中觀察到賈第蟲(chóng)感染后腸道絨毛受損，頂端崩解，腸道隱窩增生，腸道病理?yè)p傷在第7和14天最嚴(yán)重，通過(guò)腸道病理變化有助進(jìn)一步了解賈第蟲(chóng)感染期間宿主發(fā)病機(jī)制。

免疫系統(tǒng)是機(jī)體發(fā)揮免疫功能的重要場(chǎng)所，體液免疫與細(xì)胞免疫共同參與保護(hù)宿主免受賈第蟲(chóng)感染^［25］。Amorim等^［26］采用不同劑量的賈第蟲(chóng)滋養(yǎng)體感染沙鼠評(píng)估包囊清除、全身體液（IgA、IgG1、IgG2a、IgM和IgE）和腸道分泌性IgA免疫反應(yīng)，結(jié)果表明無(wú)論感染劑量多少，均能夠誘導(dǎo)全身體液性免疫，免疫缺陷容易導(dǎo)致賈第蟲(chóng)感染的強(qiáng)度與持久度增加，T淋巴細(xì)胞和IL-6有助于清除賈第蟲(chóng)感染。研究報(bào)道沙鼠感染期間細(xì)胞因子反應(yīng)呈現(xiàn)雙向特征：早期誘導(dǎo)Th1（IFN-γ、IL-1β、IL-6和TNF）、Th17（IL-17）和Th2（IL-4）型免疫反應(yīng)，并發(fā)生典型的腸道炎癥，隨后轉(zhuǎn)向以Th2（IL-5）為主的免疫反應(yīng)^［8］。本試驗(yàn)中，檢測(cè)到賈第蟲(chóng)感染后IL-1β、IL-6、IL-17、TNF-α水平含量升高，IL-10水平降低，與Dann等^［27］報(bào)道小鼠感染賈第蟲(chóng)后2～4周出現(xiàn)了短暫的IL-10分泌減少一致。IFN-γ在各個(gè)時(shí)間點(diǎn)差異不顯著，原因可能為動(dòng)物個(gè)體差異，以及炎癥發(fā)展的復(fù)雜性，促炎因子在病原感染初期發(fā)揮作用，抗炎因子在恢復(fù)機(jī)體正常發(fā)揮作用，不同時(shí)間點(diǎn)采樣炎癥發(fā)展水平也會(huì)造成不同。

賈第蟲(chóng)滋養(yǎng)體在不良環(huán)境（如膽固醇缺乏、堿性pH和高濃度膽汁等條件刺激下）中，會(huì)分化形成包囊，對(duì)賈第蟲(chóng)的生存、病原傳播和致病非常重要^［28］。本試驗(yàn)采用體外與體內(nèi)兩方面進(jìn)行了賈第蟲(chóng)滋養(yǎng)體成囊的初步研究。體外成囊方案的不同會(huì)影響成囊的結(jié)果，本試驗(yàn)首先采用低膽汁含量、低pH的預(yù)成囊培養(yǎng)基進(jìn)行誘導(dǎo)，再轉(zhuǎn)入高膽汁含量、高pH的成囊培養(yǎng)基中進(jìn)行誘導(dǎo)，能夠顯著提高成囊率。本試驗(yàn)在體外觀察到24 h滋養(yǎng)體形態(tài)變圓；48 h滋養(yǎng)體鞭毛與腹部吸盤(pán)退化，出現(xiàn)包囊壁，滋養(yǎng)體逐漸從管壁脫落；72 h在培養(yǎng)管中可見(jiàn)誘導(dǎo)成功的包囊，觀察到的成囊形態(tài)學(xué)變化與李凌丹^［29］研究的犬賈第蟲(chóng)滋養(yǎng)體體外誘導(dǎo)成囊形態(tài)學(xué)變化一致。在體內(nèi)成囊方面，本試驗(yàn)通過(guò)對(duì)體內(nèi)不同腸段剖檢觀察了賈第蟲(chóng)的成囊形態(tài)學(xué)變化，發(fā)現(xiàn)賈第蟲(chóng)滋養(yǎng)體吸附于小腸上半段，隨著滋養(yǎng)體密度增加和腸道運(yùn)動(dòng)，在小腸末端膽固醇降低、pH升高以及膽汁升高的條件下，滋養(yǎng)體啟動(dòng)成囊機(jī)制，誘導(dǎo)分化為包囊^［30］。成囊是賈第蟲(chóng)病傳播和致病的關(guān)鍵過(guò)程，通過(guò)對(duì)體內(nèi)外成囊形態(tài)學(xué)過(guò)程的研究可為賈第蟲(chóng)病的預(yù)防與治療提供條件。

4 結(jié) 論

本研究成功建立了賈第蟲(chóng)感染長(zhǎng)爪沙鼠的動(dòng)物模型，并從不同時(shí)間點(diǎn)評(píng)估了賈第蟲(chóng)感染的致病性，發(fā)現(xiàn)賈第蟲(chóng)感染可導(dǎo)致小鼠體重增長(zhǎng)緩慢、腸道結(jié)構(gòu)受損和細(xì)胞因子含量變化。本試驗(yàn)建立的賈第蟲(chóng)感染沙鼠動(dòng)物模型具有耗時(shí)短、感染率高、重復(fù)性好的特點(diǎn)，為研究賈第蟲(chóng)的致病機(jī)制、宿主免疫調(diào)節(jié)以及藥物篩選提供了基礎(chǔ)。

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（編輯 白永平）