骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞分離培養(yǎng)體系的優(yōu)化篩選

陳麗燕++鄧麗青++陳金花++鐘郁++劉佳

摘 要：為優(yōu)化骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞的分離和培養(yǎng)方法，采用改良的骨髓沖洗法分離骨髓干細(xì)胞，細(xì)胞接種后，比較不同體積分?jǐn)?shù)胎牛血清（5%，10%，20%）、不同的DMEM/F12、H-DMEM和L-DMEM培養(yǎng)基，進(jìn)行細(xì)胞培養(yǎng)，比較細(xì)胞生命狀態(tài)。結(jié)果顯示不使用篩網(wǎng)細(xì)胞分離細(xì)胞，應(yīng)用含體積分?jǐn)?shù)為10%胎牛血清的DMEM/F12M培養(yǎng)基培養(yǎng)，能夠提高培養(yǎng)效率。

關(guān)鍵詞：間充質(zhì)干細(xì)胞；骨髓；培養(yǎng)

中圖分類號：R329 文獻(xiàn)標(biāo)識碼：A 文章編號：1671-2064（2017）19-0200-02

骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞（Bone marrow mesenchymalstem cells，BMSCs）是指存在于骨髓基質(zhì)中的非造血組織的間充質(zhì)干細(xì)胞，在體內(nèi)分布于多種組織和器官，并具有多向分化潛能。它有著廣泛的來源，包括骨髓，骨骼肌，軟骨，骨，肌腱等[1]。故在干細(xì)胞研究領(lǐng)域中具有突出的優(yōu)勢。本實驗對小鼠BMSCs的生物學(xué)性進(jìn)行研究，旨在建立體外分離培養(yǎng)BMSCs的方法，培養(yǎng)出生長狀態(tài)良好，足夠數(shù)量的骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞是應(yīng)用的前提，進(jìn)一步為組織工程、細(xì)胞治療和基因治療研究提供實驗依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 實驗材料

實驗動物：6-8周齡SPF級昆明小鼠20只，體重30-40g （雌雄不拘），購自斯萊克景達(dá)公司，在本校標(biāo)準(zhǔn)化實驗動物中心常規(guī)飼養(yǎng)。

主要試劑：DMEM/F12（Biological Industries公司）、H-DMEM培養(yǎng)基及L-DMEM 培養(yǎng)基（Sangon Biotech公司）、胎牛血清（FBS）（Sigma公司）、胰酶（GENVIEW公司）。

1.2 細(xì)胞分離方式

小鼠脫頸處死，置于75%無水乙醇的燒杯中浸泡5min，在無菌條件下取后腿股骨，清除表面肌肉組織。刺穿股骨，分別用DMEM/F12、H-DMEM或L-DMDM培養(yǎng)液（含10% FBS）沖洗骨髓，200目篩網(wǎng)過濾后，用1ml注射器注入細(xì)胞培養(yǎng)瓶，37℃，CO2培養(yǎng)。常規(guī)培養(yǎng)3～4天后用PBS沖洗兩遍，全量換液去除非貼壁細(xì)胞。當(dāng)細(xì)胞生長至約80%融合時，用0.25%胰酶和0.01%EDTA消化，計數(shù)，傳代。

1.3 細(xì)胞培養(yǎng)體系比較

（1）不同血清含量的比較：分離后的單個核細(xì)胞以1×106接種至6孔板中，用DMEM/F12培養(yǎng)液含5%，10%，20%FBS進(jìn)行培養(yǎng)，比較細(xì)胞生長情況。

（2）不同類型培基比較：分離后的單個核細(xì)胞以1×106接種至6孔板中，用10%胎牛血清DMEM/F12、H-DMEM和L-DMEM分別培養(yǎng)，比較細(xì)胞貼壁與生長情況。

2 結(jié)果

2.1 細(xì)胞分離方式

使用篩網(wǎng)細(xì)胞殘留少，培養(yǎng)時細(xì)胞密度過低，難以存活，BMSCs數(shù)量少（圖1）；不使用篩網(wǎng)，可獲取更多細(xì)胞，能使BMSCs貼壁與伸展，存活率明顯高些（圖2）。

2.2 細(xì)胞培養(yǎng)情況

2.2.1 不同血清濃度

用DMEM/F12培養(yǎng)液含5%，10%，20%FBS進(jìn)行培養(yǎng)時，最佳的血清濃度是10%，細(xì)胞增殖旺盛，形態(tài)均一，易于傳代。過高的血清濃度>15%時，會導(dǎo)致細(xì)胞出現(xiàn)分化的現(xiàn)象，傳代較難。過低的血清會<10%時，導(dǎo)致細(xì)胞的增殖速度下降，未能增值傳代。

2.2.2 不同類型培基

10%胎牛血清的DMEM/F12細(xì)胞培養(yǎng)按照1：1比例混合效果最佳，營養(yǎng)成分豐富，呈長棱形成纖維細(xì)胞樣的細(xì)胞。（圖3）10%胎牛血清的H-DMEM細(xì)胞培養(yǎng)，可見數(shù)個成纖維細(xì)胞樣，細(xì)胞輪廓增強(qiáng)，細(xì)胞折光性變?nèi)?，?xì)胞胞質(zhì)中出現(xiàn)空泡、脂滴和其他顆粒狀物質(zhì)。（圖4）。含10%胎牛血清的L-DMEM培養(yǎng)，僅見個別成纖維細(xì)胞樣，細(xì)胞形態(tài)出現(xiàn)多樣性，貼壁細(xì)胞浮起。（圖5）

3 討論

間充質(zhì)干細(xì)胞來源于中胚層，具有很強(qiáng)的自我復(fù)制能力和多向分化潛能，它分布于全身各結(jié)締組織，尤以骨髓中含量最多，但即使是在骨髓中，BMSCs的豐度也不高，每105-106個單核細(xì)胞中大約含一個BMSCs，并且隨著年齡的增長，BMSCs含量逐漸減少[1]。BMSCs具有支持造血，促進(jìn)造血干細(xì)胞移植后造血功能恢復(fù)、預(yù)防和減輕移植后的移植物抗宿主病的潛能[2，4]。因此，建立一個體外適宜BMSCs生長培養(yǎng)體系是顯得至關(guān)重要。

MSCs的分離技術(shù)和方法主要有4種：貼壁法、流式細(xì)胞儀分離法、密度梯度離心法和免疫磁珠法。應(yīng)用流式細(xì)胞儀分離法或免疫磁珠法，雖可以得到純度較高的細(xì)胞，但成本昂貴，在分離過程對細(xì)胞的活性影響較大，甚至導(dǎo)致細(xì)胞完全失去活性。使用percol1分離液梯度離心的方法，能有效地將紅細(xì)胞、白細(xì)胞，和間充質(zhì)干細(xì)胞分離開來，同時操作簡單，快速，對細(xì)胞的活性影響較小，但要是血管中細(xì)胞量少，分離得到的單個核細(xì)胞數(shù)量更少，不利于細(xì)胞的生長。貼壁法是骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞最初的分離培養(yǎng)方法，至今仍是一種得到廣泛應(yīng)用的經(jīng)典途徑[3，5]。本實驗采用貼壁培養(yǎng)法，并經(jīng)過體外貼壁培養(yǎng)一段時間，通過換液去除懸浮生長的造血細(xì)胞，從而獲得BMSCs。

在原代分離時，細(xì)胞分離方式中是否使用篩網(wǎng)對BMSCs的生長有一定影響，使用篩網(wǎng)細(xì)胞的密度過低，存活率難，BMSCs數(shù)量少；而無使用篩網(wǎng)細(xì)胞，能使BMSCs貼壁與伸展，存活率高，可獲取更多細(xì)胞。最佳的血清濃度是10%，生長最為旺盛：血清濃度<10%，不利于細(xì)胞生長；血清濃度>15%時，易引起細(xì)胞分化而影響增值。應(yīng)用L-DMEM培基未能獲得可增殖傳代的間充質(zhì)干細(xì)胞，H-DMEM培基獲得少量可增值傳代細(xì)胞，而DMEM/F12和得到了均一的、可傳代的間充質(zhì)干細(xì)胞。

本實驗對其分離、培養(yǎng)條件進(jìn)行優(yōu)化，結(jié)果顯示不使用篩網(wǎng)細(xì)胞，應(yīng)用含體積分?jǐn)?shù)為10%胎牛血清的DMEM/F12M培養(yǎng)基培養(yǎng)，能夠提高培養(yǎng)效率。

參考文獻(xiàn)

[1]張怡，趙連三，唐紅，等.小鼠骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞的分離與培養(yǎng)[J].生物醫(yī)學(xué)工程學(xué)雜志，2004，21（5）：746-748，765.

[2]宋一雪，王軍，陳虎.間充質(zhì)干細(xì)胞在造血干細(xì)胞移植中的應(yīng)用[J].現(xiàn)代生物醫(yī)學(xué)進(jìn)展，2009，9（5）：986-1000.

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[5]宮曉潔，孫莉，黎靖宇.小鼠骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞的分離培養(yǎng)及形態(tài)學(xué)觀察[J].解剖學(xué)研究，2008，30（1）：54-56.endprint