文心蘭軟腐病菌Dickeya fangzhongdai Onc5 vfmE 基因的克隆及表達(dá)分析

摘 要：狄克氏菌（Dickeya fangzhongdai）是引起蘭科植物毀滅性病害軟腐?。╯oft rot disease）的主要病原菌之一。病原菌致病基因在病原菌與植物互作中發(fā)揮至關(guān)重要的作用。軟腐病菌D. fangzhongdai Onc5 從福建南茜文心蘭（Oncidium，Gower Ramsey）軟腐病患病植株中分離而來。本研究旨在明確D. fangzhongdai Onc5 vfmE 基因的分子生物學(xué)特征，并分析其在侵染寄主過程中的作用，為揭示vfmE 基因在D. fangzhongdai Onc5 侵染寄主過程中的致病機(jī)制提供理論依據(jù)。本研究以D．fangzhongdai Onc5 基因組DNA 為模版，通過RT-PCR 擴(kuò)增，成功獲得vfmE 基因，并進(jìn)行生物信息學(xué)分析；利用RT-qPCR 分析vfmE 基因在D. fangzhongdai Onc5 侵染文心蘭過程中的表達(dá)情況。結(jié)果表明：D. fangzhongdai Onc5 vfmE 基因的ORF 為564 bp，編碼187 個(gè)氨基酸；vfmE 蛋白質(zhì)的分子質(zhì)量為21.93 kDa，理論等電點(diǎn)（pI）為9.01，含1 個(gè)AraC 超家族結(jié)構(gòu)域；vfmE 蛋白質(zhì)為結(jié)構(gòu)不穩(wěn)定的親水性蛋白，無信號肽，不存在跨膜結(jié)構(gòu)域；其蛋白質(zhì)二級結(jié)構(gòu)主要為α-螺旋（58.29%）和無規(guī)則卷曲（40.64%）；同源性分析表明，其氨基酸序列與Dickeya屬其他菌種的vfmE 序列具有很高的相似性（gt;86%）；RT-qPCR 分析表明：vfmE 基因在D．fangzhongdai Onc5 侵染文心蘭葉片和假鱗莖后均持續(xù)高表達(dá)，在12 h 的表達(dá)量最高（Plt;0.01），表明vfmE 蛋白在D. fangzhongdai Onc5 侵染文心蘭的過程中發(fā)揮著重要的作用。本研究結(jié)果為進(jìn)一步研究vfmE 基因功能和Dickeya 屬病原菌致病機(jī)制提供提論基礎(chǔ)，同時(shí)也有利于發(fā)展植物軟腐病新的防治靶標(biāo)。

關(guān)鍵詞：狄克氏菌；vfmE 基因；克隆；生物信息學(xué)分析；表達(dá)分析

中圖分類號：S432.1 文獻(xiàn)標(biāo)志碼：A

文心蘭（Oncidium）屬于蘭科文心蘭屬植物，其植株輕巧，花形優(yōu)美，花色艷麗，具有較高的觀賞價(jià)值和商業(yè)價(jià)值，是世界上最重要的切花和盆花之一。近年來，中國尤其是臺灣省文心蘭種植面積和產(chǎn)量也在逐年上升，但文心蘭切花高峰期正值高溫高濕季節(jié)，易受到病原菌的侵害引起軟腐病。軟腐病是文心蘭栽培生產(chǎn)最致命的病害之一，感病后植株迅速水漬化，常引起整株植株腐爛致死，進(jìn)而影響文心蘭全產(chǎn)業(yè)鏈的發(fā)展[1]。

軟腐病菌Dickeya fangzhongdai Onc5 從福建南茜文心蘭（Oncidium，Gower Ramsey）軟腐病患病植株中分離而來，其基因組已測序完成。體外侵染實(shí)驗(yàn)證實(shí)該菌株還可侵染蝴蝶蘭、金線蓮及鐵皮石斛等其他蘭科植物[2]。Dickeya 屬病原菌主要通過合成和分泌大量植物細(xì)胞壁降解酶（plant cell wall degration enzymes， PCWDEs）侵染宿主植物，使其展現(xiàn)“軟腐”癥狀[3]。Dickeya屬病原菌寄主范圍較廣，可引起多種作物和花卉的細(xì)菌性軟腐病，造成巨大的經(jīng)濟(jì)損失?；ɑ芩拗靼ň栈?、蝴蝶蘭、百合、杜鵑、海棠和向日葵等，其他宿主主要涉及土豆、水稻、香蕉、番茄、玉米、菠蘿、大米、胡蘿卜、梨樹和煙草等[4]，尤其近年來由D. zeae 引起的水稻細(xì)菌性基腐病和香蕉軟腐病[5]，以及由D. solani 引起的馬鈴薯軟腐病均造成重大的農(nóng)業(yè)損失[6]，因此，關(guān)于Dickeya 屬病原菌致病機(jī)理的研究是當(dāng)前的研究熱點(diǎn)。

群體感應(yīng)（quorum sensing， QS）是一種細(xì)菌細(xì)胞之間的通信機(jī)制，通過釋放與細(xì)胞密度相關(guān)的QS 信號分子來調(diào)節(jié)特定基因的表達(dá)，調(diào)節(jié)細(xì)菌的群體行為，涉及細(xì)菌毒力和感染寄主[7]。2013年，NASSER 等[8]在D.dadantii 3937 菌株中發(fā)現(xiàn)一種新的群體感應(yīng)系統(tǒng)——vfm 基因簇，該基因簇僅在Dickeya 屬中被發(fā)現(xiàn)且高度保守，該QS 系統(tǒng)含有vfmAZBCD ， vfmKLMNOPQRSTUVW ，vfmFGHIJ 三個(gè)操縱子和關(guān)鍵調(diào)控基因vfmE。操縱子vfmAZBCD和vfmKLMNOPQRSTUVW主要參與信號分子VFM 的合成，隨后通過ABC 轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白vfmFG 輸出胞外。胞外信號VFM 隨著細(xì)胞數(shù)量的增加逐漸積累，當(dāng)VFM 達(dá)到一定的閾值，引發(fā)雙組分系統(tǒng)vfmH/vfmI 間的磷酸化，被激活的vfmH 誘導(dǎo)vfmE 表達(dá)，vfmE 可進(jìn)一步激活下游PCWDEs 相關(guān)基因的表達(dá)，影響D. dadantii3937 對寄主的侵染。此外， vfmE 也可激活vfmKLMNOPQRSTUVW、vfmFGHIJ 和vfmAZBCD，由此，在分子水平上增加了VFM 信號合成相關(guān)基因的轉(zhuǎn)錄樣本，實(shí)現(xiàn)了VFM 信號的快速積累（圖1）。與野生型菌株相比，D. dadantii 3937ΔvfmE 突變體對非洲紫羅蘭（Saintpaulia ionantha）的致病性明顯減弱。2019 年，LV 等[9]在D.zeae EC1 菌株中也發(fā)現(xiàn)了D. dadantii 3937 同源vfm 基因簇，該項(xiàng)研究表明：ΔvfmE 突變體中zeamines（D. zeae EC1 分泌的一種抗生素類植物毒素）生物合成相關(guān)基因（zmsK、zmsA、zmsC和zmsD）以及PCWDEs 合成相關(guān)基因的表達(dá)量均顯著降低。此外，該菌株vfm 群體感應(yīng)系統(tǒng)還能夠影響T1SS（type Ⅰ secretion systems）、T2SS、T3SS 和T4SS 分泌系統(tǒng)基因的表達(dá)以及病原菌的運(yùn)動性（motility）。BANERJEE 等[10]研究表明，D. dadantii 的毒力與第二信使環(huán)二鳥甘酸（ cyclic-di-GMP， c-di-GMP）有關(guān)，當(dāng)環(huán)境中c-di-GMP 濃度較低時(shí)，vfmE 可作為效應(yīng)蛋白與c-di-GMP 結(jié)合激活果膠酶（pectate lyase， Pel）合成基因pel 的表達(dá)。目前，vfmE 基因僅在D.dadantii 3937 和D. zeae EC1 菌株中報(bào)道，且都與病原菌致病系統(tǒng)——新型群體感應(yīng)系統(tǒng)的調(diào)控相關(guān)。現(xiàn)有研究表明，因菌種間的差異，新型群體感應(yīng)系統(tǒng)vfm 基因簇對致病因子的調(diào)控有所不同，或許與vfmE 基因功能的差異有關(guān)。

在前期的研究中， 本課題組在D. fangzhongdaiOnc5 菌株基因組中發(fā)現(xiàn)了D. dadantii3937 同源vfm 基因簇，大小約為25 kb，其中包括vfmE。此外，課題組還對vfm 基因簇中的關(guān)鍵調(diào)控基因vfmH 和vfmI 進(jìn)行了克隆、原核表達(dá)和蛋白純化?；诖?，本研究以D. fangzhongdaiOnc5 菌株為研究對象，從其基因組中克隆vfmE基因，并對其生物信息學(xué)特征及表達(dá)特征進(jìn)行分析，以期為后續(xù)揭示vfmE 基因?qū)ickeya 屬病原菌致病性的調(diào)控機(jī)制提供理論參考。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 菌株、質(zhì)粒及菌株活化

軟腐病菌D.fangzhongdai Onc5 菌株保存于忻州師范學(xué)院生化實(shí)驗(yàn)室，將其置于30%的甘油中，于–80 ℃冰箱保存。pUCm-T 載體、大腸桿菌DH5α 感受態(tài)均購自生工生物工程（上海）股份有限公司。菌株活化：將1% D. fangzhongdai Onc5 加入20 mL 的胰蛋白胨大豆液體（tryptose soya broth， TSB）培養(yǎng)基中，于30 ℃，150 r/min 的條件下培養(yǎng)12 h。

1.1.2 主要試劑

細(xì)菌基因組DNA 提取試劑盒、細(xì)菌總RNA 快速抽提試劑盒（bacteria total RNAisolation kit）、cDNA 合成試劑盒（MightyscriptFirst Strand cDNA Synthesis Master Mix ）、2×SanTaq PCR Master Mix （with Blue Dye）、SanPrep 柱式DNA 膠回收試劑盒、X-Gal 溶液、異丙基硫代半乳糖苷（IPTG）溶液均購自生工生物工程（上海）股份有限公司。TransStart? TopGreen qPCR SuperMix（+Dye I）購自北京全式金生物技術(shù)有限公司。胰酪大豆胨瓊脂培養(yǎng)基（tryptose soya agar， TSA）、TSB 培養(yǎng)基與LB 培養(yǎng)基（luria-bertani medium）由本實(shí)驗(yàn)室自配。

1.2 方法

1.2.1 引物設(shè)計(jì)與合成

在NCBI 數(shù)據(jù)庫中查找D. fangzhongdai Onc5 菌株全基因組序列（PRJNA750274），獲取目的基因vfmE 開放閱讀框ORF 序列。使用Primer 5. 0 軟件設(shè)計(jì)引物，本研究所用引物序列見表1，均由生工生物工程（上海）股份有限公司合成。

1.2.2 RT-PCR 擴(kuò)增目的基因序列

利用細(xì)菌基因組DNA 提取試劑盒提取D. fangzhongdai Onc5菌株DNA，以此為模板進(jìn)行vfmE 基因擴(kuò)增。PCR擴(kuò)增體系：PCR Mix 12.5 μL，上、下游引物各20 pmol，DNA 模板5 ng，ddH2O 補(bǔ)足至25 μL。反應(yīng)條件：94 ℃預(yù)變性5 min；94 ℃變性30 s，退火54 ℃ 45 s，72 ℃ 40 s，35 個(gè)循環(huán)；72 ℃延伸10 min。凝膠電泳檢測，回收產(chǎn)物與pUCm-T在16 ℃過夜連接，將其轉(zhuǎn)化至大腸桿菌DH5α 中，涂布于含氨芐霉素（ampicillin， Amp）的LB 培養(yǎng)基，采用Amp 抗性篩選與α-互補(bǔ)現(xiàn)象篩選陽性克隆轉(zhuǎn)化子，送生工生物工程（上海）股份有限公司進(jìn)行測序。

1.2.3 生物信息學(xué)分析

通過EXPASY在線工具ProtParam（https：//web.expasy.org/protparam/）預(yù)測和分析目的基因的分子質(zhì)量、理論等電點(diǎn)、氨基酸等理化性質(zhì)；利用ProtScale（ https：//web.expasy.org/protscale/）在線工具分析蛋白質(zhì)的親/疏水性；通過Conserved Domain Search 軟件預(yù)測vfmE 蛋白保守結(jié)構(gòu)域；使用NCBI 在線軟件（ https：//blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi）比對功能和DNAMAN 軟件[11]對vfmE 蛋白的氨基酸序列進(jìn)行同源性分析；通過SignaIP-5.0（https：//www.novopro.cn/tools/signalp）在線工具進(jìn)行信號肽預(yù)測；利用TMHMM-2.0（https：//services.healthtech.dtu.dk/services/TMHMM-2.0/）在線工具進(jìn)行跨膜結(jié)構(gòu)預(yù)測[12]；利用PSORTb version 3.0.3（https：//www.psort.org/psortb/）在線工具進(jìn)行蛋白亞細(xì)胞定位；利用SOPMA（https：//npsa.lyon.inserm.fr/cgibin/npsa_automat.pl？page=/NPSA/npsa_sopma.html）在線工具對蛋白二級結(jié)構(gòu)進(jìn)行分析[13]；利用SWISS-MODEL（https：//swissmodel.expasy.org/interactive）在線工具進(jìn)行蛋白質(zhì)三級結(jié)構(gòu)預(yù)測[14]；利用蛋白質(zhì)互作網(wǎng)絡(luò)數(shù)據(jù)庫（ https：//stringdb.org/）進(jìn)行vfmE 基因編碼蛋白的互作預(yù)測[15]。

1.2.4 RT-qPCR 分析

以recA 為內(nèi)參基因，以E-F和E-R 為引物（表1），檢測vfmE 在D. fangzhongdaiOnc5 菌株侵染文心蘭葉片過程中的相對表達(dá)量。取樣方法參考蘇初連等[16]的方法作適當(dāng)調(diào)整，具體如下：選取健康文心蘭的葉片與長勢一致的假鱗莖，將清洗干凈的葉片和假鱗莖浸泡于1%NaCIO 溶液中15 min，隨后用無菌水清洗3 遍，置于無菌培養(yǎng)皿中。用無菌穿刺注射接種生長期文心蘭葉片和假鱗莖，每個(gè)接種點(diǎn)5 μL D. fangzhongdaiOnc5 菌液（濃度為1×107 個(gè)/mL）。選擇0 h 以及發(fā)病期時(shí)間點(diǎn)取樣（3、6、9、12、18、24 h），剪取接種點(diǎn)周邊1 cm×1 cm 的葉片（包括接種點(diǎn)在內(nèi)），每個(gè)時(shí)間點(diǎn)選取12 個(gè)接種點(diǎn)，每4 個(gè)接種點(diǎn)為一個(gè)樣本，共計(jì)3 個(gè)樣本，液氮速凍后置于–80 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

利用細(xì)菌總RNA 抽提試劑盒提取D. fangzhongdaiOnc5 菌株總RNA，參照cDNA 合成試劑盒自帶試劑說明書的使用方法，對cDNA 的第一鏈進(jìn)行生物合成。實(shí)時(shí)熒光定量PCR 反應(yīng)體系為20 μL：TransStart? Top Green qPCR SuperMix（+Dye I） 10 μL、cDNA 1 μL、F-Primer 0.4 μL、R-Primer 0.4 μL 和Nuclease-free water 8.2 μL。反應(yīng)條件為：94 ℃ 30 s；94 ℃ 5 s，60 ℃ 15 s，72 ℃ 10 s，42 個(gè)循環(huán)；在72 ℃ 時(shí)收集熒光信號。采用2-ΔΔCt 法計(jì)算目的基因的相對表達(dá)量。

1.3 數(shù)據(jù)處理

采用SPSS 19.0 軟件處理試驗(yàn)數(shù)據(jù)，采用Duncan 法進(jìn)行樣本間差異顯著性分析，Plt;0.01表示差異顯著。每組實(shí)驗(yàn)均重復(fù)3 次。使用OriginPro 8 軟件制圖表。

2 結(jié)果與分析

2.1 vfmE 基因的克隆與序列分析

如圖2 所示，在預(yù)期位置處出現(xiàn)單一條帶，且條帶清晰明亮。將該產(chǎn)物連接到pUCm-T 載體上克隆測序，經(jīng)序列比對分析，成功克隆D.fangzhongdai Onc5 vfmE 基因。對vfmE 基因序列分析后發(fā)現(xiàn)，該序列長564 bp，共編碼187 個(gè)氨基酸。通過Conserved Domain Search 對該基因的氨基酸序列進(jìn)行分析，顯示其具有1 個(gè)保守結(jié)構(gòu)域，該結(jié)構(gòu)域位于氨基酸序列的172～426 位置，為AraC-superfamily 結(jié)構(gòu)域（圖3），結(jié)果表明vfmE基因?qū)儆贏raC 轉(zhuǎn)錄激活蛋白家族成員。

與GenBank 中注冊的Dickeya 屬病原菌vfmE基因序列進(jìn)行比對，結(jié)果表明，D. fangzhongdaiOnc5 vfmE 與D. dadantii 3937、D. dianthicola16JP03、D. poaceiphila NCPPB 569、D. solaniCFBP5647、D. zeae EC2、D. chrysanthemi Ech1591和D. fangzhongdai DSM 101947 菌株的同源性分別為95.74%、94.86%、91.13%、96.93%、86.88%、89.18%和98.82%。

2.2 vfmE 蛋白理化性質(zhì)分析

蛋白質(zhì)的理化性質(zhì)是蛋白質(zhì)研究的基礎(chǔ)。用ExPASY 的在線軟件ProtParam 預(yù)測蛋白質(zhì)分子式為： C976H1528N278O280S9 ， 蛋白質(zhì)分子量為21.93 kDa，理論等電點(diǎn)（pI）為9.01，屬于堿性蛋白質(zhì)（gt;7）；不穩(wěn)定指數(shù)為59.65，屬于不穩(wěn)定蛋白（gt;40）。脂溶性指數(shù)為91.28，親水性平均系數(shù)為-0.397。氨基酸疏水性是氨基酸的一種基本性質(zhì)，疏水性氨基酸位于蛋白質(zhì)內(nèi)部，由于其疏水性的相互作用，故在保持蛋白質(zhì)三級結(jié)構(gòu)上起作用。vfmE 蛋白的氨基酸最大疏水位置為第47 位異亮氨酸，最大值為2.044，第150 位谷氨酸出現(xiàn)最小值–3.511（圖4），推測vfmE 蛋白為結(jié)構(gòu)不穩(wěn)定的親水性蛋白。

2.3 信號肽、跨膜區(qū)預(yù)測及亞細(xì)胞定位

TMMHM 預(yù)測結(jié)果表明，vfmE 蛋白不存在跨膜結(jié)構(gòu)域，不是跨膜蛋白（圖5A）。SignaIP-5.0預(yù)測結(jié)果顯示，vfmE 蛋白不存在信號肽，不是分泌蛋白（圖5B）。D. fangzhongdai Onc5 vfmE 蛋白亞細(xì)胞定位預(yù)測結(jié)果表明，vfmE 蛋白主要分布于細(xì)胞質(zhì)，周質(zhì)中也有少量分布。

2.4 vfmE 蛋白高級結(jié)構(gòu)預(yù)測與蛋白質(zhì)互作網(wǎng)絡(luò)分析

二級結(jié)構(gòu)預(yù)測結(jié)果顯示，vfmE 蛋白含有3 種二級結(jié)構(gòu)，其中α-螺旋區(qū)域有109 個(gè)氨基酸，占58.29%，延伸鏈區(qū)域有2 個(gè)氨基酸，占1.07%，無規(guī)則卷曲有76 個(gè)氨基酸，占40.64%。從蛋白質(zhì)整體結(jié)構(gòu)來看，α-螺旋和無規(guī)則卷曲是vfmE蛋白的主要結(jié)構(gòu)元件，分散于整條多肽鏈（圖6A）。本研究也對D. fangzhongdai Onc5 vfmE 蛋白三級結(jié)構(gòu)進(jìn)行預(yù)測（圖6B），三級結(jié)構(gòu)以C6CFY9.1.A （D. zeae Ech1591 菌株中AraC 家族轉(zhuǎn)錄因子）為模版進(jìn)行同源建模，同源建模中要求序列相似度大于30%[14]，本研究中序列相似度為96.26%，說明結(jié)果可靠。得到的三級結(jié)構(gòu)模型由α-螺旋和無規(guī)則卷曲組成，與二級結(jié)構(gòu)預(yù)測結(jié)果相同。為了揭示vfmE 基因編碼蛋白之間的關(guān)系，采用蛋白質(zhì)互作網(wǎng)絡(luò)數(shù)據(jù)庫（PPIs）進(jìn)行預(yù)測分析（圖6C）。結(jié)果顯示有10 個(gè)蛋白質(zhì)與vfmE 蛋白互作，即AraC 家族轉(zhuǎn)錄調(diào)控蛋白（ADM96899.1）、L-鼠李糖操縱子轉(zhuǎn)錄激活蛋白（ADM99315.1）、L-鼠李糖結(jié)合蛋白（rhaR 和rhaS）、2 個(gè)含AraC 結(jié)構(gòu)域的Rob 蛋白（Rightorigin-binding protein ）、2 個(gè)轉(zhuǎn)錄調(diào)控蛋白（ADN00015.1 和ADN00336.1）、與誘導(dǎo)劑l-阿拉伯糖互作的蛋白（araC）和DNA 結(jié)合轉(zhuǎn)錄調(diào)控因子（yqhC）。

2.5 vfmE 基因在D. fangzhongdai Onc5 中的表達(dá)分析

vfmE 在整個(gè)侵染過程中均持續(xù)高效表達(dá)，在接種的各個(gè)時(shí)間點(diǎn)的表達(dá)量均高于對照組。由圖7 可知，vfmE 在D. fangzhongdai Onc5 侵染文心蘭葉片和假鱗莖的過程中，其表達(dá)情況基本一致。在接種3 h 后表達(dá)量明顯上調(diào)；12 h 表達(dá)量達(dá)到最高；接種18 h 時(shí)后，表達(dá)量明顯下調(diào)且趨于穩(wěn)定?？梢?，vfmE 基因在侵染的不同階段均發(fā)揮著重要的作用。

3 討論

現(xiàn)有研究表明vfmE 基因與Dickeya 屬病原菌的新型群體感應(yīng)系統(tǒng)的調(diào)控有關(guān)[8， 10]，但是關(guān)于vfmE 基因分子特征的研究未見報(bào)道。本研究從文心蘭D. fangzhongdai Onc5 中克隆出vfmE 基因，利用生物信息學(xué)軟件對其理化性質(zhì)、功能等情況進(jìn)行預(yù)測分析。結(jié)果表明，文心蘭vfmE 基因全長564 bp，共編碼187 個(gè)氨基酸，且在氨基酸水平上與Dickeya 屬其他病原菌的同源性較高，均在86%以上，說明vfmE 基因在Dickeya 屬病原菌中高度保守。在親疏水性上，vfmE 蛋白是一種親水性蛋白，且該蛋白不具有信號肽序列，為不穩(wěn)定蛋白；在結(jié)構(gòu)上，vfmE 蛋白不具備跨膜區(qū)域的結(jié)構(gòu)，不屬于跨膜蛋白，主要定位在細(xì)胞質(zhì)，說明vfmE 蛋白主要在胞內(nèi)發(fā)揮作用。

vfmE 蛋白具有1 個(gè)保守結(jié)構(gòu)域，該結(jié)構(gòu)域位于氨基酸序列的172～426 位置，屬于AraC（aminoacid response and amino sugar catabolism）超家族成員。AraC 蛋白超家族廣泛存在于細(xì)菌中，參與碳代謝、應(yīng)激反應(yīng)，到細(xì)菌毒力和致病性的多種生命活動的的調(diào)節(jié)[17-18]。汪瑤等[19]研究發(fā)現(xiàn)，嗜水氣單胞菌（Aeromonas hydrophila）J-35 株AraC家族成員aetY 基因敲除后，細(xì)菌生物被膜形成能力和對斑馬魚的致病力均下降。ZHANG 等[20]將AraC 家族成員orf02889 基因敲除后，嗜水氣單胞菌LP-2 菌株表型改變，主要表現(xiàn)為生物膜形成能力和鐵載體產(chǎn)量上升，但對斑馬魚的致病力減弱。SAHEBI 等[21] 研究表明Erwinia amylovoraEaUMG3 菌株中yqhC 基因（AraC 家族成員）能夠影響毒力因子的產(chǎn)生，如鐵載體和胞外多糖amylovoran 的產(chǎn)生，且E. amylovora EaUMG3 突變體Δ yqhC 的運(yùn)動性及對梨的致病性均降低。以上研究表明，AraC 家族成員可能直接調(diào)控某些病原菌與毒力因子、生物被膜形成、運(yùn)動性相關(guān)的基因的表達(dá)。本研究通過RT-qPCR 技術(shù)檢測了D. fangzhongdai Onc5 在侵染文心蘭過程中vfmE基因的差異表達(dá)。結(jié)果顯示，vfmE 基因在侵染文心蘭葉片和假鱗莖的各個(gè)階段均有表達(dá)，其中在12 h 的表達(dá)量最高，說明vfmE 基因在侵染的不同階段均發(fā)揮著重要的作用，參與了對D. fangzhongdaiOnc5 的致病調(diào)控。

本研究克隆了D. fangzhongdai Onc5 中新型群體感應(yīng)系統(tǒng)vfm 中的關(guān)鍵調(diào)控基因vfmE，并進(jìn)行生物信息學(xué)分析及其在侵染文心蘭葉片過程中的差異表達(dá)進(jìn)行檢測，有助于進(jìn)一步揭示vfmE 基因的功能及其對Dickeya 屬病原菌致病性的調(diào)控機(jī)制。

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