澳洲堅果鋅指蛋白基因MiZFP11 響應干旱和高溫脅迫的功能分析

摘 要：CCCH 型鋅指蛋白在植物生長發(fā)育及響應逆境脅迫中發(fā)揮重要的調控作用。本研究以澳洲堅果JW 和桂熱1號品種為試驗材料，采用RT-PCR 技術獲得澳洲堅果鋅指蛋白基因MiZFP11，分析其編碼蛋白的結構特征和亞細胞定位，并利用實時熒光定量PCR 技術分析其在不同組織中以及干旱、高溫脅迫下的表達水平。RT-PCR 克隆結果表明，克隆獲得的澳洲堅果鋅指蛋白基因MiZFP11（GenBank 注冊號為MT332641），與CCCH 型鋅指蛋白基因較高同源。生物信息學分析表明，澳洲堅果MiZFP11 蛋白相對保守的C 端含有LCCL 結構域，屬于C3H13 亞類鋅指蛋白。蛋白基本性質分析表明，MiZFP11 蛋白是不穩(wěn)定的親水蛋白和非分泌非跨膜蛋白，且以絲氨酸磷酸化修飾為主。蛋白高級結構分析表明，MiZFP11 蛋白的二級和三級結構主要由無規(guī)則卷曲、α-螺旋和延伸鏈交錯組成。煙草葉片的瞬時表達和共聚焦顯微分析顯示，MiZFP11 蛋白定位于細胞核，與亞細胞定位預測結果一致。實時熒光定量PCR 分析表明，澳洲堅果JW 和桂熱1 號品種的MiZFP11 基因在葉片中的表達量最高，在根、小花和小果中也有較高的表達量，在莖中的表達量則最低。干旱脅迫1～36 h，葉片中的MiZFP11 基因在JW 品種中表現(xiàn)出“升-降-升-降”的表達模式，在桂熱1號品種中表現(xiàn)出“升-降”的表達模式，2 個品種整體上均受誘導上調表達。高溫脅迫1～36 h，葉片中的MiZFP11 基因在JW 和桂熱1 號品種中均表現(xiàn)出“升-降”的上調表達模式，且JW 品種的表達量明顯高于桂熱1 號品種。因此，MiZFP11基因在不同組織中均有顯著差異表達，且受干旱和高溫脅迫誘導后顯著上調表達，推測MiZFP11 基因在澳洲堅果組織生長發(fā)育，尤其在響應干旱和高溫脅迫中起重要作用。

關鍵詞：澳洲堅果；CCCH 型鋅指蛋白；干旱脅迫；高溫脅迫；功能分析

中圖分類號：664.9 文獻標志碼：A

澳洲堅果（Macadamia integrifolia）是山龍眼科（Proteaceae）澳洲堅果屬（Macadamia）名優(yōu)果樹，原產(chǎn)于澳洲亞熱帶雨林地區(qū)，享有“堅果之王”的美譽，中國的澳洲堅果種植面積居于全世界首位。由于全球干旱、高溫天氣頻繁及國內(nèi)主產(chǎn)區(qū)多為山地種植，水分和溫度成為影響澳洲堅果生長發(fā)育及穩(wěn)產(chǎn)、增產(chǎn)的關鍵因子[1]。鋅指蛋白（zinc finger protein，ZFP）是一類含有以鋅指結構域為特征的轉錄因子，在植物生長發(fā)育、逆境脅迫應答等方面起著重要的調控作用[2]。因此，挖掘澳洲堅果鋅指蛋白基因及功能驗證，為了解澳洲堅果的生長發(fā)育及干旱、高溫脅迫應答的分子基礎提供重要的科學理論依據(jù)。

鋅指蛋白是植物基因組中最為豐富的轉錄因子家族之一，通過保守殘基半胱氨酸（Cys）和組氨酸（His）與Zn2＋相結合，形成穩(wěn)定的手指結構域，在細胞生長與分化、基因表達調控、蛋白-蛋白互作等生命活動過程中起重要的作用[3]。依據(jù)手指結構域的半胱氨酸和組氨酸的數(shù)目與位置，可將鋅指蛋白分成C2H2、C2C2、C2HC、C3H（即CCCH）、C3HC4、C4HC3 等多個類型。其中，C2H2 型的成員在細胞內(nèi)的數(shù)目最多，在植物中的相關研究也最多，其相關功能也最為清楚，而CCCH 型的成員數(shù)目最少，在植物中的相關研究相對較少[4]。CCCH 型鋅指蛋白廣泛存在于動植物和微生物中。目前，在植物中，雖然已經(jīng)主要從模式植物全基因組中鑒定出CCCH 型鋅指蛋白成員，如從擬南芥和水稻中分別鑒定出68 個和67 個成員[5]，從毛果楊鑒定出91 個成員[6]，從番茄鑒定出80 個成員[7]，從馬鈴薯鑒定出50 個成員[8]。但是只有少數(shù)CCCH 型鋅指蛋白在植物研究中獲得功能驗證。綜合已有的CCCH 型鋅指蛋白基因的功能研究表明，CCCH 型鋅指蛋白基因在植物生長發(fā)育、種子萌發(fā)、葉片衰老、誘導開花等生育過程[9-11]，同時在響應鹽、干旱和高溫脅迫及病原菌侵染等生物或非生物脅迫中起著重要的調控作用[2， 12-14]。

CCCH 型鋅指蛋白基因在植物生長發(fā)育及響應逆境脅迫中發(fā)揮著重要的調控功能，但澳洲堅果CCCH 型鋅指蛋白基因的功能研究在國內(nèi)外還尚未報道。本研究以澳洲堅果JW 和桂熱1 號品種為試驗材料，克隆獲得CCCH 型鋅指蛋白基因MiZFP11，分析其編碼蛋白的結構特征和亞細胞定位， 并利用實時熒光定量PCR 技術分析MiZFP11 基因在不同組織器官中以及其在干旱、高溫脅迫下的表達水平，為深入研究CCCH 型鋅指蛋白基因在澳洲堅果生長發(fā)育和耐旱、耐熱下的分子機理提供科學依據(jù)，并為澳洲堅果耐旱、耐熱品種的遺傳選育提供優(yōu)異基因和技術指導。

1 材料與方法

1.1 材料

本研究采用的材料為澳洲堅果（Macadamiaintegrifolia）JW 和桂熱1 號品種，由廣西亞熱帶作物研究所提供與鑒定。JW 和桂熱1 號品種屬于國內(nèi)澳洲堅果主要栽培品種，JW 品種具有適應性強、耐高溫極強、抗旱性較好等特性；桂熱1 號品種具有對高溫敏感、抗旱性較差等特性。植物RNA 提取試劑盒、DNA 消化酶、熒光定量PCR試劑、反轉錄試劑盒、DNA 回收試劑盒、pMD20-T載體等生化試劑和試劑盒購于TaKaRa 公司。

1.2 方法

1.2.1 樣品處理、RNA 提取與cDNA 合成

組織表達分析樣品：以樹齡5～6 a 的澳洲堅果JW 和桂熱1 號品種嫁接苗為取樣試材，分別收集苗期的根、莖、葉和剛開放的小花、謝花后30～45 d 的小果。干旱和高溫脅迫表達分析樣品：將接穗苗齡6 m 的澳洲堅果JW 和桂熱1 號品種嫁接苗，用20%濃度的PEG 6000 干旱處理和42 ℃高溫處理，分別收集處理后1、3、6、12、24、36 h 的葉片樣品，以0 h 為試驗對照（CK），每個試驗重復3 次。采用蔡元保等[15]的CTAB 改良法提取與純化樣品的總RNA，并通過反轉錄試劑盒合成所有樣品的cDNA。

1.2.2 目的基因克隆

在本課題組澳洲堅果耐旱和耐高溫轉錄組測序的基礎上，根據(jù)基因表達差異的顯著性，篩選獲得MiZFP11 基因。通過同源序列比對，在該基因的編碼區(qū)外設計引物ZFP11-F 和ZFP11-R（表1），并由北京擎科生物科技公司合成引物。以澳洲堅果JW 和桂熱1 號品種葉片的cDNA 為模板，擴增包括編碼區(qū)在內(nèi)的MiZFP11 基因全長序列。利用DNA 回收試劑盒回收目的片段，連接到pMD20-T 載體上，并送至北京擎科生物科技公司進行測序。

1.2.3 生物信息學分析

基于 NCBI 數(shù)據(jù)庫和SMART 在線軟件（http：//smart.embl-heidelberg.de/）分析MiZFP11 蛋白的保守結構域。通過NCBI數(shù)據(jù)庫進行蛋白同源序列比對，并使用DNAMAN9.0 軟件進行蛋白序列的多重比對，構建同源蛋白的系統(tǒng)進化樹（自舉值為1000）。利用ProtParam（http：//web.expasy.org/protparam/）和NetPhos 3.1（https：//services.healthtech.dtu.dk/services/NetPhos-3.1/）在線軟件分別分析MiZFP11 蛋白的理化性質和磷酸化位點。使用PSORT （ http：//www.psort.org）、SignalP-5.0（http：//www.cbs.dtu.dk/services/SignalP/）和TMHMM 2.0（https：//services.healthtech.dtu.dk/services/TMHMM-2.0/）在線軟件分別預測MiZFP11 蛋白的亞細胞定位、信號肽和跨膜結構。采用SOPMA（http：//www.expasy.org）和SWISS-MODEL（http：//swissmodel.expasy.org/）在線軟件分別進行MiZFP11 蛋白的二級結構分析和三級結構的同源建模[16]。

1.2.4 亞細胞定位分析

將澳洲堅果 MiZFP11基因的CDS插入綠色熒光蛋白載體pBWA（V）HSGFP（武漢伯遠生物科技有限公司），構建含目的基因的融合表達載體pBWA（V）HS-MiZFP11-GFP。將空載體（對照）和融合表達載體通過電轉化法轉入農(nóng)桿菌（GV3101）感受態(tài)細胞。將OD600 約為0.6 的農(nóng)桿菌侵染液注射到煙草葉片下表皮內(nèi)，弱光培養(yǎng)48 h 后取樣，采用激光共聚焦熒光顯微鏡檢測葉片中熒光信號的分布情況。

1.2.5 組織和脅迫表達分析

以蘋果酸脫氫酶基因MDH 作為內(nèi)參基因[17-18]，設計MiZFP11 基因和內(nèi)參基因的熒光定量PCR 引物（表1）。以澳洲堅果JW 和桂熱1 號品種cDNA 為模板，利用熒光定量PCR 分析MiZFP11 基因在不同組織的表達水平，以及在干旱和高溫脅迫下葉片中的表達水平。實時熒光定量PCR 的反應體系（20 μL）：10 μL 2×SYBR Green qPCR Master Mix、1 μLcDNA 模板、上/下引物各1.0 μL，ddH2O 補足。反應程序：95 ℃預變性2 min；95 ℃變性10 s，58.0 ℃或61.5 ℃退火30 s，72 ℃延伸20 s，40個循環(huán)。所有RT-qPCR 實驗技術重復和樣品重復均為3 次。

1.3 數(shù)據(jù)處理

應用2–ΔΔCt 法分析MiZFP11 基因的相對表達量[19]，并使用SPSS 18.0 軟件分析表達量的差異顯著性。

2 結果與分析

2.1 MiZFP11 基因克隆

用澳洲堅果JW 和桂熱1 號品種的葉片cDNA作為PCR 模板，用全長引物克隆MiZFP11 基因的編碼區(qū)。結果表明（圖1），2 個品種的MiZFP11基因序列一致，cDNA 全長2817 bp，開放閱讀框ORF 為2436 bp，編碼811 個氨基酸。序列比對顯示，MiZFP11 基因與植物鋅指蛋白（ZFP）家族基因的核苷酸序列都有73%以上的相似性。因此，將該基因命名為MiZFP11，GenBank 登錄號為MT332641。

2.2 MiZFP11 蛋白的同源性比對

篩選出NCBI 數(shù)據(jù)庫同源性高的鋅指蛋白與MiZFP11 蛋白進行多序列同源比對。結果顯示（圖2），MiZFP11 蛋白與其他植物已知的CCCH 型鋅指蛋白具有極高的同源性，尤其是該家族的C3H13 亞類蛋白，如與蓮（Nelumbo nucifera）NnC3H13（XP_010272511.1）達到76.85%，與華蓋木（Magnolia sinica）MsC3H13（XP_058110946.1）達到73.71%，與胡楊（Populus euphratica）PeC3H13（XP_011010612.1）達到68.10%，與決明（Senna tora）StC3H13（KAF7820600.1）達到65.95%。而且，這些CCCH 型鋅指蛋白都含有鉀依賴鈉鈣交換體的特征序列和LCCL 結構域，尤其是蛋白C 端的氨基酸序列相對保守。

2.3 澳洲堅果 MiZFP11 蛋白的系統(tǒng)進化分析

為了明確不同植物間CCCH 型鋅指蛋白的系統(tǒng)進化關系，選擇26 個物種的代表性CCCH 型C3H13 亞類鋅指蛋白構建系統(tǒng)進化樹。結果顯示（圖3），MiZFP11 蛋白與CCCH 型鋅指蛋白的C3H13 亞類成員具有高度的同源性，所有C3H13亞類成員被明顯分成2 個組（Ⅰ和Ⅱ），其中Ⅰ組又分成3 個亞組（Ⅰ-1、Ⅰ-2 和Ⅰ-3），Ⅱ組又分成2 個亞組（Ⅱ-1 和Ⅱ-2），MiZFP11 蛋白被分在Ⅱ-2 亞組，與蓮NnC3H13（XP_010272511.1）和華蓋木MsC3H13（XP_058110946.1）的同源性最高，處于同一亞組，推測具有類似的結構和功能。

2.4 澳洲堅果 MiZFP11 蛋白的基本性質分析

MiZFP11 蛋白的基本理化特性分析結果表明，MiZFP11 蛋白的分子式為C4005H6390N1240O1306S28，分子量為93.706 kDa，總原子數(shù)是12 969，蛋白等電點為6.63，帶負電荷的殘基數(shù)（Asp+Glu）為150 個，帶正電荷的殘基數(shù)（Arg+Lys）為145個，不穩(wěn)定系數(shù)為49.07（gt;40，為不穩(wěn)定蛋白），平均親水性系數(shù)為–1.235（負數(shù)，為親水蛋白），因此推測MiZFP11 蛋白是不穩(wěn)定的親水蛋白。

采用NetPhos 3.1 軟件分析MiZFP11 蛋白的磷酸化位點顯示，該蛋白含有50 個絲氨酸Ser、36 個蘇氨酸Thr 和11 個酪氨酸Tyr，說明MiZFP11 蛋白發(fā)揮調控功能可能以絲氨酸磷酸化修飾為主。SignalP-5.0 和TMHMM 2.0 軟件分析顯示，MiZFP11 蛋白不存在信號肽和跨膜結構，為非分泌非跨膜蛋白。

2.5 澳洲堅果 MiZFP11 蛋白的高級結構分析

利用SOPMA 在線軟件分析MiZFP11 蛋白二級結構的結果顯示（圖4），MiZFP11 蛋白的二級結構由58.20%的無規(guī)則卷曲（主要集中在蛋白的N 端）、26.76%的α-螺旋、10.97%的延伸鏈和4.07%的β-轉角組成。以蛋白質數(shù)據(jù)庫中巴西橡膠樹（ Hevea brasiliensis ）CCCH 型鋅指蛋白（ A0A6A6K2X0.1.A ） 為模板， 通過SWISSMODEL網(wǎng)站預測MiZFP11 蛋白的三維立體結構。三級結構的同源建模分析顯示（圖5），MiZFP11 蛋白與模板蛋白質具有70.47%的高度序列相似性，GMQE 值為0.51，該蛋白主要由無規(guī)則卷曲、α-螺旋和延伸鏈交錯組成?？梢?，MiZFP11 蛋白三級結構預測與二級結構的分析結果基本一致。

2.6 MiZFP11 蛋白的亞細胞定位分析

通過PSORT 軟件的預測分析表明，澳洲堅果MiZFP11 蛋白定位在細胞核高達82.6%中的概率。為進一步驗證亞細胞定位的預測結果，將空載體pBWA（V）HS-GFP 和融合表達載體pBWA（V）HSMiZFP11-GFP，分別轉入農(nóng)桿菌GV3101 后注射到煙草葉片下表皮進行瞬時表達分析。激光共聚焦熒光顯微鏡檢測結果顯示（圖6），注射空載體的煙草整個表皮細胞均分布很強的綠色熒光信號，而注射融合表達載體的煙草僅在細胞核中顯示綠色熒光信號，表明澳洲堅果MiZFP11 蛋白定位在細胞核，與預測結果一致，具有核蛋白的功能作用。

2.7 MiZFP11 基因的組織表達分析

采用實時熒光定量PCR， 分析澳洲堅果MiZFP11 基因在JW 和桂熱1 號品種不同器官組織中的表達水平。結果顯示（圖7），在澳洲堅果JW 和桂熱1 號品種中，MiZFP11 基因在根、莖、葉、小花、小果等器官組織中均有不同程度的表達，其表達量差異顯著，其中葉片中的表達量最高，顯著高于其他組織，在根、小花和小果中也有較高的表達，在莖中的表達量則最低。

2.8 MiZFP11 基因在干旱脅迫下的表達分析

采用實時熒光定量PCR分析MiZFP11 基因在干旱脅迫下的表達水平。結果顯示（圖8），MiZFP11 基因在JW 品種中受干旱脅迫1、3 h 后，在葉片中的表達量顯著上升，之后有所下降，在24 h 又達到最高峰，表現(xiàn)出“升-降-升-降”的上調表達模式；在桂熱1 號品種中受干旱脅迫后，該基因在葉片中的表達水平顯著上升，在12 h 達到最高峰，之后有所下降，表現(xiàn)出“升-降”的上調表達模式。

2.9 MiZFP11 基因在高溫脅迫下的表達分析

采用實時熒光定量PCR 分析澳洲堅果JW 和桂熱1 號品種的MiZFP11 基因在高溫脅迫下的表達水平。結果顯示（圖9），MiZFP11 基因受高溫脅迫誘導后的表達水平顯著上升，JW 和桂熱1號品種分別在24 h 和6 h 達到最高峰，之后表達量有所下降，且JW 品種在各處理時間點的表達量明顯高于桂熱1 號品種，2 個品種的表達情況均表現(xiàn)出“升-降”的上調表達模式。

3 討論

CCCH 型鋅指蛋白是一種真核生物中普遍存在的帶有鋅指結構域的轉錄調節(jié)因子，其中植物CCCH 型鋅指蛋白已被證實是一類具有識別、結合RNA 的蛋白[20-21]。目前，隨著全基因組測序技術的日益完善，植物CCCH 型鋅指蛋白基因家族在擬南芥、水稻、番茄、馬鈴薯、毛果楊等物種中被鑒定出來[2-3]。但是，植物CCCH 型鋅指蛋白功能的相關研究報道并不多，只有少部分的該家族成員獲得功能驗證。本研究獲得澳洲堅果CCCH 型鋅指蛋白基因MiZFP11，并與該家族的C3H13 亞類成員具有高度的蛋白同源性，可見，獲得的澳洲堅果MiZFP11 基因是植物CCCH 型C3H13 亞類鋅指蛋白的新成員。而且，26 個代表性C3H13 亞類鋅指蛋白可明顯被聚類成2 個系統(tǒng)進化分支，推測澳洲堅果MiZFP11 蛋白與其同一分支的高度同源蛋白具有類似的結構和功能。

蛋白質磷酸化研究對于了解蛋白結構功能具有重要的指導意義[22-23]。MiZFP11 蛋白主要是絲氨酸磷酸化修飾，說明MiZFP11 蛋白發(fā)揮調控功能中絲氨酸磷酸化起著重要的作用。CCCH 型鋅指蛋白普遍分布在植物細胞中的不同位置，其亞細胞定位也具有多樣性，但主要定位于細胞核，如水稻OsDOS 蛋白定位于細胞核[9]，擬南芥KHZ1 和KHZ2 蛋白也定位于細胞核[24]，側金盞花AaZFP3 蛋白主要定位于轉基因煙草和擬南芥的細胞質中[11]，蠟梅CpC3H3 蛋白具有核定位信號卻定位于轉基因擬南芥的細胞膜[13]。MiZFP11蛋白作為一個非分泌非跨膜的親水蛋白，定位于細胞核，具有核蛋白的功能作用。

CCCH 型鋅指蛋白的空間結構及蛋白序列相對保守。澳洲堅果MiZFP11 蛋白的高級結構主要由無規(guī)則卷曲、α-螺旋和延伸鏈組成，無規(guī)則卷曲主要集中在蛋白的N 端，尤其是具有功能結構域的保守C 端富含α-螺旋和延伸鏈，這對于穩(wěn)定MiZFP11 蛋白的空間結構和功能發(fā)揮具有重要作用。MiZFP11 蛋白的生物信息學分析結果，符合轉錄因子的特性。MiZFP11 蛋白作為鋅指類的轉錄因子，其分析結果為MiZFP11 蛋白行使生物學功能提供科學依據(jù)。

CCCH 型鋅指蛋白在植物生長發(fā)育、種子萌發(fā)、葉片衰老等方面發(fā)揮重要的調控作用[9-10]。而且，CCCH 型鋅指蛋白基因在植物不同器官組織中普遍表達，并參與其生長發(fā)育，如擬南芥的大部分該家族基因在根、葉、花序和種子中均有表達[5]，其中SOMNUS 基因調控種子萌發(fā)[10]，AtC3H17 基因多向性影響其營養(yǎng)發(fā)育、開花和種子發(fā)育[25]；水稻OsDOS 基因參與延緩葉片衰老[9]；油菜BcMF30a 和BcMF30c 基因誘導轉基因擬南芥花粉敗育[26]。本研究澳洲堅果MiZFP11 基因在JW 和桂熱1 號品種的根、莖、葉、小花、小果等器官組織中都有顯著差異表達， 因此，MiZFP11 基因可能參與澳洲堅果不同器官組織的生長發(fā)育。

現(xiàn)有研究表明，植物CCCH 型鋅指蛋白基因在響應逆境脅迫中起著重要的調控作用，如水稻C3H12 基因通過JA 依賴途徑增強對白葉枯病的抗性[12]，通過ABA 信號轉導途徑陸地棉GhC3H20基因增強擬南芥的耐鹽性[14]，番茄SIC3H39 基因調控植株的耐寒性[27]；尤其在響應干旱脅迫方面起重要作用，如過表達OsC3H47 和OsTZF1 基因增強水稻的耐旱性[28-29]，蠟梅CpC3H3 基因的異源表達可以提高擬南芥的耐旱性[13]。本研究在干旱脅迫條件下，葉片中MiZFP11 基因在澳洲堅果JW 和桂熱1 號品種中均表現(xiàn)出顯著的上調表達；但其表達模式有所差異，可能與這2 個品種抗旱性差異有關?？梢?，CCCH 型鋅指蛋白MiZFP11 可能作為正調控因子，參與澳洲堅果響應干旱脅迫過程。

此外，CCCH 型鋅指蛋白基因在響應高溫脅迫中也起著重要的調控作用，如火龍果HuTZF3基因的異源表達可以提高擬南芥的耐熱性[30]。本研究在高溫脅迫下，葉片中MiZFP11 基因在澳洲堅果JW 和桂熱1 號品種中均表現(xiàn)出顯著的上調表達模式，且JW 品種在各高溫處理時間點的表達量明顯高于桂熱1 號。在田間表現(xiàn)上，JW 品種耐高溫極強，而桂熱1 號品種對高溫敏感，易導致夏季高溫天氣時嫩葉和嫩稍嚴重黃化。MiZFP11 基因在這2 個品種的表達特性差異可能與它們對高溫脅迫的敏感性有關，有助于解釋JW 品種的耐熱性強于桂熱1 號?？梢?，MiZFP11 蛋白可能作為正調控因子，參與澳洲堅果響應高溫脅迫反應。

綜上所述，本研究獲得1 個澳洲堅果CCCH型C3H13 亞類鋅指蛋白的新成員MiZFP11 蛋白，可能在澳洲堅果組織生長發(fā)育及響應干旱、高溫脅迫中起重要作用，為進一步研究該家族基因的耐旱和耐熱分子機理及澳洲堅果耐旱、耐熱品種選育提供科學理論依據(jù)。

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基金項目 國家自然科學基金項目（No. 32060652）；廣西科技計劃項目（桂農(nóng)科AB241484005）；廣西農(nóng)業(yè)科學院基本科研業(yè)務專項（桂農(nóng)科2021YT154）。